Methodenartikel

Karakterisering van neuronale lysosoom interactoom met proximity labeling proteomics

DOI:

10.3791/64132

⸱

23 juni 2022

 ,  , 
1Department of Chemistry, The George Washington University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een neuronaal lysosoom proximity labeling proteomics protocol wordt hier beschreven om de dynamische lysosomale micro-omgeving in door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide neuronen te karakteriseren. Lysosomale membraaneiwitten en eiwitten die interageren met lysosomen (stabiel of tijdelijk) kunnen nauwkeurig worden gekwantificeerd in deze methode met een uitstekende intracellulaire ruimtelijke resolutie in levende menselijke neuronen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lysosomen communiceren vaak met een verscheidenheid aan biomoleculen om de afbraak en andere diverse cellulaire functies te bereiken. Lysosomen zijn van cruciaal belang voor de menselijke hersenfunctie, omdat neuronen postmitotisch zijn en sterk afhankelijk zijn van de autofagie-lysosoomroute om cellulaire homeostase te behouden. Ondanks de vooruitgang in het begrip van verschillende lysosomale functies, is het vastleggen van de zeer dynamische communicatie tussen lysosomen en andere cellulaire componenten technisch een uitdaging, vooral op een manier met een hoge doorvoer. Hier wordt een gedetailleerd protocol verstrekt voor de onlangs gepubliceerde endogene (knock-in) lysosoom proximity labeling proteomische methode in door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel (hiPSC) afgeleide neuronen.

Zowel lysosomale membraaneiwitten als eiwitten rond lysosomen binnen een straal van 10-20 nm kunnen met vertrouwen worden geïdentificeerd en nauwkeurig worden gekwantificeerd in levende menselijke neuronen. Elke stap van het protocol wordt in detail beschreven, d.w.z. hiPSC-neuroncultuur, nabijheidsetikettering, neuronoogst, fluorescentiemicroscopie, biotinylated eiwitverrijking, eiwitvertering, LC-MS-analyse en gegevensanalyse. Samenvattend biedt deze unieke endogene lysosomale proximity labeling proteomics-methode een high-throughput en robuust analytisch hulpmiddel om de zeer dynamische lysosomale activiteiten in levende menselijke neuronen te bestuderen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lysosomen zijn katabole organellen die macromoleculen afbreken via de lysosomale-autofagieroute1. Naast afbraak zijn lysosomen betrokken bij diverse cellulaire functies zoals signaaltransductie, nutriëntdetectie en secretie 2,3,4. Verstoringen in de lysosomale functie zijn betrokken bij lysosomale stapelingsstoornissen, kanker, veroudering en neurodegeneratie 3,5,6,7. Voor postmitotische en sterk gepolariseerde neuronen spelen lysosomen een cruciale rol bij neuronale cellulaire homeostase, afgifte van neurotransmitters en transport over lange afstand langs de axonen 8,9,10,11. Het onderzoeken van lysosomen in menselijke neuronen is echter een uitdagende taak geweest. Recente ontwikkelingen in geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC) -afgeleide neurontechnologieën hebben de cultuur van levende menselijke neuronen mogelijk gemaakt die voorheen ontoegankelijk waren, waardoor de kloof tussen diermodellen en menselijke patiënten werd overbrugd om het menselijk brein te bestuderen12,13. Met name de geavanceerde i3Neuron-technologie integreert stabiel de neurogenine-2 transcriptiefactor in het iPSC-genoom onder een doxycycline-induceerbare promotor, waardoor iPSC's in 2 weken differentiëren in pure corticale neuronen14,15.

Vanwege de zeer dynamische lysosomale activiteit is het vastleggen van lysosomale interacties met andere cellulaire componenten technisch een uitdaging, vooral op een manier met hoge doorvoer. Proximity labeling technologie is zeer geschikt om deze dynamische interacties te bestuderen vanwege het vermogen om zowel stabiele als transiënte / zwakke eiwitinteracties vast te leggen met uitzonderlijke ruimtelijke specificiteit16,17. Gemanipuleerde peroxidase of biotineligase kan genetisch worden gefuseerd met het aaseiwit. Na activering worden zeer reactieve biotineradicalen geproduceerd om naburige eiwitten covalent te labelen, die vervolgens kunnen worden verrijkt met streptavidin-gecoate kralen voor downstream bottom-up proteomics via vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS) platforms 17,18,19,20,21.

Een endogene lysosomale proximity labeling proteomics methode werd onlangs ontwikkeld om de dynamische lysosomale micro-omgeving vast te leggen in i3Neuronen22. Engineered ascorbate peroxidase (APEX2) werd ingeslagen op de C-terminus van het lysosomale geassocieerde membraaneiwit 1 (LAMP1) in iPSC's, dat vervolgens kan worden gedifferentieerd in corticale neuronen. LAMP1 is een overvloedig lysosomaal membraaneiwit en een klassieke lysosomale marker23. LAMP1 komt ook tot expressie in late endosomen, die uitgroeien tot lysosomen; deze late endosoom-lysosomen en niet-afbrekende lysosomen worden in dit protocol allemaal lysosomen genoemd. Deze endogene LAMP1-APEX-sonde, uitgedrukt op fysiologisch niveau, kan LAMP1-mislokalisatie en overexpressieartefacten verminderen. Honderden lysosomale membraaneiwitten en lysosomale interactoren kunnen worden geïdentificeerd en gekwantificeerd met een uitstekende ruimtelijke resolutie in levende menselijke neuronen.

Hier wordt een gedetailleerd protocol beschreven voor lysosoomtoetredingsetikettering van proteomics in menselijke iPSC-afgeleide neuronen met verdere verbeteringen ten opzichte van de onlangs gepubliceerde methode22. De algemene workflow wordt geïllustreerd in figuur 1. Het protocol omvat hiPSC-afgeleide neuroncultuur, nabijheidsetiketteringsactivering in neuronen, validatie van APEX-activiteit door fluorescentiemicroscopie, bepaling van een optimale streptavidin-kralen-tot-input-eiwitverhouding, verrijking van gebiotinyleerde eiwitten, eiwitvertering op kralen, peptide-ontzilting en kwantificering, LC-MS-analyse en proteomics-gegevensanalyse. Richtlijnen voor probleemoplossing en experimentele optimalisaties worden ook besproken om de kwaliteitscontrole en prestaties van proximity labeling te verbeteren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle procedures werden goedgekeurd door de bioveiligheids- en ethische commissie van de George Washington University. De samenstellingen van media en buffers die in dit protocol worden gebruikt, zijn weergegeven in tabel 1. De commerciële productinformatie die hier wordt gebruikt, wordt vermeld in de tabel met materialen.

1. Menselijke iPSC-afgeleide neuroncultuur

  1. Menselijke iPSC-cultuur en LAMP1-APEX probe integratie (7 dagen)
    1. Ontdooi matrigel stockoplossing in een ijsemmer bij 4 °C 's nachts, aliquot 500 μL van de oplossing in koude steriele buizen en bewaar de aliquots bij −80 °C. Bereid 50 ml coatingoplossing door 500 μL van de Matrigel-bouillon toe te voegen aan 49,5 ml koud DMEM/F12-medium.
      OPMERKING: Houd de Matrigel koud en gebruik voorgechilleerde conische buizen en pipetpunten om polymerisatie te voorkomen. Coatingoplossing kan gedurende 2 weken bij 4 °C worden bewaard.
    2. Bekleed een celkweekschaal van 10 cm met 4 ml coatingoplossing gedurende 1 uur in een incubator van 37 °C.
      OPMERKING: Vitronectin kan een alternatieve coatingoplossing zijn bij een concentratie van 5 μg/ml en een coating van 2 uur voor iPSC-kweek. Vitronectine (enkele eiwitcomponent) is duurder dan Matrigel, maar heeft minder batchvariaties en schonere achtergrondsignalen dan Matrigel, dat wordt geëxtraheerd uit muizentumoren met tal van extracellulaire matrixeiwitten. Niet-behandelde weefselkweekplaat is nodig voor vitronectine coating. Matrigel coating werkt voor zowel behandelde als niet-behandelde weefselkweekplaten.
    3. Ontdooi en plaat 1-3 miljoen hiPSC's op elke gecoate schotel van 10 cm vooraf geladen met 8 ml Essential E8 compleet medium aangevuld met ROCK-remmer (eindconcentratie 10 μM Y-27632 of 50 nM Chroman1).
      OPMERKING: Het toevoegen van ROCK-remmer (Y-27632 of Chroman1) aan het stamcelkweekmedium minimaliseert dissociatie-geïnduceerde apoptose na splitsing en cryogene conservering. Chroman1 is onlangs krachtiger gebleken dan Y-27632 bij het remmen van zowel ROCK1 als ROCK224.
    4. Verander naar 10 ml E8 compleet medium zonder ROCK-remmer nadat de iPSC's kolonies hebben gevormd, meestal na 1-2 dagen. Behoud de iPSC-cultuur in E8 compleet medium en vervang het supernatant om de dag door vers medium.
    5. Integreer het proximity labeling enzyme, engineered ascorbate peroxidase (APEX2), in de C-terminus van het endogene LAMP1 gen door CRISPR genome engineering. Voor gedetailleerde stappen om een gemanipuleerde stabiele cellijn te genereren, raadpleegt u de eerder gepubliceerde methode (Frankenfield et al). 22.
  2. Humane iPSC-neuron differentiatie (3 dagen)
    1. Bekleed een celkweekschaal van 10 cm 's nachts met 4 ml Matrigel-coatingoplossing in een incubator van 37 °C voordat u gaat differentiëren.
    2. Handhaaf hiPSC's tot ~70% samenvloeiing. Was de hiPSC's voorzichtig met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) 2x om dode cellen te verwijderen. Aspirateer de PBS en voeg 3 ml Accutase toe aan de schaal van 10 cm cellen. Schud de plaat voor een gelijkmatige verdeling en incubeer gedurende 8 minuten in een incubator van 37 °C.
    3. Voeg 2 ml PBS toe om de cellen van de plaat te wassen en op te tillen en verzamel alle celoplossing in een conische buis van 15 ml. Pelleteer de cellen door centrifugeren bij 300 × g gedurende 5 minuten. Plaat 2-4 × 106 hiPSC's op een matrigel-gecoate plaat vooraf geladen met 8 ml warm neuron inductiemedium (tabel 1). Verdeel de cellen gelijkmatig en plaats ze in een incubator van 37 °C.
      OPMERKING: Neurondifferentiatie wordt aangedreven door een doxycycline-induceerbare transcriptiefactor, neurogenine-2 (NGN2), die overexpressie vertoonde in deze stabiele hiPSC-cellijn15.
    4. Was hiPSC's voorzichtig met PBS op dag 1 van de differentiatie om dode celresten te verwijderen. Vervang door 10 ml warm inductiemedium zonder ROCK-remmer.
    5. Verander elke dag met warm inductiemedium zonder ROCK-remmer tot dag 3 van differentiatie.
      OPMERKING: Neuronen zijn klaar om opnieuw te worden geplateerd in neuronaal medium.
  3. Plating neuronen en behoud van neuroncultuur (10 dagen)
    1. Bereid 0,1 mg/ml poly-l-ornithine(PLO)-coatingoplossing in boraatbuffer (tabel 1).
    2. Bekleed een celkweekschaal met de PLO-coatingoplossing in een incubator van 37 °C gedurende ten minste 1 uur of een nacht voorafgaand aan de beplating van dag 3 neuronen. Was de schaal drie keer met 4 ml steriel water en laat deze volledig aan de lucht drogen in de bioveiligheidskast.
    3. Dissociëer dag 3 neuronen van elke schaal van 10 cm met 3 ml Accutase en leg 8-10 miljoen cellen op elke 10 cm PLO-gecoate schotel vooraf geladen met warm corticale neuronmedium (tabel 1).
    4. Voer elke 2-3 dagen een halve medium verandering uit met warm neuron medium totdat de i3Neuronen rijping bereiken in 2 weken na differentiatie.

2. In situ proximity labeling en neuronlysis (2 h)

  1. Bereid 500 mM biotine-fenol (BP) stamoplossing in dimethylsulfoxide (DMSO) en bewaar bij −20 °C. Verdun op de dag van de nabijheidsetikettering de BP-stamoplossing met een warm neuronmedium en behandel de neuronen in een eindconcentratie van 500 μM gedurende 30 minuten in een incubator van 37 °C.
    OPMERKING: Doxycycline wordt toegevoegd in het neuronmedium, dat de APEX-enzymexpressie activeert. Doxcycline moet ten minste 24 uur vóór het nabijheidsetiketteringsexperiment worden toegevoegd.
  2. Start de etiketteringsreactie door H2O2 in een eindconcentratie van 1 mM toe te voegen aan de neuroncultuur en incubeer gedurende precies 1 min. Zuig het medium onmiddellijk aan en spoel 3 keer met blusbuffer (tabel 1).
    OPMERKING: H2O2-oplossing moet vers worden gemaakt vóór de etiketteringsreactie. De H2O2-activering moet precies 1 minuut duren om experimentele variatie te verminderen en oxidatieve stress veroorzaakt door langdurige H2 O 2-behandelingte minimaliseren.
  3. Kantel de plaat om alle resterende buffer aan te zuigen. Voeg ijskoude cellysebuffer (tabel 1) rechtstreeks toe aan de neuronplaat. Gebruik 100 μL cellysebuffer per 1 miljoen neuronen. Draai de plaat rond voor voldoende cellyse en plaats op ijs.
  4. Schraap de cellysaten in koude buisjes van 1,5 ml. Soniceer in een ijskoud waterbad met behulp van een badsononicator (>100 W) gedurende 15 minuten met afwisselend 40 s aan, 20 s uit cycli.
    OPMERKING: Voldoende gelyseerde eiwitoplossing moet helder zijn zonder pellets of overmatige bubbels. Voldoende ultrasoonapparaat van cellysaat is cruciaal om nucleïnezuren af te schuiven en de kleverigheid van het cellysaat te verminderen om niet-specifieke binding in stroomafwaartse procedures te verminderen. Een sonde sonicator kan ook worden gebruikt om sterkere en snellere cellyse te bieden, maar het wassen van de sonde tussen monsters is vereist om kruisbesmetting en monsterverlies te minimaliseren.
  5. Voeg koud aceton (−20 °C) toe aan het monster met een 4-voudig volume lysisbuffer. Vortex kort en incubeer bij −20 °C gedurende 3 uur.
  6. Centrifugeer bij 16.500 × g gedurende 10 minuten bij 2 °C. Verwijder het supernatant zonder de eiwitkorrel te verstoren. Was de pellet met 1 ml -20 °C aceton 2x en verwijder het supernatant na centrifugatie.
  7. Droog de eiwitkorrel met een vacuümconcentrator gedurende 1 min. Voeg cellysisbuffer toe om de pellet volledig op te lossen. Soniceer kort indien nodig. Bewaar de monsters bij −80 °C.
    OPMERKING: Acetonprecipitatie kan residubiotine-fenol in het monster verwijderen, wat kan interfereren met downstream verrijking van gebiotinyleerde eiwitten.

3. Fluorescentiemicroscopie om APEX-lokalisatie en -activiteit te valideren (1,5 dag)

  1. Incubeer de i3neuronen die endogene LAMP1-APEX tot expressie brengen met 500 μM BP gedurende 30 minuten bij 37 °C. Activeer de etikettering met 1 mM H2O2 behandeling voor slechts 1 s om de diffusie van biotinewolk te beperken.
  2. Bevestig de cellen onmiddellijk met 4% paraformaldehyde in de blusbuffer en was 3x voorzichtig met PBS.
    OPMERKING: Voor een schaal van 10 cm is 4-6 ml nodig voor een voldoende wasbeurt.
  3. Blok en permeabiliseer de cellen met behulp van 3% ezelserum en 0,1% saponine in PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT).
  4. Incubeer de cellen met primair anti-LAMP1-antilichaam (muis monoklonaal H3A4, 1:1.000) 's nachts bij 4 °C.
  5. Was de neuronen 3 x voorzichtig met PBS. Incubeer de neuronen met anti-muis AF561 secundair antilichaam (1:1.000) en Streptavidin-680 (1:1.000) gedurende 1 uur bij RT.
  6. Was 2x met PBS en incubeer met Hoechst of 4',4-diamidino-2-fenylindole (DAPI) nucleaire marker gedurende 10 min bij RT. Spoel de cellen 2x af met PBS.
  7. Visualiseer de vaste neuronen onder een fluorescentiemicroscoop. Observeer gebiotinyleerde eiwitten gekleurd met streptavidin en gecolokaliseerd met LAMP1-kleuring buiten de kern om de juiste locatie van APEX-activiteit te valideren.

4. Bepalen van de streptavidin kralen-tot-input eiwitverhouding (1,5 dag)

  1. Voer detergent-compatible protein assay (DCA) uit om de totale eiwitconcentraties in cellysaten te bepalen
    1. Los runderserumalbumine (BSA) eiwitstandaard op in de cellysebuffer in een concentratie van 4 mg/ml. Bereid een reeks standaardoplossingen voor BSA-eiwitten (0,2-2 mg/ml, 5 verdunningen) met behulp van de cellysebuffer.
    2. Breng 5 μL van elk eiwitmonster, BSA-eiwitstandaardoplossing en blanco cellysebuffer in drievoud over in elke put in een 96-wellsplaat.
    3. Voeg 2 μL reagens S per 1 ml reagens A toe om reagens A te krijgen'. Voeg 25 μL reagens A' toe aan elk putje. Voeg 200 μL reagens B toe aan elk putje. Mix en pop bubbels indien aanwezig.
    4. Incubeer die 96-well plaat op RT gedurende 15 minuten, lees de absorptie bij 750 nm in een microplaatlezer en kwantificeer de concentraties van eiwitmonsters op basis van de BSA-standaardcurve.
  2. Beads titratie dot blot assay (1,5 dag)
    1. Breng een reeks streptavidin magnetische kralen slurry (20 μL, 15 μL, 12 μL, 10 μL, 8 μL, 4 μL, 1 μL, 0 μL) over naar PCR-stripbuizen. Zet de PCR stripbuizen op een magnetisch rek, was de kralen 3x met 100 μL 2% SDS buffer en verwijder de wasbuffer volledig terwijl je op het magnetische rek zit.
    2. Voeg 50 μg eiwitmonster toe aan elke buis. Voeg meer lysisbuffer toe tot een totaal volume van 80 μL. Sluit elke buis goed en draai een nacht op 4 °C.
    3. Centrifugeer de PCR-stripbuizen kort op een benchtop microcentrifuge. Plaats de PCR-stripbuizen gedurende 1 min op een magnetisch rek. Spot 2 μL supernatant uit elke buis op een droog nitrocellulosemembraan en laat het membraan volledig drogen.
      OPMERKING: Als de signaalintensiteit laag is, kan meer dan 2 μL op het membraan worden waargenomen. Het volume kan worden verhoogd door meerdere keren op dezelfde plek te spotten nadat het membraan tussen elke keer aan de lucht is gedroogd. Een Bio-Dot Apparaat kan ook worden gebruikt.
    4. Incubeer het membraan in blokkerende buffer (TBS) gedurende 1 uur. Incubeer het membraan in Streptavidin Alexa Fluor 680-geconjugeerd (1:1.000 in blokkerende buffer) gedurende 1 uur. Was vervolgens het membraan met TBS-T (tabel 1) 5x.
      OPMERKING: Een alternatief voor de dot blot assay is western blotting met behulp van een streptavidin-antilichaam.
    5. Meet het fluorescerende signaal van elke stip op het membraan onder een golflengte van 680 nm en genereer een scatter plot met fluorescerend signaal over het volume van kralen. Selecteer het optimale volume kralen dat nodig is voor 50 μg input-eiwitmonster op basis van waar het exponentiële verval van de curve eindigt .
      OPMERKING: Fluorescentie-intensiteit vertegenwoordigt de overvloed aan gebiotinyleerde eiwitten in het supernatant, die zou moeten afnemen met toenemende hoeveelheden kralen.

5. Verrijken van gebiotinyleerde eiwitten en on-beads spijsvertering (3 dagen)

  1. Breng eiwitlysaatmonsters over van −80 °C en soniceer de monsters in 1,5 ml buizen gedurende 30 s in een badsoonapparaat om de oplossingen snel te ontdooien. Vortex en plaats de monsterbuizen op ijs.
  2. Breng 250 μL streptavidin (SA) magnetische kralen slurry over naar elke buis van 1,5 ml. Zet de tubes op een magnetisch rek, was de kralen 3x met 1 ml Wash Buffer A (2% SDS) en verwijder de restbuffer.
  3. Bereken op basis van de resultaten van de dot blot assay en DC-eiwittest de hoeveelheid eiwitmonster (μg) die nodig is voor 250 μL van de streptavidin magnetische kralen slurry.
    OPMERKING: In deze endogene tot expressie gebrachte LAMP1-APEX-sonde is 5 μL kralen nodig voor 50 μg inputeiwit. Daarom wordt 2,5 mg totaal eiwit toegevoegd aan 250 μL kralen. Minder dan 250 μL SA-kralen mag worden gebruikt voor beperkt monstermateriaal.
  4. Voeg de cellysebuffer toe aan de buis die het magnetische kraal-lysaatmengsel bevat tot een totaal volume van 1 ml en draai een nacht bij 4 °C.
    OPMERKING: Monsters van verschillende groepen of replica's moeten worden genormaliseerd tot dezelfde eiwitconcentratie, volume en hoeveelheid kralen om experimentele variaties te verminderen.
  5. Draai alle buizen kort af op een benchtop microcentrifuge en plaats de buizen gedurende 1 minuut op een magnetisch rek. Verwijder het supernatant terwijl u op het magnetische rek zit.
    OPMERKING: Het is van cruciaal belang om elke keer 1 minuut te wachten nadat u de monsterbuizen op het magnetische rek hebt geplaatst. Dit kan het verlies van kralen minimaliseren als gevolg van de onzichtbare kleine hoeveelheid kralen die nog steeds naar de magneet in de oplossing bewegen.
  6. Was de kralen 2x met 1 ml washbuffer A op RT (telkens 5 minuten rotatie). Herhaal het proces met elke wasbuffer 2x achter elkaar bij 4 °C. (Buffer B, Buffer C en Buffer D; Tabel 1).
    OPMERKING: Een hoge concentratie SDS-oplossing kan neerslaan bij koude temperaturen. De eerste wasbeurt moet bij RT worden uitgevoerd.
  7. Plaats de buizen op het magnetische rek. Was de kralen 2x met Buffer D om resterend wasmiddel volledig te verwijderen. Resuspendeer de kralen in 100 μL van 50 mM Tris buffer en voeg 5 mM TCEP (eindconcentratie) toe om gedurende 30 minuten bij 37 °C in een temperatuurgecontroleerde mixer te incuberen, schuddend bij 1.200 tpm.
  8. Voeg 15 mM joodacetamide (IAZ, eindconcentratie) toe aan elke buis en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C in een temperatuurgecontroleerde mixer, schuddend bij 1.200 tpm in het donker (mixerdop aan).
    OPMERKING: IAA is lichtgevoelig en moet 5 minuten voor deze stap vers worden gemaakt.
  9. Voeg 5 mM TCEP (eindconcentratie) toe om overtollig IAZ te doven. Incubeer gedurende 10 minuten bij 37 °C in een temperatuurgestuurde mixer met schudden bij 1.200 tpm (mixerdop uit).
  10. Centrifugeer de monsterbuizen kort en plaats het gedurende 1 minuut op een magnetisch rek om het supernatant te verwijderen. Voeg 200 μL 5 mM TCEP toe in 50 mM Tris buffer om de kralen te resuspenderen. Voeg 1 μg Trypsin/Lys-C-mengsel toe aan het monster en incubeer gedurende 14 uur bij 37 °C in een temperatuurgecontroleerde menger, schuddend bij 1.200 tpm.
  11. Voeg een extra 0,2 μg Trypsin/Lys-C mix toe en verteer gedurende 3 uur.
  12. Draai de monsterbuizen kort naar beneden en plaats de buizen gedurende 1 minuut op een magnetisch rek. Breng het peptide-supernatant over om de buizen schoon te maken terwijl u op een magnetisch rek zit. Was de kralen met 50 μL van 50 mM Tris buffer (schudden gedurende 5 min) en combineer de peptide supernatanten.
  13. Voeg 30 μL 10% trifluorazijnzuur (TFA) toe aan de buis die peptide-supernatant bevat om een pH <3 te krijgen.

6. Peptide ontzilting en fractionering (2 h)

  1. Maak de omgekeerde fase vaste fase extractieplaat (alleen de putjes voor gebruik) nat met 200 μL HPLC-methanol (MeOH) 3x op het vacuümspruitstuk. Voeg 200 μL van 1% TFA toe aan HPLC-water 3x om de plaat in evenwicht te brengen.
  2. Laad de peptidemonsters in de plaat en schakel het vacuüm langzaam in voor een stroomsnelheid lager dan 3 druppels / s om monsterverlies te minimaliseren.
  3. Was de extractieplaat 3x met 200 μL van 1% TFA. Was de extractieplaat opnieuw met 200 μL van 1% TFA met 2% MeOH (v/v). Houd de stroomsnelheid lager dan 3 druppels/s.
  4. Vervang de opvangplaat door een 96-wells verzamelplaat. Als er geen fractionering nodig is, elueert u de peptidemonsters 3x met 100 μL 1% TFA met 80% MeOH en combineert u in een nieuwe monsterbuis. Droog de peptidemonsters in een vacuümconcentrator zonder warmte.
    OPMERKING: Als fractionering gewenst is, kunnen peptidemonsters vervolgens in 4 fracties worden geëlueerd met behulp van 200 μL van 1% TFA met respectievelijk 15%, 35%, 50% en 90% MeOH in een andere verzamelplaat.

7. Colorimetrische peptidekwantificeringstest (optioneel) (1 uur)

  1. Resuspend peptidemonsters in 50 μL water van LC-MS-kwaliteit en neem 20 μL aliquots om de peptide-assay uit te voeren.
    OPMERKING: Deze stap verbruikt een grote hoeveelheid peptidemonster, maar kan een nauwkeurige kwantificering van de peptideconcentratie bieden vóór LC-MS-analyse. Dit wordt meestal slechts één keer per monstertype uitgevoerd om te testen voordat het op grote schaal wordt voorbereid.
  2. Bereid seriële verdunningen van de peptidestandaardoplossingen (geleverd in de colorimetrische testkit) in het water van LC-MS-kwaliteit. Bereid het werkreagens door 50% reagens A, 48% reagens B en 2% reagens C te mengen.
  3. Breng 20 μL van elke peptidestandaardoplossing (drie replicaties) en het onbekende peptidemonster over in een 96-well microplaat. Voeg 180 μL van het werkreagens toe aan elk putje, meng goed en incubeer de plaat gedurende 30 minuten bij RT.
  4. Lees de absorptie bij 480 nm in een microplaatlezer en kwantificeer de concentraties van peptidemonsters op basis van de peptidestandaardcurve.

8. LC-MS analyse

  1. Resuspendeer de peptidemonsters in LC Buffer A (2% acetonitril en 0,1% mierenzuur, LC-MS-kwaliteit). Centrifugeer bij 16.500 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C om eventuele deeltjes te verwijderen.
  2. Breng het supernatant over in de injectieflacons met LC-MS. Analyseer de monsters met behulp van een nanoLC-MS-instrument.
    OPMERKING: Gedetailleerde LC-MS/MS-parameters zijn instrumentafhankelijk en zijn eerder beschreven 22,25,26.
  3. Genereer een aangepaste LC-MS-uitsluitingslijst met een reeks retentietijden voor zeer overvloedige peptidepieken van verontreinigingen, zoals streptavidin en trypsine met een massanauwkeurigheid van 5 ppm22 (bijv. gemeenschappelijke streptavidinpeptidepieken zijn m / z 402.5435 [lading 3], m / z 603.3117 [lading 2], m / z 654.9733 [lading 3], m / z 678.6812 [lading 3], m / z 1017.5182 [lading 2], enz.; veel voorkomende trypsinepeptidepieken zijn m/z 421.7584 [lading 2], m/z 523.2855 [lading 2], en m/z 737.7062 [lading 3]).

9. Proteomics data-analyse

  1. Analyseer de ruwe LC-MS-gegevens met proteomics-gegevensanalysesoftware zoals Proteome Discoverer, MaxQuant27 of MS-Fragger28. Inclusief twee FASTA-bibliotheken voor data-analyse: 1) een Referentiedatabase van Swissprot Homo Sapiens ; 2) een nieuw gegenereerde universele verontreiniging FASTA-bibliotheek (https://github.com/HaoGroup-ProtContLib), waarvan is bewezen dat het de identificatie van proteomics verbetert en valse ontdekkingen vermindert29.
  2. Stel de proteomics-gegevensanalyseparameters in met een 1% false discovery rate (FDR) cutoff voor eiwit- en peptide spectrale matching (PSM) -identificaties. Selecteer trypsinevertering met maximaal drie gemiste splitsingen, een vaste modificatie van cysteïnecarbiddomethylatie en een variabele modificatie van methionine-oxidatie en eiwit N-terminale acetylering. Gebruik peptide MS1 piekintensiteiten voor labelvrije kwantificering. Normaliseer de peptide-intensiteiten naar het endogene gebiotinyleerde carboxylase, propionyl-CoA carboxylase (PCCA), om variaties in nabijheidsetikettering te verminderen, zoals eerder beschreven22.
    OPMERKING: PCCA-normalisatie kan worden geselecteerd in Proteome Discoverer-software door een FASTA-bestand met PCCA-eiwitsequentie op te nemen. Als alternatief kan PCCA-normalisatie worden uitgevoerd in de downstream data-analyse.
  3. Exporteer resultaten op eiwitniveau van de proteomics-software. Verwijder contaminanteiwitten voorafgaand aan statistische analyse29. Verwijder eiwitten met slechts 1 PSM of geen kwantificeringsresultaat. Voer eiwitgenontologie (GO)-termanalyse uit met Enrichr30 en eiwitnetwerkanalyse met STRING31.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze lysosoom proximity labeling proteomics studie werd uitgevoerd in menselijke iPSC-afgeleide neuronen om de dynamische lysosomale micro-omgeving in situ in levende neuronen vast te leggen. Celmorfologieën van hiPSC's en hiPSC-afgeleide neuronen op verschillende tijdstippen worden geïllustreerd in figuur 2A. Menselijke iPSC's groeien in kolonies in E8-medium. Differentiatie wordt geïnitieerd door iPSC's te platen in doxycycline-bevattend neuroninductiemedium. Neurietextententen wo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van deze LAMP1-APEX-sonde worden eiwitten op en nabij het lysosomale membraan gebiotinyleerd en verrijkt. Gezien de typische lysosoomdiameter van 100-1.200 nm, biedt deze methode een uitstekende intracellulaire resolutie met een labelstraal van 10-20 nm. LAMP1 is een overvloedig lysosomaal membraaneiwit en een klassieke marker voor lysosomen, die dient als een uitstekend aaseiwit voor lysosomale APEX-etikettering op het endogene expressieniveau. Er zijn echter ook beperkingen bij het gebruik van LAMP1 om lysos...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie wordt ondersteund door de NIH-subsidie (R01NS121608). A.M.F. erkent de ARCS-Metro Washington Chapter Scholarship en de Bourbon F. Scribner Endowment Fellowship. We bedanken het Michael Ward-lab van het National Institute for Neurological Disorders and Stroke (NINDS) voor de ondersteuning van moleculaire biologie en de ontwikkeling van de i3Neuron-technologie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10% (w/v) Saponin solutionAcros Organics419231000Fluorescent Microscopy
AccutaseLife TechnologiesA1110501cell detachment solution, Cell Culture
B27 SupplementFisher Scientific17504044Cell Culture, Cortical Neuron Medium
BDNFPeproTech450-02Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Boric acidSigma-AldrichB6768Cell Culture, Borate Buffer
Bovine Serum AlbuminMillipore SigmaA8806To make standard solutions to measure total protein concentrations
Brainphys neuronal mediumSTEMCELL Technologies5790Cell Culture, Cortical Neuron Medium
CD45R (B220) Antibody Alexa Fluor 561Thermo Fisher Scientific505-0452-82Fluorescent Microscopy
Chroman1 ROCK inhibitorTocris716310Cell Culture
cOmplete mini Protease InhibitorRoche4693123001cocktail inhibitor in Lysis Buffer
DC Protein Assay Kit IIBio-Rad5000112To determine total protein concentrations of cell lysate
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD8418Proximity-labeling Reaction
DMEM/F12 mediumThermo Fisher Scientific11320082Cell Culture, Dish Coating
DMEM/F12 medium with HEPESThermo Fisher Scientific11330057Cell Culture, Induction Medium
Donkey serumSigma-AldrichD9663Fluorescent Microscopy
Doxycycline hyclate, ≥98% (HPLC)Sigma-AldrichD9891-1GCell Culture, Induction Medium
Essential 8 MediumThermo Fisher ScientificA1517001Cell Culture
Essential 8 Supplement (50x)Thermo Fisher ScientificA1517101Cell Culture
Extraction plate vacuum manifold kitWatersWAT097944For Peptide desalting
Formic Acid (FA)Fisher ScientificA11750For LC-MS analysis
GDNFPeproTech450-10Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Hoechst dyeThermo Fisher Scientific62239Fluorescent Microscopy
HPLC grade methanolFisher ScientificA452For Peptide desalting
HPLC grade waterFisher ScientificW5For Peptide desalting
Human induced pluripotent stem cellsCorriell InstituteGM25256Cell Culture
Hydrogen peroxide, ACS, 29-32% w/w aq. soln., stab.Thermo Fisher ScientificAA33323ADProximity-labeling Reaction
Iodoacetamide (IAA)Millipore SigmaI6125For Protein Digestion
LamininFisher Scientific23017015Cell Culture, Cortical Neuron Medium
LC-MS grade AcetonitrileFisher ScientificA955For LC-MS analysis
LC-MS grade waterFisher ScientificW64For LC-MS analysis
L-glutamineFisher Scientific25-030-081Cell Culture, Induction Medium
MatrigelThermo Fisher Scientific08-774-552basement membrane matrix, Cell Culture, Dish Coating
Mouse anti-human LAMP1 monoclonal antibodyDevelopmental Studies Hybridoma Bankh4a3Fluorescent Microscopy
N-2 Supplement (100x)Fisher Scientific17-502-048Cell Culture, Induction Medium
Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm, 7 x 8.5 cmBio-Rad1620145To conduct dot blot assay for bead titration
Non-essential amino acids (NEAA)Fisher Scientific11-140-050Cell Culture, Induction Medium
NT-3PeproTech450-03Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Oasis HLB 96-well solid phase extraction plateWaters186000309For Peptide desalting
Odyssey Blocking Buffer (TBS)LI-COR Biosciences927-50000To conduct dot blot assay for bead titration
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences15710Fluorescent Microscopy
Phenol Biotin (1,000x stock)Adipogen41994-02-9Proximity-labeling Reaction
Phosphate-buffered saline (PBS) without calcium or magnesiumGibco10010049Cell Culture, Proximity-labeling Reaction, Fluorescent Microscopy
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide AssayThermo Fisher23275Peptide Concentration Assay
Poly-L-Ornithine (PLO)Millipore SigmaP3655Cell Culture, Dish Coating
Sodium AscorbateSigma-AldrichA4034Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer
Sodium azideSigma-AldrichS8032Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer, Fluorescent Microscopy
Sodium chlorideThermo Fisher ScientificS271500Cell Culture, Borate Buffer
Sodium dodecyl sulfate (SDS)Thermo Fisher ScientificBP1311220Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer
Sodium hydroxideSigma-Aldrich415413Cell Culture, Borate Buffer
Sodium tetraborateSigma-Aldrich221732Cell Culture, Borate Buffer
SpeedVac concentratorvacuum concentrator
Streptavidin Magnetic Sepharose BeadsCytiva (formal GE)28-9857-99Enrich biotinylated proteins
Streptavidin, Alexa Fluor 680 ConjugateThermo Fisher ScientificS32358To conduct dot blot assay for bead titration
Thermomixertemperature-controlled mixer
Trifluoacetic acid (TFA)Millipore Sigma302031For Peptide desalting
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)Millipore SigmaC4706For Protein Digestion
Tris-HClThermo Fisher ScientificBP152500Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer
Triton-XThermo Fisher ScientificBP151500Beads wash buffer
TROLOXSigma-Aldrich648471Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec GradePromegaV5073For Protein Digestion
TWEEN

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. De Duve, C., Wattiaux, R. Functions of lysosomes. Annual Review of Physiology. 28 (1), 435-492 (1966).
  2. Ballabio, A., Bonifacino, J. S. Lysosomes as dynamic regulators of cell and organismal homeostasis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (2), 101-118 (2020).
  3. Lawrence, R. E., Zoncu, R. The lysosome as a cellular centre for signalling, metabolism and quality control. Nature Cell Biology. 21 (2), 133-142 (2019).
  4. Schröder, B. A., Wrocklage, C., Hasilik, A., Saftig, P. The proteome of lysosomes. Proteomics. 10 (22), 4053-4076 (2010).
  5. Lie, P. P. Y., Nixon, R. A. Lysosome trafficking and signaling in health and neurodegenerative diseases. Neurobiology of Disease. 122, 94-105 (2019).
  6. Leeman, D. S., et al. Lysosome activation clears aggregates and enhances quiescent neural stem cell activation during aging. Science. 359 (6381), 1277-1283 (2018).
  7. Wallings, R. L., Humble, S. W., Ward, M. E., Wade-Martins, R. Lysosomal dysfunction at the centre of Parkinson's disease and frontotemporal dementia/amyotrophic lateral sclerosis. Trends in Neurosciences. 42 (12), 899-912 (2019).
  8. Ferguson, S. M. Neuronal lysosomes. Neuroscience Letters. 697, 1-9 (2019).
  9. Rost, B. R., et al. Optogenetic acidification of synaptic vesicles and lysosomes. Nature Neuroscience. 18 (12), 1845-1852 (2015).
  10. Liao, Y. C., et al. RNA granules hitchhike on lysosomes for long-distance transport, using annexin A11 as a molecular tether. Cell. 179 (1), 147-164 (2019).
  11. Kuijpers, M., et al. Neuronal autophagy regulates presynaptic neurotransmission by controlling the axonal endoplasmic reticulum. Neuron. 109 (2), 299-313 (2021).
  12. Lu, J., et al. Generation of serotonin neurons from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 34 (1), 89-94 (2016).
  13. Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: The promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
  14. Wang, C., et al. Scalable production of iPSC-derived human neurons to identify tau-lowering compounds by high-content screening. Stem Cell Reports. 9 (4), 1221-1233 (2017).
  15. Fernandopulle, M. S., et al. Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 1-48 (2018).
  16. Sunbul, M., Andres, J. Proximity labeling: Methods and protocols. , Humana Press. (2019).
  17. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  18. Rhee, H. W., et al. Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging. Science. 339 (6125), 1328-1331 (2013).
  19. Lobingier, B. T., et al. An approach to spatiotemporally resolve protein interaction networks in living cells. Cell. 169 (2), 350-360 (2017).
  20. Paek, J., et al. Multidimensional tracking of GPCR signaling via peroxidase-catalyzed proximity labeling. Cell. 169 (2), 338-349 (2017).
  21. Fazal, F. M., et al. Atlas of subcellular RNA localization revealed by APEX-Seq. Cell. 178 (2), 473-490 (2019).
  22. Frankenfield, A. M., Fernandopulle, M. S., Hasan, S., Ward, M. E., Hao, L. Development and comparative evaluation of endolysosomal proximity labeling-based proteomic methods in human iPSC-derived neurons. Analytical Chemistry. 92 (23), 15437-15444 (2020).
  23. Li, J., Pfeffer, S. R. Lysosomal membrane glycoproteins bind cholesterol and contribute to lysosomal cholesterol export. eLife. 5, 21635(2016).
  24. Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nature Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
  25. Li, H., Frankenfield, A. M., Houston, R., Sekine, S., Hao, L. Thiol-cleavable biotin for chemical and enzymatic biotinylation and its application to mitochondrial TurboID proteomics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (9), 2358-2365 (2021).
  26. Li, H., et al. Integrated proteomic and metabolomic analyses of the mitochondrial neurodegenerative disease MELAS. Molecular Omics. 18 (3), 196-205 (2022).
  27. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  28. Kong, A. T., Leprevost, F. V., Avtonomov, D. M., Mellacheruvu, D., Nesvizhskii, A. I. MSFragger: Ultrafast and comprehensive peptide identification in mass spectrometry-based proteomics. Nature Methods. 14 (5), 513-520 (2017).
  29. Frankenfield, A. M., Ni, J., Ahmed, M., Hao, L. How do protein contaminants influence DDA and DIA proteomics. bioRxiv. , (2022).
  30. Kuleshov, M. V., et al. Enrichr: A comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update. Nucleic Acids Research. 44, 90-97 (2016).
  31. Szklarczyk, D., et al. STRING v11: Protein-protein association networks with increased coverage, supporting functional discovery in genome-wide experimental datasets. Nucleic Acids Research. 47, 607-613 (2019).
  32. Kissing, S., et al. Disruption of the vacuolar-type H+-ATPase complex in liver causes MTORC1-independent accumulation of autophagic vacuoles and lysosomes. Autophagy. 13 (4), 670-685 (2017).
  33. kleine Balderhaar, H. J., Ungermann, C. CORVET and HOPS tethering complexes - coordinators of endosome and lysosome fusion. Journal of Cell Science. 126 (6), 1307-1316 (2013).
  34. Zhang, M., Chen, L., Wang, S., Wang, T. Rab7: Roles in membrane trafficking and disease. Bioscience Reports. 29 (3), 193-209 (2009).
  35. Cheng, X. T., et al. Characterization of LAMP1-labeled nondegradative lysosomal and endocytic compartments in neurons. Journal of Cell Biology. 217 (9), 3127-3139 (2018).
  36. Eskelinen, E. -L. Roles of LAMP-1 and LAMP-2 in lysosome biogenesis and autophagy. Molecular Aspects of Medicine. 27 (5-6), 495-502 (2006).
  37. Sancak, Y., et al. Ragulator-rag complex targets mTORC1 to the lysosomal surface and is necessary for its activation by amino acids. Cell. 141 (2), 290-303 (2010).
  38. Abu-Remaileh, M., et al. Lysosomal metabolomics reveals V-ATPase- and mTOR-dependent regulation of amino acid efflux from lysosomes. Science. 358 (6364), 807-813 (2017).
  39. Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
  40. Tao, W. A., Aebersold, R. Advances in quantitative proteomics via stable isotope tagging and mass spectrometry. Current Opinion in Biotechnology. 14 (1), 110-118 (2003).
  41. Hao, L., et al. Quantitative proteomic analysis of a genetically induced prostate inflammation mouse model via custom 4-plex DiLeu isobaric labeling. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 316 (6), 1236-1243 (2019).
  42. Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).
  43. Qin, W., Cho, K. F., Cavanagh, P. E., Ting, A. Y. Deciphering molecular interactions by proximity labeling. Nature Methods. 18, 133-143 (2021).
  44. Go, C. D., et al. A proximity-dependent biotinylation map of a human cell. Nature. 595 (7865), 120-124 (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Proteomics analyseneuronale lysosomeniPSC afgeleide neuronenlysosomale membraaneiwittenbiotinyleerde eiwitverrijkingLC MS analysefluorescentiemicroscopieon beads digestie

Gerelateerde artikelen