Voorbereiding en structurele evaluatie van epitheelcelmonolagen in een fysiologisch groot microfluïdisch kweekapparaat

Summary

Het gepresenteerde protocol beschrijft de ontwikkeling en het gebruik van een op falloidine gebaseerde filamenteuze actinekleuringstechniek met confocale laserscanmicroscopie (CLSM) om de aanhangende cellaagstructuur in microfluïdische dynamische cultuurkanalen en traditionele statische-cultuurkamers met vaste put te visualiseren. Deze benadering helpt bij het evalueren van cellaagconfluentie, monolaagvorming en uniformiteit van laagdikte.

Abstract

In vitro microfluïdische experimenten hebben een groot potentieel om veel inzichten te onthullen in de microfysiologische verschijnselen die optreden bij aandoeningen zoals acute respiratory distress syndrome (ARDS) en door beademingsapparatuur geïnduceerde longschade (VILI). Studies in microfluïdische kanalen met afmetingen die fysiologisch relevant zijn voor de terminale bronchiolen van de menselijke long worden momenteel echter geconfronteerd met verschillende uitdagingen, vooral als gevolg van problemen bij het vaststellen van geschikte celkweekomstandigheden, waaronder mediastroomsnelheden, binnen een bepaalde kweekomgeving. Het gepresenteerde protocol beschrijft een beeldgebaseerde benadering om de structuur van NCI-H441 menselijke longepitheelcellen gekweekt in een zuurstofondoordringbaar microfluïdisch kanaal te evalueren met afmetingen die fysiologisch relevant zijn voor de terminale bronchiolen van de menselijke long. Met behulp van falloidine-gebaseerde filamenteuze actinekleuring worden de cytoskeletale structuren van de cellen onthuld door confocale laserscanmicroscopie, waardoor zowel individuele als gelaagde cellen kunnen worden gevisualiseerd. De daaropvolgende kwantificering bepaalt of de toegepaste celkweekomstandigheden uniforme monolagen produceren die geschikt zijn voor verdere experimenten. Het protocol beschrijft celkweek- en laagevaluatiemethoden in microfluïdische kanalen en traditionele fixed-well-omgevingen. Dit omvat kanaalconstructie, celkweek en vereiste omstandigheden, fixatie, permeabilisatie en kleuring, confocale microscopische beeldvorming, beeldverwerking en gegevensanalyse.

Introduction

Acute respiratory distress syndrome (ARDS) is een acute aandoening die voortvloeit uit belediging en verspreiding van letsel in het longparenchym, resulterend in longoedeem van de longblaasjes, onvoldoende gasuitwisseling en daaropvolgende hypoxemie¹. Dit initieert een cyclus van pro-inflammatoire cytokine-afgifte, neutrofiele rekrutering, toxische mediatorafgifte en weefselschade, die zelf een verdere ontstekingsreactie veroorzaakt². Bovendien kan pulmonale oppervlakteactieve stof, die de luchtwegen stabiliseert en schade voorkomt die wordt veroorzaakt door repetitieve rekrutering / derekrutering (R / D), worden geïnactiveerd of anderszins disfunctioneel worden gemaakt door de chemische processen die optreden tijdens ARDS, wat resulteert in verdere stress en letsel aan het omliggende parenchym³. Als er voldoende schade wordt opgelopen, kan mechanische ventilatie nodig zijn om voldoende systemische oxygenatie te garanderen⁴. Mechanische beademing brengt echter zijn eigen uitdagingen en trauma's met zich mee, waaronder de mogelijkheid van door beademingsapparatuur geïnduceerd longletsel (VILI), gekarakteriseerd als letsel aan het longparenchym veroorzaakt door de mechanische spanningen die worden opgelegd tijdens overinflatie (volutrauma) en/of de R/D van de lucht-vloeistofinterface in de vloeistof-afgesloten luchtweg (atelectrauma)⁵. De drukgradiënt die wordt ervaren door epitheelcellen die worden blootgesteld aan een lucht-vloeistofinterface (zoals in een met vloeistof afgesloten bronchiol) in het atelectraumamodel kan resulteren in een permeabiliteitsgerelateerde obstructieve respons (POOR), wat leidt tot een POOR-get-POORer deugdzame cyclus van letsel ^6,7,8.

In vitro experimenten kunnen op microschaal inzicht geven in deze verschijnselen, maar de huidige studies in microfluïdische kanaalomgevingen met fysiologisch relevante dimensies staan voor verschillende uitdagingen⁹. Ten eerste vormt het optimaliseren van celkweekomstandigheden een belangrijke barrière voor toegang tot celkweekonderzoek in microfluïdische omgevingen, omdat er een smalle kruising bestaat waarbinnen mediastroomparameters, kweekduur en andere kweekomstandigheden optimale cellaagvorming mogelijk maken. Dit omvat de diffusiebeperkingen die worden opgelegd door de zuurstofondoordringbare aard van de microfluïdische kweekkanaalbehuizing. Dit vereist een zorgvuldige afweging van mediastroomparameters, omdat lage stroomsnelheden cellen van zuurstof kunnen beroven, vooral die het verst van de inlaat verwijderd zijn; Aan de andere kant kunnen hoge stroomsnelheden cellen uit het kweekkanaal duwen of resulteren in onjuiste of ongelijke laagontwikkeling. Diffusiebeperkingen kunnen worden aangepakt door zuurstofdoorlatende materialen zoals polydimethylsiloxaan (PDMS) te gebruiken in een lucht-vloeistofinterface (ALI) kweekapparaat; veel conventionele microfluïdische kweekkanalen, zoals die van het elektrische celsubstraatimpedantiedetectiesysteem (ECIS), zijn echter inherent zuurstofondoordringbaar, gezien de aard van de vervaardigde behuizing¹⁰. Dit protocol heeft tot doel een techniek te bieden voor het analyseren van cellagen gekweekt in een zuurstof-ondoordringbare behuizing.

Bij het vergelijken van de levensvatbaarheid van kweekomstandigheden zijn waarnemingen van specifieke laagkenmerken, zoals de aanwezigheid van een monolaag, oppervlaktetopologie, confluentie en uniformiteit van de laagdikte, noodzakelijk om te bepalen of de cellaag die door een bepaalde reeks kweekomstandigheden wordt geproduceerd, voldoet aan de gewenste specificaties en inderdaad relevant is voor het experimentele ontwerp. Een beperkte evaluatie kan worden uitgevoerd met methoden zoals ECIS, die gebruik maakt van metingen van elektrische potentiaal (spanning) gecreëerd door weerstand tegen hoogfrequente wisselstroom (AC) (impedantie) opgelegd door elektrisch isolerende membranen van cellen gekweekt op gouden elektroden binnen de stroomarray. Door de frequentie van AC toegepast op cellen te moduleren, kunnen specifieke frequentie-afhankelijke cellulaire eigenschappen van de cellen en cellagen zoals oppervlaktetrouwsterkte, tight-junction-vorming en celproliferatie of confluentie worden gericht en onderzocht¹¹. Deze indirecte vormen van metingen zijn echter enigszins moeilijk te interpreteren aan het begin van een experiment en kwantificeren mogelijk niet alle relevante aspecten van de cellaag. Alleen al het observeren van de cellaag onder een fasecontrastmicroscoop kan de aard van bepaalde kwaliteiten zoals confluentie onthullen; veel relevante kenmerken, zoals de aanwezigheid van een monolaag en uniformiteit van de laagdikte, vereisen echter een driedimensionale (3D) evaluatie die niet mogelijk is met brightfield, fasecontrast of fluorescerende microscopische beeldvorming¹².

Het doel van deze studie was om een filamenteuze actinekleuringstechniek te ontwikkelen om op beeldvorming gebaseerde verificatie van een monolaag en de evaluatie van cellaaguniformiteit met behulp van confocale laserscanmicroscopie (CLSM) mogelijk te maken. Filamenteuze actine (F-actine) werd beschouwd als een geschikt doelwit voor het fluorofoorconjugaat, deels vanwege de manier waarop F-actine het celmembraan strak volgt, waardoor een visuele benadering van het volledige celvolume^{mogelijk is 13}. Een ander belangrijk voordeel van het richten op F-actine is de manier waarop kleuring van F-actine visueel cytoskeletale verstoringen of veranderingen opheldert die worden opgelegd door de spanningen en stammen die door de cellen worden ervaren. Crosslinking fixatie met methanolvrij formaldehyde werd gebruikt om de morfologie van de cellen en de cellaag te behouden, omdat uitdrogende fixatieven zoals methanol de neiging hebben om cellen af te vlakken, de cellaag ernstig te vervormen en de eigenschappen ervan te veranderen^14,15.

Om het vermogen van de laagevaluatietechniek te bepalen om deze uitdagingen te verminderen, werden cellen gekweekt in traditionele kweekkamers met acht putten en in microfluïdische kanalen om de eventuele verschillen in de geproduceerde cellagen te evalueren. Voor vaste kweekputten werden acht putvormige afdekglasunits gebruikt. Voor microfluïdische cultuur werden flowarrays (kanaallengte 50 mm, breedte 5 mm, diepte 0,6 mm) geoptimaliseerd om vereeuwigde menselijke longepitheelcellen (NCI-H441) te kweken in een omgeving met afmetingen die fysiologisch relevant zijn voor de terminale bronchiolen die aanwezig zijn in de ademhalingszone van de menselijke long¹⁶. Hoewel dit protocol is ontwikkeld met de kweekomgeving van ECIS-flowarrays in gedachten, kan het van toepassing zijn op elke zuurstofondoordringbare dynamische cultuuromgeving waarvoor evaluatie van gekweekte cellaagkenmerken of kweekomstandigheden noodzakelijk is.

Protocol

De NCI-H441 humane epitheliale longcellijn werd gebruikt voor deze studie (zie tabel met materialen).

1. Celkweek in het microfluïdische kanaal

1. Fabriceer het microfluïdische kanaal en voer de voorbehandeling uit volgens de onderstaande stappen.
   1. Verkrijg een eenkanaals stroomarray (zie materiaaltabel) en scheid het bovenste gedeelte van de basisplaat van polycarbonaat.
   2. Verkrijg een #1.5 rechthoekig afdekglas (dikte 0,17 mm) met afmetingen van 60 mm x 22 mm. Reinig oppervlakken van het afdekglas in een ultrasoon bad en behandel één kant met een 0,1 mg / ml oplossing van Poly-D-Lysine bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten voordat u gedurende 30 minuten bij 60 ° C droogt.
   3. Bevestig een 0,13 mm dikke dubbelzijdige lijm (zie materiaaltabel), lasergesneden om tegemoet te komen aan de afmetingen van de bovenkant van de flowarray en het stroomkanaal (50 mm lengte, 5 mm breedte), op de bovenkant van de flowarray, waarbij ervoor wordt gezorgd dat de kanaaluitsparingen nauwkeurig worden uitgelijnd¹⁷.
   4. Bevestig een 0,1 mm dikke mylar-afstandhouder (zie materiaaltabel), lasergesneden om tegemoet te komen aan de afmetingen van de bovenkant van de stroomarray en het stroomkanaal, op de plakstrip, waarbij de kanaaluitsparingen nauwkeurig worden uitgelijnd.
   5. Herhaal stap 1.1.3 en 1.1.4 totdat de gewenste kanaalhoogte is bereikt (gebruik bijvoorbeeld voor een kanaalhoogte van 0,6 mm twee afstandhouders en drie plakstrips).
   6. Breng een rechthoekig afdekglas aan op de onderste plakstrip met de met Poly-D-Lysine behandelde zijde naar de kleefstof gericht. Nadat de montage is voltooid, zoals aangegeven in figuur 1, oefent u stevige en gelijke druk uit op de boven- en onderkant van de constructie en houdt u deze gedurende 1 minuut vast.
      OPMERKING: De constructie van de kanaalbehuizing, inclusief afdekglas, lijmen, afstandhouders en flow array top, is nu voltooid.
   7. Spoel het kanaal met gedeïoniseerd water met behulp van een spuit en controleer tegelijkertijd op lekken.
   8. Steriliseer de kanaalbehuizing in een ultraviolette (UV) sterilisator gedurende 30 min¹⁸.
   9. Behandel het kanaal met behulp van een steriele techniek met 2,0 μg/ml humaan fibronectine (zie tabel met materialen) in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en incubeer gedurende ten minste 30 minuten bij 37 °C¹⁹.
2. Voer celkweek uit in het microfluïdische kanaal volgens de onderstaande stappen.
   1. Gebruik in een steriele laminaire stromingskap een micropipette om een gelijkmatige suspensie van NCI-H441-cellen in RPMI 1640-medium met 10% foetaal runderserum (FBS) (zie materiaaltabel) over te brengen om twee microfluïdische kanalen te zaaien, elk met cellen met een oppervlaktedichtheid van 150.000 cellen / cm².
      1. Gebruik voor kanalen van 50 mm x 5 mm x 0,6 mm 0,25 ml van een 2,5 x 10⁶ cellen/ml suspensie om elk kanaal te vullen, evenals een deel van de poorten. Controleer of de cellen gelijkmatig binnen de kanalen zijn verdeeld met behulp van een brightfield-microscoop.
   2. Kweek de twee kanalen gedurende respectievelijk 24 uur en 48 uur bij 37 °C met 5% CO₂ met behulp van een programmeerbare spuitpomp (zie materiaaltabel), waarbij gebruikte media uit het kanaal en verse media uit het kanaal worden getrokken uit een steriel mediareservoir dat is bevestigd aan de kanaalinlaat bestaande uit een opengesneden spuit van 20 ml bedekt met paraffinefilm.
      1. Na een wachttijd van 10 minuten na het zaaien van de cel, brengt en pompt u verse media uit het reservoir door het kanaal met een variabel debiet dat begint bij 0,2 μl / min en gedurende 4 uur wordt opgevoerd tot 10 μl / min, waarna u met dat tempo²⁰ handhaaft.
         OPMERKING: Deze variabele stroomsnelheid biedt kweekomstandigheden die cellen in staat stellen om (1) gravitationeel op het kweekoppervlak te bezinken, (2) zich aan het cultuuroppervlak te hechten en (3) een confluente monolaag te vormen.
3. Voer celfixatie uit in de microfluïdische kanalen met behulp van formaldehyde-oplossing.
   LET OP: Formaldehyde is giftig en moet worden behandeld in een geschikte chemische zuurkast²¹.
   1. Bereid in een chemische zuurkast formaldehyde-oplossingen door 4% formaldehyde in PBS (methanolvrij) te gebruiken (zie materiaaltabel) om twee porties van 4 ml te maken, waarbij de eerste wordt verdund tot een concentratie van 1% formaldehyde en de tweede tot 2% formaldehyde met behulp van dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS; met Ca 2 + en Mg^{2 +}) als verdunningsmiddel. Breng formaldehyde-oplossingen over in afzonderlijke spuiten van 5 ml en etiketteer dienovereenkomstig. Zuig 20 ml DPBS op in een afzonderlijke spuit van 20 ml.
   2. Verwijder microfluïdische kanalen uit het kweekapparaat en plaats ze in de chemische zuurkast.
   3. Monteer het bevestigings- en beitsapparaat.
      1. Bevestig een segment van 10 cm overdrachtsbuizen aan de zijpoort van een driewegstopkraan via een mannelijke Luer-vergrendeling aan de slanghaakadapter (zie materiaaltabel) en sluit vervolgens de stopkraan aan op de inlaatpoort van de stroomarray.
      2. Bevestig vervolgens nog een segment van 10 cm transferbuizen aan de uitlaatpoort van de stroomarray met behulp van hetzelfde type slanghaakadapter.
      3. Bevestig ten slotte de vrije uiteinden van beide overdrachtsbuizen in een chemische en biohazard-geschikte afvalcontainer, zoals een gelabelde lege conische centrifugebuis van 50 ml.
   4. Draai aan de stopkraan om de inlaatpoort van de stroomarray te blokkeren en spoel de afvalleiding met DPBS. Draai vervolgens aan de stopkraan om de afvallijn af te sluiten en was cellen langzaam met 2 ml DPBS. Herhaal de spoelstap met de nieuwe oplossing elke keer. Een nieuwe oplossing (of concentratie van oplossing) wordt in het kanaal geïntroduceerd.
   5. Duw langzaam 2 ml 1% fixatieve oplossing door het kanaal en laat dan 5 min²² zitten.
   6. Duw langzaam 2 ml 2% fixatieve oplossing door het kanaal en laat dan 15 minuten zitten.
   7. Was cellen door langzaam 2 ml verse DPBS in het kanaal te introduceren in drie afzonderlijke instanties (elk 5 minuten).
   8. Voer stap 1.3.3-1.3.7 voor beide microfluïdische kanalen parallel uit.
4. Kleur, permeabiliseer en voeg bevestigingsmedia toe aan de cellen in het microfluïdische kanaal.
   1. Bereid 0,1% saponine-oplossing door 1 mg saponine (zie materiaaltabel) per ml DPBS toe te voegen om 4 ml oplossing te produceren en voorzichtig vortex om²³ te mengen. Zuig 8 ml DPBS op in een spuit van 20 ml.
   2. Voeg een F-actinekleuringsfalloidinereagens en een nucleuskleurend Hoechst-reagens (zie materiaaltabel) toe aan de 0,1% saponine-oplossing, met twee druppels (0,1 ml) van elk reagens per ml saponine-oplossing. Houd voorbereide vlek- / permeabiliserende oplossing uit de buurt van licht door te bedekken met aluminiumfolie²⁴.
   3. Spoel de lijn met een kleine hoeveelheid kleurings-/permeabiliserende oplossing (zoals beschreven in stap 1.3.4), breng vervolgens 2 ml van de oplossing aan in het microfluïdische kanaal en bedek het kanaal met aluminiumfolie voordat u het gedurende 30 minuten op kamertemperatuur laat zitten.
   4. Spoel de kleurings-/permeabiliserende oplossing tweemaal uit met 2 ml DPBS gedurende 5 minuten per spoeling.
   5. Voor een betere beeldkwaliteit voegt u een geschikt montagemedium (met een brekingsindex die nauw aansluit bij de olie en het dekglas van de microscoopobjectief, zie materiaaltabel) toe aan het kanaal.
      1. Breng met behulp van een micropipet een minimale hoeveelheid van een zacht ingestelde antifade-montage aan op elke poort van het microfluïdische kanaal, zodat het bodemoppervlak volledig bedekt is en er geen bellen worden opgesloten in het gewenste beeldvormingsgebied²⁵. Sluit de uiteinden van het kanaal af en controleer de integriteit van de cellaag door te observeren onder een brightfield-microscoop.
   6. Voer stap 1.4.3-1.4.5 voor beide microfluïdische kanalen parallel uit.
      OPMERKING: Afbeeldingscellen zo snel mogelijk na het kleuren voor maximale beeldkwaliteit. Als fotobleaching optreedt of langdurige opslag gewenst is, kunnen andere montagemedia met antifade- of monsterconserverende eigenschappen worden gebruikt. Merk op dat hard uithardende montagemedia de 3D-structuur van de cellen en, bij uitbreiding, de cellaag zullen vervormen; Om deze reden hebben zacht uithardende montagemedia de voorkeur²⁶.
5. Afbeeldingscellen in het microfluïdische kanaal volgen de onderstaande stappen.
   1. Pas de instellingen van de confocale microscoop (zie materiaaltabel) aan, inclusief laservermogens-, versterkings-, offset- en scanparameters zoals scansnelheid, scangebied, scanindeling, resolutie en pinholediameter²⁷.
   2. Test de beeldlocatie door referentiescans en Z-stacks te maken totdat aan de gewenste beeldparameters en -voorwaarden is voldaan. Inbelparameters bij sequentieel hogere vergrotingsdoelen totdat het 40x olie-onderdompelingsobjectief is bereikt en geoptimaliseerd²⁸.
   3. Gebruik de basisplaat van de stroomarray als referentie en construeer Z-stacks op vijf locaties, op de potentiële locatie van de eerste elektrode aan de inlaatzijde, halverwege tussen het midden en de vorige locatie, het midden, halverwege tussen het midden en de locatie van de laatste elektrode (aan de uitlaatzijde) en bij de laatste elektrode, zoals aangegeven in figuur 2.
6. Voer beeldverwerking en gegevensanalyse uit.
   1. Exporteer XZ- en YZ-doorsneden met behulp van het confocale microscoopsoftwarepakket (zie materiaaltabel).
   2. Meet met behulp van beeldverwerkingssoftware (zie materiaaltabel) met randdetectiemogelijkheden (drempelwaarde 15,0) het totale afbeeldingsgebied in pixels met het gereedschap Toverstaf buiten de afbeelding en vervolgens het gebied met uitzondering van de totale doorsnede van de cellaag in pixels met het gereedschap Toverstaf in het gedeelte van de afbeelding buiten de cellaag²⁹.
   3. Trek met behulp van gegevensverwerkende software (zie Materiaaltabel) de pixelwaarde van het buitengebied af van de pixelwaarde van het totale gebied om de pixelwaarde van de dwarsdoorsnede te vinden.
   4. Converteer pixelwaarden voor dwarsdoorsneden naar μm^2-waarden door pixelwaarden te vermenigvuldigen met het kwadraat van de μm/pixelwaarde, zoals aangegeven in de microscoopsoftware voor het specifieke beeld (0,31 μm/pixel voor Z-stacks genomen in 1024p-resolutie zonder zoom op een 40x olie-immersielens).
   5. Bereken gemiddelden en standaarddeviaties van gegevens en grafiekresultaten.

Figuur 1: Exploded-view schema van de microfluïdische kanaalconstructie. Het bovenste element is het bovenste gedeelte van de flow array, dunne grijze elementen zijn plakstrips, dunne blauwe elementen zijn mylar spacers en het onderste element is het rechthoekige afdekglas. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Vijf beeldvormingslocaties langs het consistent laagproducerende gebied van het microfluïdische cultuurkanaal. Beeldvormingslocaties zijn als volgt: inlaatzijde, in de buurt van waar de eerste elektrode zich op de intacte stroomarray zou bevinden; halverwege tussen de inlaatlocatie en het midden van het kanaal; midden van het kanaal; halverwege tussen het midden en de locatie aan de uitlaatzijde en de uitlaatzijde, in de buurt van waar de laatste elektrode zich op de intacte stroomarray zou bevinden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Celkweek in het acht-well chambered coverglass

1. Voer een voorbehandeling uit van het afdekglas met acht putkamers.
   1. Verkrijg een steriel acht-well chambered coverglass vervaardigd met een #1.5 coverglass en celhechtingsverhogende oppervlaktebehandeling (Figuur 3, zie Tabel met materialen).
   2. Behandel met behulp van steriele techniek het oppervlak van kweekputten met 2,0 μg / ml humaan fibronectine in PBS en incubeer gedurende ten minste 30 minuten bij 37 °C¹⁹.
2. Voer celkweek uit in het kamervormig afdekglas volgens de onderstaande stappen.
   1. Breng in een steriele laminaire stroomkap 0,5 ml porties van oplossingen van NCI-H441-cellen gelijkmatig over in RPMI 1640-medium met 10% FBS bij volumetrische dichtheden van 81.000, 162.000 en 324.000 cellen / ml om de kweekputten te zaaien met oppervlaktedichtheden van respectievelijk 45.000, 90.000 en 180.000 cellen / cm². Controleer of de cellen gelijkmatig zijn verdeeld in de putten met behulp van een brightfield-microscoop.
   2. Kweekcellen gedurende 24 uur, 48 uur en 96 uur bij 37 °C met 5% CO₂, waarbij de media dagelijks worden vervangen.
3. Voer formaldehydefixatie uit in het afdekglas met acht putkamers.
   LET OP: Formaldehyde is giftig en moet worden behandeld in een geschikte chemische zuurkast²¹.
   1. Bereid in een chemische zuurkast formaldehyde-oplossingen door twee porties van 4% formaldehyde in PBS (methanolvrij) te maken, waarbij de eerste wordt verdund tot een concentratie van 1% formaldehyde en de andere tot 2% formaldehyde met behulp van dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS; met Ca 2 + en Mg^{2 +}) als verdunningsmiddel.
   2. Verwijder het afdekglas met acht kweekkamers uit de incubator en plaats het in de chemische zuurkast.
   3. Was cellen voorzichtig met 0,5 ml DPBS met behulp van een micropipette door langzaam vloeistof in te brengen langs het bovenste deel van de hoek van elke put.
   4. Verwijder bestaande vloeistof in elke put door deze langzaam uit de hoek van de putten te halen met behulp van een micropipette. Gebruik de vloeistofinbrengmethode (stap 2.3.3) en breng 0,5 ml 1% fixatieve oplossing in elke put en laat deze 5 minuten²² zitten.
   5. Verwijder de bestaande vloeistof in elke put met behulp van de vloeistofextractiemethode die wordt vermeld in stap 2.3.4. Gebruik de vloeistofinbrengmethode die wordt vermeld in stap 2.3.3, breng 0,5 ml 2% fixatieve oplossing in elke put en laat deze 15 minuten zitten.
   6. Was cellen met behulp van de vloeistofintroductie- en extractiemethoden (stappen 2.3.3 en 2.3.4) door 0,5 ml vers DPBS in elke put in te brengen en te verwijderen in drie afzonderlijke instanties gedurende elk 5 minuten.
4. Voer beits-, permeabilisatie- en montagemedia-toevoeging uit in het afdekglas met acht putkamers.
   1. Bereid 0,1% saponine-oplossing door 1 mg saponine per ml DPBS toe te voegen en voorzichtig vortex om²³ te mengen.
   2. Voeg aan de 0,1% saponine-oplossing twee druppels (0,1 ml) elk van een F-actinekleurend falloïdine-reagens en een kernkleurend Hoechst-reagens per ml saponine-oplossing toe. Houd de bereide oplossing uit de buurt van licht door af te dekken met aluminiumfolie²⁴.
   3. Breng 0,2 ml beits- / permeabilisatieoplossing aan in elke put en bedek het kamervormige afdekglas met aluminiumfolie voordat u het 30 minuten op kamertemperatuur laat zitten.
   4. Spoel de vlek-/permeabiliserende oplossing tweemaal uit met 0,5 ml DPBS.
   5. Voor een betere beeldkwaliteit voegt u een geschikt montagemedium (met een brekingsindex die nauw aansluit bij de olie en het dekglas van de microscoop) toe aan de putten.
      1. Breng met behulp van een micropipet een minimale hoeveelheid van een zacht ingestelde antifade-montage aan in elke put, zodat het bodemoppervlak volledig bedekt is en er geen bubbels worden opgesloten in het gewenste beeldvormingsgebied²⁵. Controleer de integriteit van de cellaag door te observeren onder een brightfield-microscoop.
         OPMERKING: Afbeeldingscellen zo snel mogelijk na het kleuren voor maximale beeldkwaliteit. Als fotobleaching optreedt of langdurige opslag gewenst is, kunnen andere montagemedia met antifade- of monsterconserverende eigenschappen worden gebruikt. Merk op dat hard uithardende montagemedia de 3D-structuur van de cellen en, bij uitbreiding, de cellaag zullen vervormen, dus zacht uithardende montagemedia hebben de voorkeur²⁶.
5. Voer beeldvorming uit in het acht-well chambered coverglass.
   1. Pas de confocale microscoopinstellingen aan, inclusief laservermogen, versterking, offset en scanparameters zoals scansnelheid, scangebied, scanformaat, resolutie en pinholediameter²⁷.
   2. Test de beeldlocatie door referentiescans en Z-stacks te maken totdat aan de gewenste beeldparameters en -voorwaarden is voldaan. Inbelparameters bij sequentieel hogere vergrotingsdoelen totdat het 40x olie-onderdompelingsobjectief is bereikt en geoptimaliseerd²⁸.
   3. Construeer Z-stacks van drie willekeurige locaties in elke match-up van zaaidichtheid / cultuurduur.
6. Voer beeldverwerking en gegevensanalyse uit.
   1. Exporteer XZ- en YZ-doorsneden met behulp van het confocale microscoopsoftwarepakket.
   2. Meet met behulp van een beeldverwerkingssoftware met randdetectiemogelijkheden (drempelwaarde 15,0) het totale afbeeldingsgebied in pixels met het gereedschap Toverstaf buiten de afbeelding en vervolgens het gebied met uitzondering van de totale doorsnede van de cellaag in pixels met het gereedschap Toverstaf in het gedeelte van de afbeelding buiten de cellaag²⁹.
   3. Trek met behulp van een gegevensverwerkende software de pixelwaarde van het buitengebied af van de pixelwaarde van de totale oppervlakte om de pixelwaarde van de dwarsdoorsnede te vinden.
   4. Converteer pixelwaarden voor dwarsdoorsnedes naar μm^2-waarden door pixelwaarden te vermenigvuldigen met het kwadraat van de μm/pixelwaarde zoals aangegeven in de microscoopsoftware voor het specifieke beeld (0,31 μm/pixel voor Z-stacks genomen in 1024p-resolutie zonder zoom op een 40x olie-immersielens).
   5. Bereken gemiddelden en standaarddeviaties en grafiekresultaten.

Figuur 3: Diagram van het achtputvormige afdekglas dat wordt gebruikt voor het experiment, de kleuring en het beeldvormingsexperiment met vaste put, waarin de effecten van de initiële celzaaidichtheid en de kweekduur op de vorming van cellagen worden vergeleken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Results

De gepresenteerde methode maakt de visualisatie mogelijk van epitheelcellagen gekweekt in microfluïdische cultuurkanalen en gebruikt een demonstratie in traditionele celkweekomgevingen met vaste put als validatie. De verkregen beelden bestaan op een spectrum van kwaliteit, signaalintensiteit en cellulaire doelspecificiteit. Succesvolle afbeeldingen zullen een hoog contrast vertonen, waardoor beeldanalyse en kwantificering van gegevens mogelijk is voor latere statistische evaluatie. Niet-succesvolle afbeeldingen zijn vaag...

Discussion

Het gepresenteerde protocol beschrijft de cultuur, crosslinking fixatie, kleuring, permeabilisatie en confocale microscopische visualisatie van NCI-H441 menselijke longepitheelcellen in de dynamische omgeving van een eenkanaals microfluïdische stroomarray, evenals in de statische omgeving van een traditioneel acht-goed gekamerd coverglas. Bij elk microfluïdisch celkweekprotocol zijn de stroomomstandigheden van de celkweekmedia van het grootste belang, omdat de snelle stroom het potentieel heeft om de cellen weg te spoele...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
A1R HD25 Confocal Microscope System	Nikon	A1R HD25	https://www.microscope.healthcare.nikon. com/products/confocal-microscopes/a1hd25-a1rhd25/specifications
ActinGreen 488 ReadyProbes Reagent (AlexaFluor 488 phalloidin)	Invitrogen	R37110	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37110
Adhesive Transfer Tape Double Linered	3M	468MP	https://gizmodorks.com/3m-468mp-adhesive-transfer-tape-sheet-5-pack/
Air-Tite HSW Soft-Ject Disposable Syringes	Air-Tite RL5	14-817-53	https://www.fishersci.com/shop/products/air-tite-hsw-soft-ject-disposable-syringes-6/1481753#?keyword=syringe%20leur%20locking%205ml
BAISDY 4 mil (0.1 mm) Thick Mylar Sheet	BAISDY	AS022	https://www.amazon.ca/Stencil-Perfect-Silhouette-Machines-BAISDY/dp/B07RJJ9BNC
Branson Ultrasonics M Series Ultrasonic Cleaning Bath	Branson Ultrasonics	15-336-100	https://www.fishersci.com/shop/products/m-series-ultrasonic-cleaning-bath/15336100
Corning Fibronectin, Human	Fisher Scientific	CB-40008	https://www.fishersci.com/shop/products/corning-fibronectin-human-3/CB40008?keyword=true
DPBS, calcium, magnesium	Gibco	14040133	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133?SID=srch-srp-14040133
ECIS Cultureware Disposable Electrode Arrays 8 x 10 ECIS Flow Array	Applied BioPhysics	1F8x10E PC	https://www.biophysics.com/cultureware.php#1F8x10E
Enterprise Technology Solutions UV Sterilizer Cabinet, White	Enterprise Technology Solutions	50-211-1163	https://www.fishersci.com/shop/products/uv-sterilizer-cabinet-white/502111163
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	26140079	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079
Finnpipette F2 Variable Volume Pipettes	Thermo Scientific	4642090	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4642090
Fisherbrand 50mL Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	06-443-21	https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-higher-speed-easy-reader-plastic-centrifuge-tubes-8/p-193269
Fisherbrand Cover Glasses: Rectangles (#1.5)	Fisher Scientific	12-544-GP	https://www.fishersci.com/shop/products/cover-glasses-rectangles-promo-22/12544GP#coverglass
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use	Fisher Scientific	14-955-458	https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955458
Gibco RPMI 1640 Medium	Gibco	11875093	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11875093
Image-iT Fixative Solution (4% formaldehyde, methanol-free)	Invitrogen	FB002	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/FB002
ImageJ Fiji	ImageJ	ImageJ Fiji	https://imagej.net/downloads
Immersion Oil F 30 cc	Nikon	MXA22168	https://www.microscope.healthcare.nikon. com/products/accessories/immersion-oil/specifications
Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator, 821 L, Polished Stainless Steel	Thermo Scientific	3950	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/3950
Laxco LMC-3000 Series Brightfield Compound Microscope System	Laxco	LMC3BF1	https://www.fishersci.com/shop/products/lmc-3000-series-brightfield-compound-microscope-system-8/LMC3BF1
Masterflex Fitting, Nylon, Straight, Male Luer Lock to Hose Barb Adapters, 1/16" ID; 25/PK	Masterflex	ZY-45505-31	https://www.masterflex.com/i/masterflex-fitting-nylon-straight-male-luer-lock-to-hose-barb-adapters-1-16-id-25-pk/4550531?PubID=ZY&persist=true&ip=no& gclid=Cj0KCQiA3rKQBhCNARIsAC UEW_Zb5yXy1em6bGs0a9KFOk5k pdlkHCvAEslHumdqcnlwSN0MdR0 udmwaAuDHEALw_wcB
Microsoft Excel	Microsoft	0016	https://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=56547
National Target All-Plastic Disposable Syringes	Thermo Scientific	03-377-24	https://www.fishersci.com/shop/products/national-target-all-plastic-disposable-syringes/0337724#tab8
NCI-H441 Human Epithelial Lung Cells	American Type Culture Collection (ATCC)	HTB-174	https://www.atcc.org/products/htb-174
NE-1600 Six Channel Programmable Syringe Pump	New Era Pump Systems	NE-1600	https://www.syringepump.com/NE-16001800.php
NIS Elements AR	Nikon	NIS Elements AR	https://www.microscope.healthcare.nikon. com/products/software/nis-elements/nis-elements-advanced-research
NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342)	Invitrogen	R37605	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37605?SID=srch-srp-R37605
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass	Thermo Scientific	155411	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/155361
Parafilm M Wrapping Film	Fisher Scientific	S37441	https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-