Method Article

Isolatie en verwerking van witte vetcellen bij muizen voor transcriptoom- en epigenoomanalyses

DOI:

10.3791/64128

⸱

June 16th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Van Andel Institute, 2Max Planck Institute of Immunobiology and Epigenetics, 3Department of General and Visceral Surgery, Medical Center-University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het huidige protocol vat een universele methode samen voor het isoleren, zuiveren en stroomopwaarts verwerken van witte vetcellen bij muizen, geoptimaliseerd voor stroomafwaartse totale RNA-sequencing, kernextractie door SONication (NEXSON) en ChIP-seq.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obesitas is een complexe ziekte die wordt beïnvloed door genetica, epigenetica, de omgeving en hun interacties. Rijpe vetcellen vertegenwoordigen het belangrijkste celtype in wit vetweefsel. Begrijpen hoe vetcellen functioneren en reageren op (epi)genetische en omgevingssignalen is essentieel voor het identificeren van de oorzaak(en) van obesitas. RNA en chromatine zijn eerder geïsoleerd uit adipocyten met behulp van enzymatische spijsvertering. Daarnaast zijn er protocollen ontwikkeld voor nucleaire isolatie, waarbij zuivering wordt bereikt door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) van adipocyt-specifieke transgene reporters. Een van de grootste uitdagingen bij het bereiken van een hoge opbrengst en kwaliteit tijdens dergelijke protocollen is de aanzienlijke hoeveelheid lipide in vetweefsel. Het huidige protocol beschrijft een geoptimaliseerde procedure voor het isoleren van rijpe vetcellen die gebruik maakt van heptaan om lipiden te scheiden van de doelen van belang (RNA/chromatine). Het resulterende RNA heeft een hoge integriteit en genereert RNA-seq-resultaten van hoge kwaliteit. Evenzo verbetert de procedure de opbrengstsnelheid van kernen en genereert het reproduceerbare ChIP-seq-resultaten over monsters heen. Daarom biedt de huidige studie een betrouwbaar en universeel protocol voor de isolatie van adipocyten bij muizen dat geschikt is voor transcriptoom- en epigenoomstudies van het hele genoom.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obesitas wordt doorgaans opgevat als een ziekte van overmatige vetophoping die bijdraagt aan een verhoogd risico op diabetes type 2, cardiometabole ziekten en verschillende vormen van kanker 1,2,3. Hoewel het huidige begrip van obesitas sterk geworteld is in genetica (uit zowel studies bij mensen als bij knaagdieren), is ongeveer 30%-70% van de aanleg voor stofwisselingsziekten niet-genetisch van oorsprong 4,5,6,7,8 en blijft slecht gedefinieerd.

Vetweefsel speelt een cruciale rol bij obesitas en andere stofwisselingsziekten 9,10. Vetweefsel bestaat uit rijpe vetcellen en de stromale vasculaire fractie, inclusief preadipocyten, endotheelcellen en immuuncellen. Het is nog steeds onduidelijk hoe elk celtype bijdraagt aan obesitas en hoe ontregeling van adipocyten bijdraagt aan obesitas. Reproduceerbare en effectieve isolatie- en zuiveringsprotocollen voor studies naar volwassen adipocytenepigenoom zijn van belang voor het veld.

Rijpe vetcellen zijn al lang geïsoleerd voor genexpressieanalyses11 en epigenoomstudies 12,13. Er zijn twee hoofdstrategieën voor het isoleren van adipocyten. De eerste is om enzymatische vertering te gebruiken om de rijpe vetcellen te scheiden van de rest van de celtypen in de stromale vasculaire fractie11,14. De tweede is om het vetweefsel op te douncen om intacte kernen vrij te maken en vervolgens de kernen te herstellen op basis van een fluorescerende reporter door middel van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS)12,13, waarvoor gespecialiseerde transgene reportermodellen nodig zijn. De technische uitdaging in elk geval is dat rijpe vetcellen hoge concentraties lipiden bevatten (Figuur 1), wat de kwaliteit en/of opbrengst van totaal RNA15,16 en kernen17 vermindert. Hier wordt een geoptimaliseerde enzymatische verteringsprocedure beschreven voor het isoleren van rijpe adipocyten, waarbij het voordeel van de heptaan is om lipiden snel en efficiënt op te lossen en te verwijderen18 voorafgaand aan RNA-extractie of de nuclei-isolatiestappen door Nuclei Extraction by SONication (NEXSON)19. Het protocol zorgt voor een uitstekend herstel en kwaliteit van het totale RNA voor genoombrede studies en verbetert de opbrengst van intacte kernen voor reproduceerbare ChIP-seq aanzienlijk.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierproeven zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), protocolnummer: 18-10-028. 12 weken oude mannelijke C57BL/6J-muizen werden geëuthanaseerd met CO2 en ontleed om de vetkussentjes van het epididymale witte vetweefsel (eWAT) te verzamelen.

1. Isolatie van adipocyten

  1. Bereid de digestiebuffer voor (tabel 1) en verwarm in een waterbad tot 37 °C.
  2. Doe het vetkussentje van het epididymale witte vetweefsel (eWAT) in een petrischaaltje. Snijd de tissue in kleine stukjes (5 mm x 5 mm) met behulp van een tang en een scalpel in 5 ml DMEM.
    OPMERKING: Een petrischaaltje dat geen celhechtingscoating bevat, heeft de voorkeur. Het is ook belangrijk om het vetkussentje voorzichtig vast te houden om beschadiging van de cellen te voorkomen. Hoe meer het vetweefsel wordt behandeld, hoe meer de opbrengst in het gedrang komt. Een scalpel/tang methode heeft de voorkeur boven het knippen van de vetkussentjes met een schaar of tang alleen, omdat deze de vetcellen kunnen beschadigen.
  3. Tap de overtollige DMEM af zonder de weefselresten te verstoren.
    NOTITIE: Pluk de tissueresten niet van het oppervlak van de petrischaal.
  4. Voeg 5 ml spijsverteringsbuffer toe aan de petrischaal, draai om weefselfragmenten uit de schaal te verwijderen en giet de volledige inhoud in een centrifugebuis van 50 ml. Herhaal het proces totdat alle weefselfragmenten zijn overgebracht naar de centrifugebuis.
  5. Voeg de resterende digestiebuffer toe aan de centrifugebuis zodat het uiteindelijke volume ~20 ml is.
  6. Incubeer de weefselfragmenten in een schudwaterbad van 37 °C bij 100 tpm gedurende 20-30 minuten, of totdat de weefselfragmenten kleiner zijn dan 1 mm x 1 mm.
  7. Voeg 0,4 ml 0,5 M EDTA en 0,2 ml 0,5 M EGTA toe aan de centrifugebuis en blijf schudden bij 37 °C gedurende 10 minuten.
  8. Breng de celsuspensie met een pipet van 10 ml over door een fijn matrixfilter (420 μm, zie materiaaltabel) bovenop een andere centrifugebuis van 50 ml om het onverteerde weefsel te verwijderen.
  9. Centrifugeer de centrifugebuis van 50 ml op 200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om zuivere vetcellen (drijvend op de bovenkant) te scheiden van de stromale vasculaire fractie (pellet op de bodem) (Figuur 2A).
  10. Giet de drijvende adipocytenlaag in een nieuwe buis van 50 ml en zorg ervoor dat de pellet niet wordt verstoord.
    OPMERKING: Vermijd het gebruik van pipetpunten om zwevende vetcellen over te brengen, omdat deze aan de wand van de pipetpunt kunnen blijven plakken (waardoor de opbrengst wordt verminderd). Een deel van de spijsverteringsbuffer wordt overgedragen naar de nieuwe buis; Gebruik een spuit en naald om achtergebleven spijsverteringsbuffer onder de adipocytenlaag vandaan te halen.
  11. Gebruik de gezuiverde vetcellen onmiddellijk voor totale RNA-extractie (stap 2.) en/of ChIP-seq (stap 3 en stap 4).
    OPMERKING: De gebruiker kan ervoor kiezen om het hele adipocytenextract te gebruiken voor stap 2. of stap 3., afhankelijk van het onderzoeksdoel. De gebruiker kan ook het volledige adipocytenextract in twee porties splitsen en doorgaan met stap 2. en stap 3. parallel om analyseresultaten te verkrijgen van de biologisch identieke monsters.

2. Totale RNA-extractie

OPMERKING: Voer deze stap uit in een chemische kap.

  1. Voeg RNA-isolatiereagens (1 ml) (zie materiaaltabel) toe aan de gezuiverde vetcellen in de centrifugebuis van 50 ml (stap 1.11.).
  2. Pipetteer op en neer met behulp van een pipetpunt van 1 ml om de vetcellen in het RNA-isolatiereagens grondig op te lossen en over te brengen naar een microcentrifugebuis van 2 ml.
  3. Incubeer de buis gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  4. Voeg 0,5 ml heptaan toe aan de centrifugebuis en draai gedurende 30 s op volle snelheid vooruit.
    OPMERKING: De lipiden lossen op in de heptaan (Figuur 2B).
  5. Centrifugeer de buis bij 1.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
  6. Verkrijg de onderste laag RNA-isolatiereagens met een spuit en een naald van 30 G en breng deze over in een nieuwe buis van 1,5 ml.
  7. Voeg 0,1 ml 1broom-3chloorpropaan (zie materiaaltabel) toe aan het RNA-isolatiereagensextract en vortex op volle snelheid gedurende 30 s. Incubeer de buis gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  8. Centrifugeer de buis bij 12.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C. Gebruik een pipet om de bovenste waterige fase op te vangen en over te brengen in een nieuwe buis.
  9. Voeg 0,5 ml isopropanol toe en incubeer gedurende 10 minuten bij 4 °C. Centrifugeer de buis bij 12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
    OPMERKING: Het RNA wordt als een pellet op de bodem van de buis neergeslagen.
  10. Gebruik een pipet om het supernatant te verwijderen en zorg ervoor dat u de pellet niet aanraakt.
  11. Voeg 1 ml 75% EtOH toe en draai kort op volle snelheid.
  12. Centrifugeer de buis bij 7.500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Verwijder het bovenstaande voorzichtig met een pipetpunt. Verstoor de pellet niet.
  13. Laat de pellet 10 minuten aan de lucht drogen bij kamertemperatuur of totdat de pellet helder/transparant wordt.
  14. Los de pellet op in 50 μL nucleasevrij water.

3. Fixatie van adipocyten voor ChIP-seq

OPMERKING: Voer stap 3 uit. in een chemische kap.

  1. Voeg 0,3 ml 0,5 ml EDTA, 0,2 ml 0,5 M EGTA, 14,8 ml DMEM en 10 ml heptaan toe aan de buis van 50 ml met geïsoleerde adipocyten (stap 1.11.).
  2. Voeg 0,7 ml 16% formaldehyde toe (uiteindelijke 0,7%) en draai op een buisrotator (zie materiaaltabel) bij 10 tpm gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Stel een timer in en tel gedurende 5 minuten. Als u meerdere monsters verwerkt, voeg dan achtereenvolgens formaldehyde toe met tussenpozen van 30 s om een nauwkeurige en vergelijkbare timing van fixatie in alle monsters mogelijk te maken.
  3. Voeg 1,78 ml 1,25 M glycine toe (eindstand 0,125 M) en meng op de rotator bij 10 tpm gedurende maximaal 5 minuten bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Formaldehyde blijft actief, zelfs na toevoeging van glycine. Daarom is het belangrijk om de lagen onmiddellijk na de incubatiestap van 5 minuten te scheiden door middel van centrifugatie (stap 3.4). Als er meer dan één monster is, voeg dan glycine toe aan elk monster om de reactie achtereenvolgens te stoppen in een tijdsinterval van 30 s.
  4. Centrifugeer vervolgens 5 minuten bij 200 x g bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Er moeten drie duidelijke en afzonderlijke vloeistoflagen zijn (Figuur 2C). De middelste witte laag bevat de gefixeerde vetcellen.
  5. Gebruik een pipetpunt van 1 ml om de adipocytlaag (wit) over te brengen naar een verse centrifugebuis van 15 ml, waardoor de hoeveelheid fixatief en heptaan die in de nieuwe buis wordt vervoerd, wordt geminimaliseerd.
  6. Vul de tube met 10 ml (kamertemperatuur) DMEM aangevuld met de proteaseremmercocktail (PIC, zie Materiaaltabel) tablet. Meng grondig door inversie.
  7. Centrifugeer de buis op ≤200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Houd de centrifugeerkracht op 100 x g om het barsten van de cellen te minimaliseren.
  8. Herhaal stap 3.5.-3.7. 1x voordat je verder gaat naar stap 3.9.
  9. Gebruik een pipetpunt van 1 ml om de adipocytenlaag (wit) over te brengen in een microcentrifugebuisje van 1,5 ml of 2 ml.
  10. Centrifugeer de buis op 100-200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en gebruik een pipetpunt van 1 ml om het heptaan (bovenste laag) en de DMEM (onderste laag) te verwijderen.
  11. Bewaar de gefixeerde vetcellen bij -80 °C gedurende maximaal 6 maanden tot gebruik.

4. Kernextractie en chromatineafschuiving

OPMERKING: Deze procedure is een bewerking van Arrigoni et al.19.

  1. Zet de sonicator aan (zie Materiaaltabel) en stel het piekvermogen in op 75 W, de inschakelduur op 2% en 200 cycli/burst, terwijl de waterbadkoeler is ingesteld op 20 °C.
  2. Voeg een proteaseremmercocktail (PIC) toe aan de Farnham-laboratoriumbuffer en de schuifbuffer (Tabel 1).
    OPMERKING: Bekijk nog een paar voorgestelde sonicators en parameters in Arrigoni et al.19.
  3. Resuspendeer de gefixeerde vetcellen (vanaf stap 3.) met 750-800 μL ijskoude Farnham-laboratoriumbuffer in een sonicatiebuis van 1 ml (zie materiaaltabel).
    NOTITIE: Het wordt aanbevolen om de buis niet tot de volledige capaciteit te vullen. Anders zullen de vetcellen naar het bovenste deel van de buis drijven, wat de sonicatie-efficiëntie vermindert.
  4. Sonificeer het monster gedurende 2,5 min.
    OPMERKING: Controleer de kernextractie op een fasecontrastmicroscoop om te bepalen of verdere sonicatie nodig is. De kernen moeten rond en intact zijn, zoals weergegeven in figuur 2D.
  5. Voordat u verder gaat, stelt u het piekvermogen van de sonicator in op 140 W, de inschakelduur op 5% en 200 cycli/burst, terwijl de waterbadkoeler op 4 °C staat.
  6. Gebruik een pipet om het bovenstaande over te brengen in een microcentrifugebuisje van 1,5 ml. Centrifugeer de buis bij 1.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
  7. Verwijder voorzichtig het bovenstaande uit de pellet (kernen) en bewaar de pellet.
  8. Was de pellet met 1 ml Farnham lab-buffer op ijs.
  9. Centrifugeer de buis 5 minuten bij 1.000 x g bij 4 °C, gebruik een pipet om het bovenstaande te verwijderen en bewaar de pellet.
  10. Herhaal stap 4.8.-4.9. 1x voordat je verder gaat naar stap 4.11.
    OPMERKING: De geïsoleerde en gewassen kernen kunnen 3 maanden bij -80 °C worden bewaard tot verder gebruik.
  11. Resuspendeer de geïsoleerde kernen in 1 ml schuifbuffer en breng ze over in een nieuwe sonicatiebuis van 1 ml. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de buis zitten.
  12. Sonificeer de kernen in de sonicator met een piekvermogen van 140 W, een inschakelduur van 5% en 200 cycli/burst gedurende 12 minuten om het chromatine bij 4 °C af te schuiven.
  13. Breng het lysaat over in een microfugebuisje van 1,5 ml.
    OPMERKING: Het afgeschoven chromatine komt vrij uit de kernen en bevindt zich in de buffer (lysaat).
  14. Centrifugeer de buis bij 10.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C om onoplosbaar vuil te pelleteren. Breng het bovenstaande (chromatine) over in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml.
  15. Het gesheared chromatine kan 10 dagen bij 4 °C of 3 maanden bij -80 °C worden bewaard tot verder gebruik.
    OPMERKING: Extra kwaliteitscontrole: Aliquot 25 μL van het geschoren chromatine om het RNA te decrosslinken en te verwijderen met een DNase-vrij RNase volgens het eerder gepubliceerde rapport19. Voor de huidige studie werd het resulterende DNA gezuiverd met een DNA-zuiveringskit volgens de instructies van de fabrikant, het DNA werd gekwantificeerd met een DNA-kwantificeringskit op het DNA-kwantificeringsinstrument en de fragmentgrootte werd geëvalueerd door het geautomatiseerde elektroforese-instrument (zie Materiaaltabel). De grootte van afgeschoven chromatine moet in het bereik van 100-800 bp liggen. De rest van het afschuifchromatine kan doorgaan voor downstream ChIP-Seq-toepassing.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vetcellen werden geïsoleerd uit zes vetkussentjes, de op heptaan gebaseerde RNA-extractie werd uitgevoerd (stap 2.) en het resulterende RNA werd geanalyseerd op het geautomatiseerde elektroforese-instrument. Het berekende RNA-integriteitsnummer (RIN) voor alle monsters was >8 (Figuur 3A), wat wijst op een hoogwaardig en reproduceerbaar RNA-preparaat. De totale RNA-voorbereidingskit werd vervolgens gebruikt om RNA-bibliotheken voor te bereiden, en elk monster werd gesequenced op de sequencer van de volgende generatie om een leesdiepte van ≥40 miljoen lezingen te bereiken. De Phred-score voor alle monsters (Figuur 3B) en per sequentie (Figuur 3C) was ≥30, wat wijst op hoogwaardige DNA-sequenties20. Verwijdering van heptaan ondersteunt dus de isolatie van RNA met een hoge opbrengst en hoge kwaliteit dat geschikt is voor RNA-sequencing.

In de formaldehydefixatiestap werden ook drie heptaanhoudende nucleaire isolatiepreparaten en één controlepreparaat zonder heptaan uitgevoerd. Het afgeschoven chromatine werd vervolgens geanalyseerd op het geautomatiseerde elektroforese-instrument. In beide gevallen werd het chromatine afgeschoven tot een groottebereik van 100-800 bp (Figuur 4A), ideaal voor stroomafwaartse ChIP-seq-procedures19. Belangrijk is dat ~5 keer meer chromatine werd verkregen uit de met heptaan behandelde monsters (11,5 ng/μL, 9,42 ng/μL en 9,6 ng/μL) in vergelijking met de onbehandelde monsters (2,2 ng/μL). H3K4me3 en H3K27me3 ChIP-seq werden uitgevoerd volgens Arrigoni et al.19. Zoals te zien is in figuur 4B, waren de signaalsporen van drie onafhankelijke met heptaan behandelde monsters vergelijkbaar met de baan van het met heptaan onbehandelde monster voor beide histonmarkeringen. Behandeling met heptaan heeft geen invloed op de kwaliteit van ChIP-seq, maar verbetert de opbrengst van kernen (en afgeschoven chromatine) aanzienlijk.

figure-results-1
Figuur 1: Geïsoleerde vetcellen. Geïsoleerde vetcellen werden gekleurd met DAPI (blauw) om de kern te kleuren en BODIPY (groen) voor de lipiden. De cytosolische lipidedruppels omvatten tot 95% van het volume van de vetcellen en vormen een technische uitdaging voor het bereiken van hoge opbrengsten tijdens RNA- en chromatine-extracties. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Schematisch verloop van de adipocytenisolatie voor transcriptoom- en epigenoomanalyse. De hele workflow wordt in beeld gebracht, van adipocytenisolatie tot transcriptoom of epigenoomtoepassing. De belangrijkste stappen en representatieve resultaten worden weergegeven. (A) De geïsoleerde vetcellen drijven op de bovenste laag en scheiden zich af van de stromale vasculaire fractie als een pellet op de bodem van de buis. (B) Het gebruik van heptaan om lipiden te verwijderen vóór RNA-extractie met RNA-isolatiereagens. (C) Het gebruik van heptaan om lipiden te verwijderen tijdens de fixatie van adipocyten. (D) Het representatieve beeld van geïsoleerde adipocytenkernen moet intact en rond zijn. Schaalbalk = 20 μm. De regeling is gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Representatief elektroferogram van RNA-integriteit en kwaliteitsscores na RNA-seq. (A) Monsters 1-6 vertegenwoordigen zes replicaten van met heptaan behandelde vetcellen, en hun RNA-integriteitsanalyse werd uitgevoerd op het geautomatiseerde elektroforese-instrument. Het RNA-integriteitsgetal (RIN) was gebaseerd op 18S en 28S ribosomale RNA-ratio's en geeft de RNA-kwaliteit weer. Schaal van 1 (veel gedegradeerd) tot 10 (het minst gedegradeerd). (B,C) De sequentiebepaling leeskwaliteitsscore werd bepaald door multiQC-analyse (B) voor de gemiddelde kwaliteitsscore op basen (C) en voor de kwaliteitsscore per sequentie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Representatief elektroferogram van afgeschoven chromatine en verrijkingspieken van ChIP-seq. (A) Representatieve profielen van het geautomatiseerde elektroforese-instrument met de chromatinegrootteverdelingen van de controle (monster 1, linksboven) en de met heptaan behandelde adipocytchromatinepreparaten (monsters 2, 5 en 8, rechtsboven en onderste twee). De chromatineconcentraties in de uiteindelijke preparaten worden linksboven in elk beeld aangegeven. (B) Screenshot van de genoombrowser gemaakt met behulp van de Integrative Genomics Viewer (IGV). Het bovenste deel van de grafiek toont H3K4me3 ChIP-seq-profielen voor drie (rode) met heptaan behandelde monsters en één (blauwe) controle. Het onderste paneel laat hetzelfde zien voor de ChIP-seq van H3K27me3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

BufferCompositie
Spijsverteringsbuffer (voor 3000 mg of minder vetkussen/ 20 ml)20 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)
0,3 g vetzuurvrij BSA
0,1 g collagenase type 2
De buffer van het laboratorium van Farnham5 mM LEIDINGEN (pH 8)
85 mM KCl
0,5% IGEPAL
Afschuiving buffer10 mM Tris-HCl pH 8
0,1% SDS
1 mM EDTA

Tabel 1: Samenstelling van de verschillende buffers die in deze studie zijn gebruikt.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het hier gepresenteerde protocol voor de isolatie van vetcellen is gebaseerd op algemeen aanvaarde enzymatische verteringsmethoden11,14 om rijpe vetcellen (zwevend) te scheiden van de resterende stromale vasculaire fractie van het witte vetweefsel. Het biedt een eenvoudige en universele benadering voor het zuiveren van rijpe vetcellen in elk muismodel. Zoals hierboven aangetoond, is het protocol geschikt voor downstream gebruik voor volledige transcriptoom- en ChIP-seq-analyses. Het biedt voldoende opbrengst om meerdere epigenomische profielen te genereren (bijv. verschillende histonmodificaties plus RNA-seq) van hetzelfde individuele vetkussentje.

Om de hoge opbrengsten te garanderen die de voorbereiding van dergelijke gematchte epigenoomgegevens mogelijk maken, is een cruciale stap het gebruik van heptaan om lipiden op te lossen uit de buurt van intacte vetcellen en uit vetcellen die tijdens het proces lyseren. Onze ervaring is dat deze stap de reproduceerbaarheid en opbrengst aanzienlijk verhoogt door te voorkomen dat RNA en kernen verloren gaan naar de lipidelaag. Continue rotatie van de buisjes met vetcellen die gefixeerd worden, is even belangrijk omdat het de homogeniteit verbetert waarmee de lipiden uit de vetcellen worden verwijderd. In plaats van de 1% formaldehydefixatiebuffer die in een groot deel van de ChIP-seq-literatuur wordt gerapporteerd21,22, werd vastgesteld dat het verlagen van de concentratie tot 0,7% formaldehyde noodzakelijk is om overmatige fixatie te voorkomen. De afschuiftijd van chromatine werd ook geoptimaliseerd tot 12 minuten om een optimaal chromatinegroottebereik (100-800 bp) voor ChIP-seq te bereiken.

Het protocol is geoptimaliseerd voor bulktranscriptoom- en epigenoomstudies. Het huidige protocol heeft nog steeds zijn eigen beperkingen voor single-cell transcriptoom- en epigenoomtoepassingen. Gezien de celheterogeniteit gerapporteerd in het adipositasveld23,24, zou deze isolatiemethode verder kunnen worden ontwikkeld om te worden aangepast voor eencellige testen. In dergelijke contexten kunnen adipocyt-beperkte markers zoals boor-dipyrrometheen (BODIPY)25 en perilipine-1 (PLIN1)26, ASC-127, of adipocyt-specifieke kernmarkers waardevol zijn om de kwantificering van aanvullende, functionele, relevante cellulaire parameters mogelijk te maken28. Afgezien van de toepassing op genomische studies, kan dit protocol ook de proteomische studies van adipocyten verbeteren, die een extra hindernis hebben vanwege het hoge lipidengehalte in adipocyten29.

Dit protocol kan ook worden gebruikt om met succes menselijke adipocytkernen te extraheren (gegevens niet weergegeven), waardoor de toepassing ervan wordt uitgebreid tot onderzoek naar obesitas bij de mens.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We zijn dank verschuldigd aan de MPI-IE optische beeldvorming, sequencing, bio-informaticakern en personeel. Dit werk werd ondersteund door financiering van de MPG, het Van Andel Research Institute, het Horizon 2020-onderzoek van de Europese Unie, NIH (R01HG012444 en R21HG011964), de Marie Skłodowska-Curie-subsidieovereenkomst nr. 675610 en het federale ministerie van Onderwijs en Onderzoek onder het projectnummer 01KU1216 (Deutsches Epigenom Programm, DEEP).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
16% Formaldehyde Solution (w/v). Methanol-freeThermoFisher SCIENTIFIC28908
1-bromo-3-chloropropane SIGMAB9673
5 M NaClinvitrogenAM9759
Automated electrophoresis instrument (2100 Bioanalyzer Instrument)Agilent TechnologiesG2939BA
BODIPY ThermoFisher SCIENTIFICD3922
Collagenase Type 2Worthington Biochemical Corp.43D14184B
Complete, EDTA-free, Protease inhibitor cocktail (PIC) Roche4693159001EDTA free
DAPI ThermoFisher SCIENTIFICD1306
DMEM (+ GlutaMAX) life technologies61965-026
DNA purification kit (PCR purification kit)Qiagen28104
DNA quantification instrument (Qubit 4 Fluorometer)Fisher SCIENTIFICQ33238
DNA quantification kit (DNA high sensitivity assay)Agilent Technologies5067-4626
EDTAFisher chimicalE478-500
EGTAFisher chimicalO2783-100
EtOHPHARMCO111000200
Fatty acid-free BSA SERVA11932.01bovine albumin fraction V, fatty acid-free lyophilized
GlycineSIGMAG7126-100G
HeptaneSIGMAH2198-1L
High Sensitivity RNA AnalysisAgilent Technologies5067-1513
IgepalSIGMA18896-50ML
KClSIGMAP3911-25G
Matrix filter (420um)Tisch ScientificME17238
Next-Generation Sequencer (HiSeq 3000 Sequencer) Illumina
Nuclease-free water Invitrogen4387936
PIPESACROS organics5625-37-6
Proteinase K ThermoFisher SCIENTIFICEO0491
RNA isolation reagent (Trizol)ThermoFisher SCIENTIFIC15596026
RNase A, DNase-free ThermoFisher SCIENTIFICEN0531
Rotator (Thermo Scientific Tube Revolver Rotator)ThermoFisher SCIENTIFIC88881001
SDS, Sodium dodecyl sulfateSIGMA8170341000
Sonication tube (1 mL milliTUBE with AFA Fiber)Covaris520135
Sonicator (Evolution Focused-ultra-sonicator (S220 or E220))Covaris500217 or 500239
Total RNA Prep kit ( Illumina Stranded Total RNA Prep kit)Illumina20040525
Tris-HCl Fisher bioreagentsBP153-500

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Current review of genetics of human obesity: From molecular mechanisms to an evolutionary perspective. Molecular Genetics and Genomics. 290 (4), 1191-1221 (2015).">Albuquerque, D., Stice, E., Rodríguez-López, R., Manco, L., Nóbrega, C. Current review of genetics of human obesity: From molecular mechanisms to an evolutionary perspective. Molecular Genetics and Genomics. 290 (4), 1191-1221 (2015).
  2. Childhood obesity: Increased risk for cardiometabolic disease and cancer in adulthood. Metabolism. 92, 147-152 (2019).">Weihrauch-Blüher, S., Schwarz, P., Klusmann, J. H. Childhood obesity: Increased risk for cardiometabolic disease and cancer in adulthood. Metabolism. 92, 147-152 (2019).
  3. Risk factors and implications of childhood obesity. Current Obesity Reports. 7 (4), 254-259 (2018).">Weihrauch-Blüher, S., Wiegand, S. Risk factors and implications of childhood obesity. Current Obesity Reports. 7 (4), 254-259 (2018).
  4. Epigenetics, the life-course and metabolic disease. Nature Reviews Endocrinology. 8 (2), 74-76 (2012).">Gluckman, P. D. Epigenetics, the life-course and metabolic disease. Nature Reviews Endocrinology. 8 (2), 74-76 (2012).
  5. Epigenetic disturbances in obesity and diabetes: Epidemiological and functional insights. Molecular Metabolism. 27, 33-41 (2019).">Loh, M., Zhou, L., Ng, H. K., Chambers, J. C. Epigenetic disturbances in obesity and diabetes: Epidemiological and functional insights. Molecular Metabolism. 27, 33-41 (2019).
  6. DNA methylation and obesity traits: An epigenome-wide association study. The REGICOR study. Epigenetics. 12 (10), 909-916 (2017).">Sayols-Baixeras, S., et al. DNA methylation and obesity traits: An epigenome-wide association study. The REGICOR study. Epigenetics. 12 (10), 909-916 (2017).
  7. The genetics of human obesity. Annals of the New York Academy of Sciences. 1281 (1), 178-190 (2013).">Xia, Q., Grant, S. F. A. The genetics of human obesity. Annals of the New York Academy of Sciences. 1281 (1), 178-190 (2013).
  8. Epigenetic dysregulation in pancreatic islets and pathogenesis of type 2 diabetes. Journal of Diabetes Investigation. 9 (3), 475-477 (2018).">Yokoi, N. Epigenetic dysregulation in pancreatic islets and pathogenesis of type 2 diabetes. Journal of Diabetes Investigation. 9 (3), 475-477 (2018).
  9. Obesity and metabolic disease: Is adipose tissue the culprit. Proceedings of the Nutrition Society. 64 (1), 7-13 (2005).">Frayn, K. N. Obesity and metabolic disease: Is adipose tissue the culprit. Proceedings of the Nutrition Society. 64 (1), 7-13 (2005).
  10. Adipose tissue inflammation and metabolic dysfunction in obesity. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 320 (3), 375-391 (2021).">Kawai, T., Autieri, M. V., Scalia, R. Adipose tissue inflammation and metabolic dysfunction in obesity. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 320 (3), 375-391 (2021).
  11. Hypertension: Methods and Protocols. Touyz, R. M., Schiffrin, E. L. , Springer. New York. 283-295 (2017).">Cat, A. N. D., Briones, A. M. Hypertension: Methods and Protocols. Touyz, R. M., Schiffrin, E. L. , Springer. New York. 283-295 (2017).
  12. Adipocyte nuclei captured from VAT and SAT. BMC Obesity. 3, 35(2016).">Ambati, S., et al. Adipocyte nuclei captured from VAT and SAT. BMC Obesity. 3, 35(2016).
  13. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).">Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
  14. Epigenetic and transcriptomic characterization of pure adipocyte fractions from obese pigs identifies candidate pathways controlling metabolism. Frontiers in Genetics. 10, 1268(2019).">Jacobsen, M. J., et al. Epigenetic and transcriptomic characterization of pure adipocyte fractions from obese pigs identifies candidate pathways controlling metabolism. Frontiers in Genetics. 10, 1268(2019).
  15. Extraction of total RNA from adipocytes. Hormone and Metabolic Research. 33 (4), 213-215 (2001).">Janke, J., Engeli, S., Gorzelniak, K., Sharma, A. M. Extraction of total RNA from adipocytes. Hormone and Metabolic Research. 33 (4), 213-215 (2001).
  16. Highly efficient method for isolation of total RNA from adipose tissue. BMC Research Notes. 6 (1), 472(2013).">Cirera, S. Highly efficient method for isolation of total RNA from adipose tissue. BMC Research Notes. 6 (1), 472(2013).
  17. Single cell analysis reveals immune cell-adipocyte crosstalk regulating the transcription of thermogenic adipocytes. eLife. 8, 49501(2019).">Rajbhandari, P., et al. Single cell analysis reveals immune cell-adipocyte crosstalk regulating the transcription of thermogenic adipocytes. eLife. 8, 49501(2019).
  18. Heptane as a less toxic option than hexane for the separation of vitamin E from food products using normal phase HPLC. RSC Advances. 3 (46), 24063-24068 (2013).">Buddrick, O., Jones, O. A. H., Morrison, P. D., Small, D. M. Heptane as a less toxic option than hexane for the separation of vitamin E from food products using normal phase HPLC. RSC Advances. 3 (46), 24063-24068 (2013).
  19. Standardizing chromatin research: A simple and universal method for ChIP-seq. Nucleic Acids Research. 44 (7), 67(2016).">Arrigoni, L., et al. Standardizing chromatin research: A simple and universal method for ChIP-seq. Nucleic Acids Research. 44 (7), 67(2016).
  20. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).">Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Käller, M. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).
  21. ChIP-seq: Using high-throughput sequencing to discover protein-DNA interactions. Methods. 48 (3), 240-248 (2009).">Schmidt, D., et al. ChIP-seq: Using high-throughput sequencing to discover protein-DNA interactions. Methods. 48 (3), 240-248 (2009).
  22. Formaldehyde crosslinking: A tool for the study of chromatin complexes. Journal of Biological Chemistry. 290 (44), 26404-26411 (2015).">Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: A tool for the study of chromatin complexes. Journal of Biological Chemistry. 290 (44), 26404-26411 (2015).
  23. Single cell approaches to address adipose tissue stromal cell heterogeneity. Biochemical Journal. 477 (3), 583-600 (2020).">Rondini, E. A., Granneman, J. G. Single cell approaches to address adipose tissue stromal cell heterogeneity. Biochemical Journal. 477 (3), 583-600 (2020).
  24. Cellular heterogeneity in adipose tissues. Annu Review of Physiology. 83, 257-278 (2021).">Corvera, S. Cellular heterogeneity in adipose tissues. Annu Review of Physiology. 83, 257-278 (2021).
  25. Heritability of fat accumulation in white adipocytes. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 307 (3), 335-344 (2014).">Katz, L. S., Geras-Raaka, E., Gershengorn, M. C. Heritability of fat accumulation in white adipocytes. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 307 (3), 335-344 (2014).
  26. Visualization of lipid directed dynamics of perilipin 1 in human primary adipocytes. Scientific Reports. 7 (1), 15011(2017).">Hansen, J. S., de Maré, S., Jones, H. A., Göransson, O., Lindkvist-Petersson, K. Visualization of lipid directed dynamics of perilipin 1 in human primary adipocytes. Scientific Reports. 7 (1), 15011(2017).
  27. ASC-1, PAT2, and P2RX5 are cell surface markers for white, beige, and brown adipocytes. Science Translational Medicine. 6 (247), (2014).">Ussar, S., et al. ASC-1, PAT2, and P2RX5 are cell surface markers for white, beige, and brown adipocytes. Science Translational Medicine. 6 (247), (2014).
  28. Identification and characterization of adipose surface epitopes. Biochemical Journal. 477 (13), 2509-2541 (2020).">Onogi, Y., Khalil, A. E. M. M., Ussar, S. Identification and characterization of adipose surface epitopes. Biochemical Journal. 477 (13), 2509-2541 (2020).
  29. Recent advances in proteomic studies of adipose tissues and adipocytes. International Journal of Molecular Sciences. 16 (3), 4581-4599 (2015).">Kim, E. Y., et al. Recent advances in proteomic studies of adipose tissues and adipocytes. International Journal of Molecular Sciences. 16 (3), 4581-4599 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

White Adipocyte IsolationMurine AdipocytesTranscriptome AnalysisEpigenome AnalysisAdipose TissueRNA IsolationChromatin IsolationNuclear IsolationFACS SortingChIP Seq
Video Coming Soon

Related Articles