Embryo-injectietechniek voor genbewerking in de zwartpootteek, Ixodes scapularis

Samenvatting

Het huidige protocol beschrijft een methode voor het injecteren van tekenembryo's. Embryo-injectie is de voorkeurstechniek voor genetische manipulatie om transgene lijnen te genereren.

Samenvatting

Teken kunnen verschillende virale, bacteriële en protozoaire pathogenen overbrengen en worden daarom beschouwd als vectoren van medisch en veterinair belang. Ondanks de groeiende last van door teken overgedragen ziekten, is het onderzoek naar teken achtergebleven bij insectenziektevectoren als gevolg van uitdagingen bij het toepassen van genetische transformatietools voor functionele studies op de unieke biologie van teken. Genetische interventies hebben aandacht gekregen om door muggen overgedragen ziekten te verminderen. De ontwikkeling van dergelijke interventies vereist echter een stabiele kiembaantransformatie door embryo's te injecteren. Een dergelijke embryo-injectietechniek ontbreekt voor cheliceraten, waaronder teken. Verschillende factoren, zoals een externe dikke waslaag op tekenembryo's, hard chorion en hoge intra-ovale druk, zijn enkele obstakels die eerder de ontwikkeling van embryo-injectieprotocollen bij teken verhinderden. Het huidige werk heeft deze obstakels overwonnen en een embryo-injectietechniek voor de zwartbenige teek, Ixodes scapularis, wordt hier beschreven. Deze techniek kan worden gebruikt om componenten, zoals CRISPR/Cas9, te leveren voor stabiele kiembaantransformaties.

Inleiding

Teken zijn vectoren van medisch en veterinair belang, die in staat zijn om een verscheidenheid aan virale, bacteriële, protozoaire pathogenen en nematoden over te brengen ^1,2. In het oosten van de Verenigde Staten is de zwartpootteek Ixodes scapularis een belangrijke vector van de ziekte van Lyme (LD), de spirocheet Borrelia burgdorferi. Meer dan 400.000 gevallen van LD worden elk jaar gemeld in de Verenigde Staten, waardoor het de top vector-overgedragen infectieziekte in de VS^{is 1}. Naast B. burgdorferi worden zes andere micro-organismen overgedragen door I. scapularis, waaronder vier bacteriën (Anaplasma phagocytophilum, B. mayonii, B. miyamotoi en Ehrlichia muris eauclarensis), één protozoaire parasiet (Babesia microti) en één virus (Powassan-virus), waardoor deze tekensoort een belangrijk probleem voor de volksgezondheid is³ . Hoewel door teken overgedragen ziekten de afgelopen jaren vaker voorkomen, is onderzoek naar teken achtergebleven bij andere geleedpotige vectoren, zoals muggen, vanwege de unieke biologie van teken en uitdagingen in verband met het toepassen van genetische en functionele genomische hulpmiddelen ^4,5.

Genbewerkingstechnieken, met name CRISPR/Cas9, hebben nu functionele genomicastudies mogelijk gemaakt in niet-modelorganismen. Voor het creëren van erfelijke mutaties in een organisme blijft embryo-injectie de voorkeursmethode voor het leveren van constructies voor het veranderen van de kiembaan 6,7,8,9. Tot voor kort^werden tekeneieren echter als te moeilijk of zelfs onmogelijk beschouwd om te injecteren zonder het embryo^{te doden 10,11}. Een dikke waslaag op eieren, hard chorion en hoge intra-ovale druk waren enkele van de belangrijkste obstakels die embryo-injectie bij teken verhinderden. Volwassen, met bloed gevoede I. scapularis zetten een enkele koppeling van maximaal 2.000 eieren¹² af gedurende 3-4 weken (ongeveer 100 eieren / dag). Eieren worden afzonderlijk gelegd en elk ei is bedekt met was die wordt afgescheiden door uitsteeksels of "hoorns" van het klierorgaan van Gené 13,14,15 van de moeder. Deze was beschermt de eieren tegen uitdroging en bevat antimicrobiële stoffen¹⁵. Om tekeneieren met succes te injecteren, is het belangrijk om de waslaag te verwijderen, het chorion te verzachten en de eieren uit te drogen om de intraovaldruk te verlagen, zodat de injectie het ei niet onomkeerbaar beschadigt. Inzicht in het kritieke belang van embryo-injecties voor succesvolle kiembaantransformatie, wordt een protocol voor I. scapularis ontwikkeld, dat kan worden gebruikt om een CRISPR / Cas9-construct af te leveren en stabiele kiembaanmutaties te genereren⁴. Naast de bijdrage aan het I. scapularis-onderzoek zou dit protocol ook geoptimaliseerd kunnen worden voor andere tekensoorten.

Protocol

Ixodes scapularis volwassenen werden ofwel gekocht van Oklahoma State University (OSU) of grootgebracht aan de Universiteit van Nevada, Reno (UNR) (IACUC protocol #21-001-1118).

1. Voorbereiding van vrouwelijke teken voor embryoverzameling

OPMERKING: Om eieren van de juiste leeftijd te verzamelen, is het belangrijk om het leggen van eieren te synchroniseren. Hoewel eierlegsignalen bij teken onduidelijk blijven, beginnen I. scapularis-vrouwtjes onder de standaard insectaire omstandigheden (temperatuur van 27 °C en >90% relatieve vochtigheid (RV)) ongeveer 8 dagen na de onthechting van de gastheer eieren te leggen. Deze tijdlijn kan worden verlengd door hervolle vrouwtjes bij 4 °C op te slaan. We hebben bloedgevoede vrouwtjes tot 8 weken bij 4 °C bewaard zonder enig negatief effect op het leggen van eieren. Deze voorwaarden moeten mogelijk voor elke insectarium worden gewijzigd.

1. Bewaar alle volle vrouwtjes bij 4 °C met >90% RV in een plastic doos van 6 kwart bekleed met vochtig filterpapier totdat ze worden gebruikt voor micro-injecties.
2. Breng de vrouwtjes een week vóór de injecties over van 4 °C naar een couveuse van 27 °C voor het starten van het leggen van eieren.
3. Wanneer de vrouwtjes beginnen met het leggen van eieren (3-4 dagen na het verplaatsen naar 27 ° C), verwijder dan alle eieren met een fijn getipte kwast en bereid de vrouwtjes voor op de ablatie van het orgaan (wasklier) van Gené.
   OPMERKING: Het orgaan van de Gené strekt zich uit van het gebied tussen het scutum en het capitulum (dorsale basis van de monddelen), monddelen buigen over het ventrale lichaamsoppervlak (parallel aan het oppervlak) en het orgaan van het verlengde gen bedekt eieren zodra de eieren zijn gelegd (figuur 1). Eieren die worden gelegd voordat het orgaan van de Gené wordt verwijderd of de was wordt geleegd, hebben een waslaag en zijn niet geschikt voor injecties en moeten worden weggegooid.
4. Om het gegane orgaan van de Gené te verwijderen of te legen, gebruikt u klei om het opgezwollen vrouwtje op een glazen dia onder een microscoop te plaatsen die zo is georiënteerd dat monddelen zichtbaar zijn aan zowel ventrale als dorsale zijden (figuur 1B, C).
   1. Prik het gebied precies tussen het scutum en de monddelen zorgvuldig met behulp van fijne tangen en wolfraamnaalden die in het laboratorium zijn gemaakt met behulp van wolfraamdraad volgens een eerder gepubliceerd protocol¹⁶ (naalden kunnen ook commercieel worden gekocht en bevestigd aan een micro-ontleedsonde, zie Materiaaltabel).
   2. Werk de weg naar binnen met de wolfraamnaald en trek de wasklier eruit (figuur 1D, E). Het kan enkele minuten duren om de klier te verwijderen. Veeg alle vloeibare wasafscheiding weg met behulp van laboratoriumdoekjes.
      OPMERKING: De klier kan ook worden verwijderd van de ventrale kant direct onder de monddelen; door met een naald en tang naar achteren te reiken richting scutum. Toepassing van siliconenlijm rond monddelen blokkeert ook de orgaaneversie van Gene en kan worden gebruikt in plaats van de was te verwijderen of te legen (persoonlijke communicatie met Dr. Ladislav Simo, INRAE, Frankrijk). Gezwollen teken blijven niet op dubbelzijdige tape. Het gebruik van klei om de teek te "inbakeren" helpt ze op hun plaats te houden tijdens manipulatie. Gebruik een tang om de teken- en wolfraamnaald vast te houden voor dissectie. Het ventrale deel is gemakkelijker te doorboren met een naald en heeft de voorkeur van de auteurs.
5. Om de klier te legen, rangschikt u de gravid tick zoals vermeld in stap 1.4. Prik het gebied achter de monddelen aan de dorsale kant voorzichtig door en oefen druk uit op de ventrale kant met behulp van een tang.
   OPMERKING: Als alternatief is het niet nodig om de wasklier te verwijderen; het legen van de klier van was zal enkele dagen duren. Eierleggende vrouwtjes hebben een wit gebied rond de monddelen dat de locatie van de wasklier aangeeft en kan als referentie worden gebruikt.
   1. Plaats de rand van een pluisvrij laboratoriumdoekje en verwijder de vloeibare was die uit de punctieplaats komt. Zorg ervoor dat hemolymferecretie wordt voorkomen, wat een heldere vloeistof is in vergelijking met licht gelige viskeuze was. Het kan 5-10 minuten duren voordat het grootste deel van de was is verwijderd.
6. Plaats na manipulatie de vrouwtjes in een couveuse bij 27 °C (>90% RV) en laat ze 1-2 dagen herstellen.
   OPMERKING: Behandelde vrouwtjes hebben meestal 1-2 dagen nodig om te herstellen en opnieuw eieren te leggen.
7. Wanneer de vrouwtjes weer eieren beginnen te leggen, gebruik dan een fijne verfkwast om vers gedeponeerde eieren te verzamelen (0-18 uur na het leggen van de eieren) en plaats ze in een microcentrifugebuis van 1,5 ml.
   OPMERKING: Als u eieren van hetzelfde vrouwtje in de loop van de tijd gebruikt, moet deze procedure worden herhaald na 4-5 dagen eieren leggen als de klieren niet zijn verwijderd.

2. Embryobehandeling voor micro-injecties

1. Voeg ~200 μL (of voldoende volume om de eieren te bedekken, afhankelijk van het aantal eieren) van 5% (gewicht/volume) benzalkoniumchloride/water (zie materiaaltabel) toe aan de buis met 0-18 uur oude eieren. Draai de eieren voorzichtig met de kwast gedurende 5 minuten om te voorkomen dat de eieren zich in de bodem van de buis nestelen (voor details, zie Sharma et ^al.4). Verwijder het supernatant met behulp van een micropipette en laat de eieren achter in de tube.
   LET OP: Benzalkoniumchloride is corrosief voor huid en ogen, draag handschoenen en oogbescherming.
2. Voeg ~200 μL gedestilleerd (DI) water toe aan de buis met eieren, draai met een penseel en verwijder het water uit de microcentrifugebuis met behulp van een micropipette. Herhaal het wassen met DI-water nog een keer.
3. Voeg na het wassen met DI-water ~200 μL van 5% (w/v) natriumchloride (NaCl) toe en draai voorzichtig met een kwast gedurende 5 min. Haal de oplossing na 5 min uit de tube en was de eieren twee keer met DI water.
4. Voeg ~100 μL 1% (g/v) NaCl-oplossing toe aan de microcentrifugebuis met eieren. Bewaar de eieren in 1% (w/v) NaCl-oplossing totdat ze worden gebruikt voor injecties.
5. Start micro-injecties na ongeveer een uur. Deze tijdlijn helpt bij een goede uitdroging van de eieren en voorkomt dat ze barsten.
   OPMERKING: Eieren kunnen gedurende 7-8 uur in 1% (w/v) NaCl-oplossing worden bewaard zonder de overleving aanzienlijk te beïnvloeden. Als de eieren moeilijk te injecteren of barsten zijn, zijn de eieren niet voldoende uitgedroogd en kunnen ze verder worden behandeld met 5% (w / v) NaCl gedurende nog eens 5 minuten.

3. Bereiding van injectienaalden

1. Steek een aluminosilicaat capillair glas (met filament, zie Materiaaltabel) in de naaldtrekker volgens de instructies van de fabrikant.
2. Stel de naaldtrekker in op de volgende instellingen: Warmte: 575, Trekkracht: 20, Snelheid: 50, tijd: 200 en Druk: 700.
3. Activeer de trekfunctie van de naaldtrekker en herhaal het proces voor extra naalden.
4. Bewaar de getrokken naalden door ze in lijnen van modelleerklei in een schone petrischaal te steken.
5. Laad de naald met het injectiemengsel met behulp van een microladerpunt (zie Materiaaltabel).
   OPMERKING: De vergelijking van naalden die worden gebruikt voor de injectie van teken- en muggenembryo's is weergegeven in figuur 2.

4. Dia-instelling voor de micro-injecties

1. Plak met dubbelzijdige tape twee glazen microscoopglaasjes aan elkaar, waardoor een opening van ongeveer 0,5 cm overblijft om het uitlijnen van eieren te ondersteunen en te voorkomen dat ze tijdens injecties omrollen (figuur 3A).
2. Breng een stuk transparant filmverband (zie Materiaaltabel) aan op de dubbelzijdige tape in de opening tussen de dia's. Zorg ervoor dat de film perfect op de opening wordt afgestemd.

5. Micro-injecties van embryo's

1. Lijn 8-10 eieren tegelijk uit op de dia-opstelling (hierboven) met behulp van een eenharige kwast.
   OPMERKING: Eieren die zijn uitgelijnd met de langere as loodrecht (figuur 3B) op de schuifrand zijn gemakkelijker te injecteren dan eieren waarvan de lengteas evenwijdig aan de rand is uitgelijnd (figuur 3C). Eieren in de loodrechte oriëntatie (figuur 3B) kunnen beter tegen injectie, wat resulteert in een hogere overleving.
2. Plaats de dia met uitgelijnde eieren op het podium van een samengestelde microscoop. Gebruik een stukje pluisvrij doekje om de 1% NaCl-oplossing waarin ze zijn opgeslagen te verwijderen.
3. Bevestig de gevulde injectienaald aan een micro-injector die is aangesloten op een micromanipulator (zie materiaaltabel).
4. Open de naald door deze voorzichtig tegen het eioppervlak te wrijven met een hogedrukinstelling op de micro-injector (>5.000 hPa).
5. Nadat de naald is geopend, verlaagt u de druk (1.000-2.500 hPa) van de micro-injector, afhankelijk van de opening van de naald.
   OPMERKING: Een kleine opening vereist een relatief hogere druk, terwijl een grotere opening een lagere druk vereist. Dit is om het volume van het geïnjecteerde construct te regelen. Afhankelijk van de grootte van de naaldopening, zal het injectievolume variëren van 1-5 ml.
6. Injecteer alle eieren zo snel mogelijk in een hoek van 10°-15° op de glijbaan en verplaats de glijbaan onmiddellijk naar omstandigheden met een hoge luchtvochtigheid in een petrischaaltje bekleed met vochtig papier. Zodra de eieren worden geïnjecteerd, beginnen ze uit te drogen.
   OPMERKING: Het injecteren van een klein aantal eieren per keer verhoogt het injectiesucces en de overlevingskans. Naalden raken verstopt door embryoreflux. Als de punt nog steeds scherp is, om verstopte naalden te verwijderen, verplaatst u de naald in een kleine druppel van 1% NaCl die aan de rand van de dia is toegevoegd. De capillaire werking zal de kleine klomp verdrijven. Als de naald al stomp is, vervang deze dan.

6. Verzorging van embryo's na injectie

1. Plaats de dia met geïnjecteerde embryo's in een grote petrischaal bekleed met vochtig filterpapier.
   OPMERKING: Het is van cruciaal belang om de eieren gedurende ten minste 5-6 uur niet te verstoren. Hierdoor kan de injectiewond goed worden afgesloten. De injectiewond kan zich openen wanneer het wordt geagiteerd en cytoplasma kan beginnen uit te sijpelen, wat resulteert in eisterfte.
2. Voeg na 5-6 uur een kleine druppel DI-water toe aan het transparante filmverband met geïnjecteerde embryo's eraan. Verplaats met een penseel voorzichtig de eieren. Breng de eieren over in een kleine petrischaal (10 cm) en dompel ze onder in DI-water.
   OPMERKING: Het filmverband maakt het gemakkelijk om eieren na injecties te verwijderen. Op het moment dat een waterdruppel aan het filmdressing wordt toegevoegd, beginnen de eieren mee te bewegen met het water.
3. Houd de eieren ondergedompeld in water en plaats de petrischaal in een plastic doos van 6 kwart in een broedmachine bij 27 °C en >90% RV.
4. Controleer de eieren regelmatig, dagelijks gedurende de eerste paar dagen en vervolgens om de 3-4 dagen totdat de larven beginnen uit te komen.
   OPMERKING: Als een groot aantal eieren wordt beschadigd tijdens micro-injecties, zal het voorzichtig afvoeren van het DI-water na een week schimmelgroei op de dode eieren voorkomen.
5. Wanneer de larven beginnen uit te komen uit de geïnjecteerde embryo's (21-25 dagen na injectie voor de huidige laboratoriumopstelling), controleert u ze dagelijks en brengt u eventuele uitgekomen larven over naar glazen injectieflacons met een scherm erop. Larven kunnen onder water uitkomen en ~ 1-2 weken overleven.
6. Screen de larven⁴ als de eieren zijn geïnjecteerd met een constructie die kan resulteren in een zichtbaar fenotype.

Resultaten

Een succesvol embryo-injectieprotocol voor I. scapularis wordt in dit artikel beschreven. Eierleggende vrouwtjes werden op een hoge luchtvochtigheid gehouden om uitdroging van gedeeltelijk gewaxte eieren te voorkomen. De waslaag werd verwijderd om tekenembryo's te injecteren door het orgaan van het gen (wasklier) van het gravid vrouwtje te aborteren (figuur 1A-E). We gebruikten aluminosilicaatglasnaalden met een kortere hals (fi...

Discussie

Dit is het eerste protocol dat is ontwikkeld om vroege tekenembryo's met succes te injecteren. Een overlevingspercentage van ~ 4% -8% is bereikt, wat vergelijkbaar is met embryo-injectie in andere gevestigde insectenmodellen⁵.

Aangezien dit het initiële protocol is, wordt verwacht dat dit protocol verder zal worden verfijnd en gespecialiseerd voor individuele tekensoorten. In het bijzonder zal de injectietiming variëren van soort tot soort, afhankelijk van embryogenese,...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Aluminiumsilicaat haarvaten, met gloeidraad	Sutter instruments	AF100-64-10	Embryo injectie
Benzalkoniumchloride 50% in water, 25 g	TCI-America	B0414	Embryo behandeling, 25 g is ongeveer 25 mL
Filterpapier	Whatman	1001-090	Post-injectiezorg
Pincetten	Thomas Scientific	300-101	Gen orgaan manipulatie
Labdoekjes	Genesee Scientific	88-115
Microloader tips	Eppendorf	930001007	De getrokken naalden laden
Micromanipulator	Sutter instruments	ROE-200	Embryo injectie
Microscopische glazen plaatjes - gewoon, geslepen randen	Genesee Scientific	29-100	Embryo uitlijning, geslepen randen worden verkozen, afgeschuinde randen kunnen de eieren uit het zicht verbergen
NaCl	Research Products International	S23020-500.0	Embryo behandeling
Naaldtrekker	Sutter Instruments	P-1000
Permanent Dubbelzijdig plakband	Scotch	34-8716-3417-5	Embryo uitlijning
Petrischalen	Genesee Scientific	32-107G	Post-injectiezorg
Tegaderm / Transparante filmverband	3M Healthcare	1628	Embryo uitlijning
Wolfraam naalden	Fine Science Tools	10130-10	Gen orgaan manipulatie
Wolfraam draad	Amazon	B08DNT7ZK3	Gen orgaan manipulatie
XenoWorks Digital Microinjector	Sutter instruments	MPC-200	Embryo injectie