Verzameling en langdurig onderhoud van bladsnijdende mieren (Atta) in laboratoriumomstandigheden

Samenvatting

Hier wordt een protocol beschreven om met succes gezonde Atta (Hymenoptera: Formicidae) mierenkolonies te verzamelen en te onderhouden in laboratoriumomstandigheden. Bovendien worden verschillende nesttypen en configuraties gedetailleerd samen met mogelijke experimentele procedures.

Samenvatting

Mieren zijn een van de meest biodiverse groepen dieren op de planeet en bewonen verschillende omgevingen. Het onderhoud van mierenkolonies in gecontroleerde omgevingen maakt een verrijkt begrip van hun biologie mogelijk dat kan bijdragen aan toegepast onderzoek. Deze praktijk wordt meestal gebruikt in populatiecontrolestudies van soorten die economisch verlies veroorzaken, zoals Atta-mieren . Om hun mutualistische schimmel te cultiveren, verzamelen deze bladsnijmieren bladeren en worden hiervoor beschouwd als landbouwplagen die wijd verspreid zijn over het Amerikaanse continent. Ze zijn zeer sociaal georganiseerd en bewonen uitgewerkte ondergrondse nesten die bestaan uit een verscheidenheid aan kamers. Hun onderhoud in een gecontroleerde omgeving hangt af van een dagelijkse routine van verschillende procedures en frequente zorg die hier worden beschreven. Het begint met het verzamelen van koninginnen tijdens het voortplantingsseizoen (d.w.z. huwelijksvlucht), die vervolgens individueel worden overgebracht naar plastic containers. Vanwege het hoge sterftecijfer van koninginnen, kan een tweede verzameling ongeveer 6 maanden na de huwelijksvlucht worden uitgevoerd, wanneer beginnende nesten met ontwikkeld schimmelwaad worden uitgegraven, met de hand geplukt en in plastic containers worden geplaatst. In het laboratorium worden dagelijks bladeren verstrekt aan gevestigde kolonies en wordt door mieren geproduceerd afval wekelijks verwijderd, samen met het resterende droge plantmateriaal. Naarmate de schimmeltuin blijft groeien, worden kolonies overgebracht naar verschillende soorten containers volgens het experimentele doel. Bladsnijdende mierenkolonies worden in onderling verbonden containers geplaatst, die het organisatiesysteem vertegenwoordigen met functionele kamers gebouwd door die insecten in de natuur. Deze opstelling is ideaal om factoren zoals afvalhoeveelheid, schimmeltuingezondheid en het gedrag van werknemers en koninginnen te controleren. Gefaciliteerde gegevensverzameling en meer gedetailleerde observaties worden beschouwd als het grootste voordeel van het houden van mierenkolonies in gecontroleerde omstandigheden.

Inleiding

Mieren vormen een diverse groep individuen die invloed uitoefenen op de meeste terrestrische omgevingen¹. Ze fungeren als efficiënte verspreiders ^2,3,4, roofdieren⁵ en ecosysteemingenieurs ^6,7,8,9,10, wat hun belang en ecologisch succes op natuurlijke ecosystemen benadrukt. Alle mierensoorten zijn geclassificeerd als eusociale insecten; hun sociale organisatie varieert echter sterk tussen verschillende soortengroepen, d.w.z. arbeidsverdelingssystemen, functionele groepen, communicatie tussen individuen, voederorganisatie, koloniestichting en reproductieproces¹¹. Als een zeer gediversifieerde groep nemen ze hun toevlucht tot verschillende voedselbronnen en gespecialiseerd voedingsgedrag. In feite was landbouw niet alleen een enorme stap voor de menselijke beschaving, maar ook voor mierensoorten. Ongeveer 55 tot 65 Ma geleden¹², attine mieren begonnen schimmels te kweken en op te nemen in een bijna exclusief dieet. Ze werden zo gespecialiseerd dat ze strikte, afhankelijke en verplichte interacties ontwikkelden die geclassificeerd werden als symbiose, waarbij het ene individu niet overleeft zonder het andere.

Lagere schimmelgroeiende mieren verzamelen en verwerken dood organisch materiaal, zoals fragmenten van rottend blad, om hun mutualistische schimmel te laten groeien; terwijl hogere schimmelgroeiende mieren vers plantmateriaal oogsten, waardoor een van de meest succesvolle symbiotische natuurlijke systemen wordt samengesteld¹³. Deze zeer gespecialiseerde landbouwtechniek stelde hen in staat om een nieuwe niche te veroveren. De hogere attinemieren vormen de bladsnijdende mieren, een monofyletische groep die tussen 19 Ma (15-24 Ma) en 18 Ma (14-22 Ma)14,15,16 opwekt, bestaande uit vier geldige geslachten: Atta Fabricius, Acromyrmex Mayr, Amoimyrmex Cristiano en Pseudoatta Gallardo. Het bladsnijderlandbouwsysteem dat door de bladsnijmieren wordt uitgevoerd, is voortgekomen uit afgeleide landbouwsystemen¹⁷. De meeste van deze soorten exploiteren uitsluitend de mutualistische schimmelsoort Leucoagaricus gongylophorus Singer¹⁸ (ook wel Leucocoprinus gongylophorus Heim¹⁹ genoemd), wat een significante evolutionaire overgang markeert¹¹. De schimmelcultivars worden verticaal overgedragen, van originele nesten tot nakomelingen, wat suggereert dat ze klonaal zijn vermeerderd²⁰.

Opmerkelijk is dat Atta-samenlevingen een complexe organisatiestructuur ontwikkelden die van enorm belang is voor hun omgeving en van groot belang is voor myrmecologen. Hun populatie kan bestaan uit miljoenen individuen, de meesten van hen steriele vrouwelijke werknemers die een geaccentueerd polymorfisme vertonen, d.w.z. verschillende grootte en anatomische morfologie. De populatie onderscheidt zich door kasten op basis van leeftijd, fysiologische toestand, morfologisch type, gedrag en gespecialiseerde activiteiten in de kolonie²¹. Werknemers kunnen worden gediscrimineerd in tuinders en verpleegkundigen, generalisten binnen het nest, foerageurs en graafmachines, en verdedigers of soldaten²¹. Deze organisatie maakt het mogelijk om taken in samenwerking uit te voeren en een zelforganiserend systeem dat zeer gestructureerd collectief gedrag kan produceren, waardoor ze efficiënt kunnen reageren op omgevingsverstoringen²².

De rol van populatievernieuwing wordt gespeeld door een enkele koningin (d.w.z. monogynisch), zolang ze leeft, die de permanente reproductieve kaste vormt²². Van Atta-koninginnen is bekend dat ze meer dan 20 jaar leven en eieren leggen gedurende hun hele levensduur²³. Omdat de koningin onvervangbaar is, is haar uithoudingsvermogen cruciaal voor het voortbestaan van de kolonie 13,20,23,24. Toch zijn duizenden gevleugelde reproductieve vrouwtjes en mannetjes tijdens broedseizoenen in het nest te vinden, maar geen enkele blijft in het oorspronkelijke nest en vormt een tijdelijke kaste²². In Atta sexdens kolonies worden bijna 3.000 reproductieve vrouwtjes en 14.000 reproductieve mannetjes geproduceerd²⁵. Het treedt op wanneer een kolonie geslachtsrijp is, ongeveer 38 maanden na de implementatie ervan, en wordt sindsdien jaarlijks herhaald totdat het^23,25 is uitgedoofd. Nieuwe Atta-kolonies worden gevestigd door haplometrosis, waarbij één koningin een nieuw nest begint.

Wanneer de omgevingsomstandigheden gunstig zijn, verlaten de reproduceerders het ondergrondse nest om de huwelijksvlucht te beginnen. De periode van het voorkomen verschilt per regio, variërend over het hele jaar over het hele Braziliaanse grondgebied, afhankelijk van de soort. De gebeurtenis lijkt echter te worden voorafgegaan door regenval en vochtigheidshoogte²⁶, die kan worden gerelateerd aan het faciliteren van uitgraving als gevolg van bodemvocht²². Vaak worden 1-5 weken voor de huwelijksvlucht nestingangen en kanalen verbreed om de reproductieve individuen te vergemakkelijken om te vertrekken. Voordat ze hun moederkolonies verlaten, verzamelen en bewaren de gevleugelde vrouwtjes in een infrabuccale holte een deel van de mutualistische schimmel^20,27. Meerdere copulaties worden halverwege de vlucht uitgevoerd en er wordt berekend dat één koningin kan worden geïnsemineerd door drie tot acht mannetjes (d.w.z. polyandrie) in sommige soorten²⁸, waardoor genetische variabiliteit wordt gegarandeerd²⁹. Daarna gaan de koninginnen naar de grond en geven ze de voorkeur aan locaties met geen of weinig vegetatie²⁵, waar ze hun vleugels verwijderen en hun eerste nestkamer uitgraven. Dit is de enige periode waarin koninginnen buiten het nest te zien zijn. Hoewel individuen van de tijdelijke kaste werden gezien in kunstmatige nesten, is het onbekend of een succesvolle copulatie (d.w.z. huwelijksvlucht) werd uitgevoerd in laboratoriumomstandigheden²⁴.

De eerste nestbouw komt overeen met de meest cruciale periode van de kolonie, die kan duren van 6 h tot 8 h ^23,25. Op dit moment kloostert de koningin zichzelf in de eerste kamer en binnen enkele dagen begint de ovipositie. De eerste eieren worden gevoerd aan de mycelial die de koningin oprispt, wat het begin van de schimmeltuin van de kolonie markeert. De eerste larven verschijnen in ongeveer 25 dagen²², en bijna aan het einde van de eerste maand bestaat de kolonie uit een mat van woekerende schimmel, waar onvolwassenen (eieren, larven en poppen) zijn genest, en de koningin, die haar eerste nakomelingen in isolatie grootbrengt²³. Eieren zijn ook de voedselbron van de eerste larven en worden sterk geconsumeerd door de koningin¹³. Bovendien onderhoudt de koningin zichzelf met vetlichaamreserves en kataboliserende vleugelspieren die niet langer van nut zijn¹³. De initiële schimmelcultuur wordt niet geconsumeerd omdat de overleving van de kolonie afhankelijk is van de ontwikkeling ervan, en tijdens deze periode bevrucht de koningin het met fecale vloeistof¹³. Dagen nadat ze tevoorschijn zijn gekomen, openen de eerste werksters de nestingang en beginnen ze met een foerageeractiviteit in de directe omgeving van het nest¹³. Ze bevatten het verzamelde materiaal als substraat van de schimmeltuin, die nu dient als voedsel voor de arbeiders^13,22. Voordat het aan de schimmelcultuur wordt toegevoegd, wordt het plantmateriaal dat door de werknemers wordt meegevoerd in kleine stukjes gesneden en bevochtigd met fecale vloeistof¹³. De mieren manipuleren schimmel inoculum om de groei te verhogen en te beheersen, wat zal dienen voor het verdelen van grote grond uitgegraven kamers, gespecialiseerd in het conditioneren van de tuin 13,22,25.

Ongeveer 6 maanden na de huwelijksvlucht bevatten de nesten van A. sexdens een schimmelkamer en een paar kanalen. De grote specialisatie in de bouw van bladsnijdende mierennesten werkt als een verdedigingsmechanisme tegen natuurlijke vijanden en ongunstige omgevingsfactoren²². Van bladsnijmieren is bekend dat ze de schimmeltuin fragmenteren en transponeren naar kamers met een hoge luchtvochtigheid wanneer kamers beginnen uit te drogen¹³. Dus, ondanks het feit dat het uitgraven van het nest een aanzienlijke energiekost heeft, wordt de geïnvesteerde energie omgekeerd in voordelen voor de kolonie zelf²². Op een paar uitzonderingen na maken Atta-soorten ook gespecialiseerde kamers voor het afval van de kolonie, meestal gemaakt van uitgeput schimmelsubstraat en lichamen van dode mieren, isoleren het van de rest van het nest en stellen een belangrijke sociale immuniteitsstrategie vast³⁰. Bovendien manipuleert een afzonderlijke groep werknemers het afval rechtstreeks, om besmetting van andere personen te voorkomen. Arbeiders foerageren voortdurend om de schimmel te voeden, wat de belangrijkste voedingsbron van de kolonie is. Ze kunnen zich echter ook voeden met plantensap tijdens het snijden van fragmenten. Plantmateriaal wordt zorgvuldig geselecteerd voor het onderhoud van de schimmeltuin en beïnvloed door vele factoren zoals bladeigenschappen en eigenschappen van het ecosysteem¹³.

De foerageerstrategie van bladsnijmieren om vers materiaal te verkrijgen is zeer complex en in combinatie met de hoge oogstvraag van gevestigde kolonies resulteert dit in aanzienlijk economisch verlies voor landbouwproducenten en brengt het bosherstelgebieden in gevaar^22,31. Daarom kunnen deze mieren worden gecategoriseerd als ongedierte in de meeste gebieden waar ze kunnen worden aangetroffen, variërend van het zuiden van de Verenigde Staten tot het noordoosten van Argentinië 11,13,22,32. Het uitdoven van problematische kolonies is een uitdaging vanwege de reeks aanpassingen die inherent zijn aan de biologie van deze insecten (d.w.z. sociale organisatie, foerageren, schimmelteelt, hygiëne en complexe neststructuren)³³. Vandaar dat de populatiebeheersingsstrategieën verschillen van die welke over het algemeen worden toegepast op andere insectenplagen en voornamelijk hun toevlucht nemen tot aantrekkelijke besmette aasaanbiedingen^33,34. Omdat deze mieren echter schadelijke stoffen voor zowel de schimmel als de kolonie-individuen kunnen afwijzen en gecultiveerde velden kunnen compromitteren³³, worden nieuwe natuurlijke verbindingen en alternatieven voor bestrijding voortdurend getest 33,35,36. Omdat experimentresultaten nauwelijks kunnen worden gevolgd op in het veld geteste kolonies, worden voorlopige essays uitgevoerd in een gecontroleerde omgeving.

Experimentele protocollen moeten dus worden aangepast aan groepen van belang, rekening houdend met de heterogene levensstijl van mieren, het ondersteunen van studies op soortniveau en het verantwoorden van kolonies als operationele eenheden, waarbij één mier een element is van een complex superorganisme¹¹. De tot nu toe verzamelde rapporten over het geslacht Atta maakten het haalbaar om met succes kolonies in laboratoriumomstandigheden te verzamelen en te onderhouden en hun basisbehoeften en algemeen functioneren te erkennen. Op basis van hun natuurlijke processen zoals voortplanting, het stichten van kolonies en voedingsgedrag, is een routine van praktijken ontwikkeld die het mogelijk maakt om op lange termijn kolonies in verschillende soorten nesten te vestigen. Hier wordt een procedureel protocol beschreven om bladsnijdende mieren in het laboratorium te behouden en belicht mogelijk algemeen onderzoek met verschillende experimenteerdoeleinden en wetenschappelijke outreach.

Protocol

1. Verzameling koninginnen

1. Zoek in de literatuur voor de periode van het atta-voortplantingsseizoen in de regio van belang. Het voorkomen van het voortplantingsseizoen, de frequentie en de dag van huwelijksvluchten varieert afhankelijk van de regionale klimaatomstandigheden (tabel 1). Hoewel het over het algemeen in het voorjaar plaatsvindt, moet deze informatie worden verzameld voor de locatie waar de verzameling bedoeld is 37,38,39,40,41,42,43,44,45,46.
2. Identificeer en markeer locaties met Atta-nesten die worden beschouwd als mogelijke gebieden voor het verzamelen van koninginnen en jonge kolonies. Tijdens huwelijksvluchten worden koninginnen verspreid over nestlocaties; daarom hebben gebieden met een groter aantal kolonies een grotere kans om koninginnenlandingsplaatsen te hebben waar ze nieuwe nestopgravingen initiëren.
3. Controleer de gebieden die eerder zijn geselecteerd op tekenen van huwelijksvlucht tijdens het voortplantingsseizoen van Atta-mieren . Houd de omgevingsomstandigheden van huwelijksvliegdagen bij, zoals warm en regenweer.
4. Identificeer bladsnijdende mierennesten in de eerder geselecteerde gebieden en zoek naar uiterlijke kenmerken die wijzen op het aanstaande vertrek van gevleugelde reproductieve mieren. Nestkenmerken zijn onder meer tunnelingangen verbreed (figuur 1), verhoogde stroom werknemers die agressiever gedrag vertonen ten opzichte van mogelijke roofdieren en gevleugelde reproductieve mieren die verschijnen bij tunnelingangen (figuur 1). Pas op voor dagen met een hoge luchtvochtigheid die regenval opvolgen, omdat ze over het algemeen voorafgaan aan huwelijksvluchten.
5. Bereid plastic dekselcontainers voor met een onderste gipslaag om de koninginnen individueel vast te houden. Zorg ervoor dat het containervolume ongeveer 200 ml is en dat de gipslaag aan de onderkant ongeveer 1 cm hoog is en zeer absorberend is voor vochtigheidsregeling.
   OPMERKING: Volg de instructies van de fabrikant om de gipsbasis voor te bereiden.
6. Bereid een omgeving voor met een constante temperatuur van 23 ± 1 °C en ongeveer 70% ± 10% van de relatieve vochtigheid. Kies een locatie zonder intense activiteiten en een hoge stroom van mensen om trillingen en verstoring te voorkomen. Gebruik reinigingsproducten van neutrale geur om interferentie in mierengedrag te voorkomen.
   OPMERKING: Schommelingen in gespecificeerde omgevingsomstandigheden kunnen watercondensatie of vochtverlies veroorzaken en de schimmeltuin in gevaar brengen.
7. Verzamel na de huwelijksvlucht vleugelloze koninginnen die nestuitgraving hebben geïnitieerd en plaats ze zorgvuldig in de plastic containers die zijn voorbereid met een gipslaag, individueel. Vermijd het aanraken van de koninginnen met blote handen en gebruik latex handschoenen of een entomologisch pincet.
   OPMERKING: Vleugelverwijdering en bodemuitgravingsgedrag duiden op reproductieve vrouwtjes die al hebben gecopulteerd en daarom in staat zijn om een nieuwe kolonie te starten. Queens collectie wordt ook behandeld als de eerste collectie in dit werk.
8. Verplaats de containers met de koninginnen naar de locatie met een gecontroleerde omgeving die eerder is geselecteerd. Voer het transport van koninginnen met de grootste voorzichtigheid uit, vermijd te veel verstoring en behoud een minimale temperatuurbestendigheid.
9. Manipuleer of verplaats de koninginnen niet gedurende ongeveer 3 dagen na het verzamelen om stress te voorkomen.

Figuur 1. Nestingang verbreed met gevleugelde mierenvertragers en werksters. Verbrede tunnelingangen zijn een van de nestkenmerken die wijzen op atta-huwelijksvluchten .  Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Onderhoud van Queens

1. Voeg in eerste instantie elke 2 dagen 2,5 ml water toe aan de gipslaag van de ontvanger met behulp van een naaldspuit.
   1. In plaats van de ontvanger te openen, prikt u de deksels van de container voorzichtig door met de naald om verstoring door manipulatie te voorkomen. Hetzelfde gat kan in deze periode worden gebruikt. Zorg ervoor dat het toegevoegde water de gipslaag niet doorweekt. Vermijd direct water geven aan de koningin, de eerste schimmelspons en eventuele onvolwassenen. Zolang de schimmeltuin een droog aspect vertoont met waterontbraak, irrigeert u de gipslaag.
2. Controleer twee weken na de verzameling of de schimmel door de koninginnen is opgerispt. Als er geen schimmel is, breng dan ongeveer 2 g schimmel over die is verkregen uit een gevestigde kolonie. Voer deze stap ook uit als de schimmel zich niet ontwikkelt.
   OPMERKING: Voor schimmeloverdracht is het noodzakelijk om gezonde schimmel uit een gevestigde kolonie te verzamelen en alle mieren te verwijderen die erop kunnen zitten. Gebruik een eetlepel, een entomologisch pincet en latex handschoenen om de schimmel te manipuleren.
3. Begin na het verschijnen van de eerste werksters regelmatig fragmenten van jonge en dunne bladeren aan te bieden, volgens de snijactiviteit van de kolonie. Zorg ervoor dat de aangeboden bladeren gezond zijn en dat de planten niet zijn behandeld met insecticiden of andere chemische stoffen. Zorg er in een vroeg stadium voor dat de bladfragmenten niet meer dan 4 cm zijn.
   OPMERKING: Als de eerste werknemers beginnen met het foerageren van bladeren, moet plantmateriaal worden aangeboden na hun verschijning. De aanbiedingsfrequentie hangt af van de behendigheid waarmee de werknemers het plantmateriaal op de schimmel opnemen, maar kan variëren tot 2-3 dagen per week. Havervlokken en cornflakes kunnen ook worden aangeboden, maar moeten worden afgewisseld met bladeren om schimmeldroogheid te voorkomen.
4. Verwijder bij het aanbieden van nieuwe bladeren kolonieafval en droge bladfragmenten. Vermijd het gebruik van parfums, moisturizers, crèmes of een stof met een sterke geur bij het manipuleren van de koninginnen. Gebruik bovendien latex handschoenen tijdens alle processen.
5. Volg de ontwikkeling van de kolonie en wanneer de schimmeltuin ten minste de helft van het containervolume bereikt, breng de kolonie over naar een kunstmatig permanent nest.
   OPMERKING: Aangezien de ontwikkelingssnelheid inherent is aan elke kolonie, is er geen geschatte tijd voor kolonieoverdracht. Meestal worden kolonies uit de eerste collectie overgebracht naar nesten met schimmeltuinkamer van maximaal 1L volume, vanwege de kleine schimmeltuin.

3. Verzameling van jonge kolonies

1. Verkrijg plastic containers met een volume van ongeveer 500 ml.
2. Identificeer ongeveer 6 maanden na de huwelijksvlucht indicatieve torenvormige heuvels met gegranuleerde bodemdeeltjes (figuur 1) van beginnende Atta-nesten (figuur 2) op de locaties waar eerder gemarkeerde bladsnijdende mieren voorkomen.
   OPMERKING: Zes maanden na de huwelijksvlucht worden de nesten van jonge kolonies geschat op maximaal 1 m diep in de grond. Een nieuwe collectie is in deze periode geïndiceerd om hogere kansen op succesvolle en blijvende kolonies in grote hoeveelheden te bereiken.
3. Graaf met een tuinschoffel de nestingang uit totdat je de kamer met de jonge kolonie bereikt. Verzamel de koningin, schimmeltuin, onvolwassenen en jonge werksters en plaats ze in de plastic container. Voer het verzamelproces zo voorzichtig mogelijk uit.
   OPMERKING: Natuurlijk zal ook een grote hoeveelheid grond worden verzameld en moet deze geleidelijk worden verwijderd in toekomstige onderhoudsprocedures in het laboratorium.
4. Verplaats de plastic dekselcontainers met de kolonies naar de aangewezen gecontroleerde omgeving. Voer het transport van jonge kolonies met uiterste voorzichtigheid uit, vermijd te veel verstoring en behoud van een minimale temperatuurbestendigheid. Manipuleer of verplaats de kolonies gedurende ongeveer 3 dagen om stress te voorkomen. Als de kamer een actieve routine heeft, kan een donkere doek over de kolonies worden gelegd.

Figuur 2. Torenvormige grondheuvel. De karakteristieke torenvormige heuvel duidt op de aanwezigheid van beginnende kolonies van Atta sexdens en Atta laevigata. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Onderhoud van jonge kolonies

1. Zorg 3 keer per week voor dunne jonge bladeren.
   1. Zorg ervoor dat de aangeboden bladeren gezond zijn en dat de planten niet zijn behandeld met insecticiden of andere chemische stoffen. Zorg er in dit stadium voor dat de bladfragmenten minstens 7 cm lang zijn.
      OPMERKING: Havervlokken en cornflakes kunnen ook worden aangeboden, maar moeten worden afgewisseld met bladeren om schimmeldroogheid te voorkomen.
   2. De aanbiedingsfrequentie is afhankelijk van de behendigheid waarmee de werknemers het plantmateriaal op de schimmel verwerken. Omdat de snijactiviteit intens is, verhoogt u het aanbod twee keer per dag drie keer per week of 5 dagen per week.
2. Verwijder bij het aanbieden van nieuwe bladeren kolonieafval, inclusief bodemresten, met behulp van een lepel. Gebruik latex handschoenen tijdens alle processen. Vermijd bij het manipuleren van de jonge kolonies het gebruik van parfums, moisturizers, crèmes of elke stof met een sterke geur.
   OPMERKING: De werknemers zullen zelf de grond en het afval van de schimmel scheiden.
3. Volg de ontwikkeling van de kolonie en wanneer de schimmeltuin ten minste de helft van het containervolume bereikt, breng de kolonie over naar een kunstmatig permanent nest.
   OPMERKING: Aangezien de ontwikkelingssnelheid inherent is aan elke kolonie, is er geen geschatte tijd voor kolonieoverdracht.

Figuur 3: Soorten kunstnesten om Atta sexdens en Atta laevigata kolonies te houden. Illustratie van duurzame kunstmatige nesten van bladsnijdende mieren: gesloten verticale nestopstelling, kloostervormige horizontale nestopstelling en open arenanestopstelling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

5. Duurzame kunstnesten

1. Bereid een verticale nestopstelling voor zoals hieronder beschreven (figuur 3 en figuur 4).
   OPMERKING: Kloosternestconfiguraties moeten altijd verschillende ontvangers hebben om afzonderlijk voor te doen als (1) schimmeltuinkamer, (2) afvalverwijderingskamer en (3) foerageerkamer. In eerste instantie zou het moeten beginnen met drie containers, maar er kunnen meer ontvangers worden toegevoegd om de schimmeltuin te vergroten. De nesten kunnen variëren in grootte en materiaal afhankelijk van hun experimentele doel, hoewel hier het gebruik van doorzichtige materialen wordt beschreven en aanbevolen. De containers moeten zonder openingen zijn, anders zullen de mieren ontsnappen. Het type nest zoals hieronder beschreven kan worden gebruikt voor algemeen onderzoek, maar het wordt niet goed aanbevolen voor assertieve mierenverzameling vanwege de verstoring die wordt veroorzaakt bij het verwijderen van het deksel, wat resulteert in grote agitatie onder de individuen. Niettemin is het vanwege de materiële transparantie mogelijk om de koningin en verschillende mierenkasten te lokaliseren, zelfs als de schimmeltuin de hele container heeft gevuld. Omdat het een tendens is, wordt altijd aangenomen dat de onvolwassenen zich in het midden van de schimmeltuin bevinden wanneer deze het grootste deel van de beschikbare ruimte in verticale containers heeft ingenomen.
   1. Kies een transparante dekselcontainer van ongeveer 1 L en voeg een laag van 1 cm sterk absorberende gipsbasis toe. Dit wordt de schimmeltuinkamer. Selecteer twee doorzichtige deksels van elk ongeveer 500 ml als afvalverwijderings- en foerageerkamers. De mieren zullen kiezen welke kamer elk zal zijn en er daarna voor zorgen dat ze niet worden verwisseld.
      OPMERKING: Volg de instructies van de fabrikant om de gipsbasis voor te bereiden.
   2. Perforeer en verbind de drie containers met een transparante buis of een slang. Breng indien nodig afplaktape aan op de buisrand om een dijverbinding met de containers te garanderen en te voorkomen dat mieren ontsnappen. Plaats de gipsen basiscontainer in het midden en de andere containers aan weerszijden.
   3. Breng de schimmelspons van geselecteerde kolonies (zie stap 2.5 en stap 4.3) voorzichtig samen met de koningin, werksters en onvolwassenen over naar de gipsen basiscontainer. Zorg er vóór de overdracht voor dat de gipsbasis water heeft gekregen. Gebruik latex handschoenen.
2. Bereid een horizontale nestopstelling voor zoals hieronder beschreven (figuur 3 en figuur 4).
   OPMERKING: Nesten met horizontale configuratie maken het mogelijk om de schimmeltuin en de activiteiten van de werknemers er nauwlettend in te zien. Omdat jongere delen van de schimmeltuin zich bovenaan bevinden, is het mogelijk om recent aangeboden substraten te observeren die door de werknemers worden opgenomen. Nieuwe delen van de schimmel kunnen worden opgemerkt door de kleur, die vergelijkbaar is met de kleur van de laatste aangeboden bron, terwijl de oudere porties meestal een beige kleur hebben. Nakomelingen en de koningin kunnen ook gemakkelijk worden gelokaliseerd, omdat ze in horizontale containers meestal bovenaan de schimmeltuin staan, zelfs als deze het grootste deel van de ruimte heeft ingenomen. Deze configuratie kan worden gebruikt voor gedragsgericht onderzoek, focale bemonstering en wetenschappelijke outreach-doeleinden, omdat het perceptie geeft van de organisatie in het nest.
   1. Verkrijg een transparante dekselcontainer met ongeveer 31 cm x 21 cm x 4,5 cm afmetingen en voeg een laag van 1 cm zeer absorberende gipsbasis toe. Dit wordt de schimmeltuinkamer. Selecteer twee doorzichtige deksels van elk ongeveer 500 ml als afvalverwijderings- en foerageerkamers. De mieren zullen kiezen welke kamer elk zal zijn en er daarna voor zorgen dat ze niet worden verwisseld.
      OPMERKING: Volg de instructies van de fabrikant om de gipsbasis voor te bereiden. Sluit indien nodig de kleine ruimte tussen het deksel en de container met afplaktape om te voorkomen dat de mieren ontsnappen.
   2. Perforeer en verbind de containers met een transparante buis of een slang. Breng indien nodig afplaktape aan op de buisrand om een dijverbinding met de containers te garanderen en te voorkomen dat mieren ontsnappen. Plaats de gipsen basiscontainer in het midden en de andere containers aan weerszijden.
   3. Breng de schimmelspons van geselecteerde kolonies (zie stap 2.5 en stap 4.3) voorzichtig samen met de koningin, werksters en onvolwassenen over naar de gipsen basiscontainer. Zorg er vóór de overdracht voor dat de gipsbasis water heeft gekregen. Gebruik latex handschoenen.
3. Bereid een open arenanestopstelling voor zoals hieronder beschreven (figuur 3 en figuur 5).
   OPMERKING: Open arenanesten maken het mogelijk om mieren te verzamelen zonder grote verstoring en analyse van foerageergedrag. Ze kunnen ook een betrouwbare weergave bieden van een kolonie in de natuur voor wetenschappelijke doeleinden.
   1. Kies een transparante dekselcontainer van ongeveer 1 L en voeg een laag van 1 cm sterk absorberende gipslaag toe. Dit wordt de schimmeltuinkamer.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om te beginnen met 1 L-containers en geleidelijk door te geven aan containers met hogere volumes voor een grotere schimmeltuin. De containers mogen echter geen volume van 5 L overwinnen. Voeg zoveel containers toe als nodig is.
   2. Selecteer een open arena. De grootte van de arena kan variëren afhankelijk van studiedoeleinden. Als een grote arena is geselecteerd, plaatst u de containers met de schimmeltuin in het interieur (figuur 5). Sluit deze in het geval van een kleine arena aan op de schimmeltuincontainer met een transparante slang of buis (figuur 3). De arena zal dienen als foerageer- en afvalverwijderingskamer, dus zorg ervoor dat deze niet te klein is.
   3. Breng een laag polytetrafluorethyleenvloeistof in één beweging aan op de arenarand om de mieren te bevatten. Gebruik een katoen gedrenkt met de vloeistof en een nitril handschoen.
      LET OP: Vermijd inademing en aanraking van de huid tijdens het gebruik van polytetrafluorethyleenvloeistof.
   4. Breng de schimmelspons van geselecteerde kolonies (zie stap 2.5 en stap 4.3) voorzichtig samen met de koningin, werksters en onvolwassenen over naar de gipsen basiscontainer. Zorg er vóór de overdracht voor dat de gipsbasis water heeft gekregen. Gebruik latex handschoenen.

Figuur 4: Kunstmatige kloosternesten van de bladsnijdende mieren Atta sexdens en Atta laevigata. Gesloten verticale nestopstelling boven (A) en zijaanzicht (B); gesloten horizontale nestopstelling boven (C) en zijaanzicht (D). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Kunstmatig open arenanest van de bladsnijdende mieren Atta sexdens en Atta laevigata. Open arena nestopstelling van Atta sexdens top (A) en zijaanzicht (B). 1) Schimmel tuinkamers; 2) Afval; 3) Sinaasappelschijfjes; 4) Glas met polytetrafluorethyleen (PTFE) laag. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

6. Onderhoud van ontwikkelde kolonies

1. Bied dagelijks minstens één groot blad aan in de foerageerkamer per kolonie met 1 L schimmeltuin. Als de snijactiviteit van de mieren intens is, verhoog dan het aantal bladeren. Als de schimmel droog is, bevochtig de bladeren dan voor extra vochtigheid. Voer in kloosternesten het offer snel uit om te voorkomen dat de mieren uit de foerageerkamer ontsnappen.
   OPMERKING: Hier worden bladeren verzameld van plantensoorten zoals moerbei (Morus nigra), mango (Mangifera indica), eucalyptus (Eucalyptus sp.), jambolan (Syzygium cumini), hibiscus (Hibiscus sp.), acalypha (Acalypha wilkesiana) en ligustrum (Ligustrum lucidum).
   1. Bied fruit zoals sinaasappel en appel, en haver en cornflakes aan om het dieet te diversifiëren en aan te vullen. Aan grote kolonies met intense foerageeractiviteit, bied dagelijks havervlokken en cornflakes aan, en fruit eenmaal per week. Als dit niet het geval is, bied dan afwisselend vlokken aan met bladeren, maar niet meer dan drie keer per week, en fruit een of twee keer per maand. Pas de hoeveelheid en frequentie van elk voedsel aan op basis van de foerageeractiviteit van de mieren.
   2. Als de hierboven beschreven opties niet beschikbaar zijn, identificeer dan de foerageervoorkeur van de mieren tussen bladeren, bloemen en vruchten van regionale bomen en struiken, of zelfs gecommercialiseerde groenten, granen en andere vlokken. Vermijd het aanbieden van middelen met defensieve chemische verbindingen en pesticiden.
2. Verwijder elke 2 weken alle inhoud van de afvalkamer uit alle kolonies. Verwijder ook werknemers voor populatiecontroledoeleinden. Als de werksters gezonde schimmel overbrengen naar de afvalkamer, zorg er dan voor dat de koningin er niet op zit en verwijder het. Als de hoeveelheid afval die wordt afgevoerd hoog is of als het te vochtig is, verwijder het dan eenmaal per week.
3. Verwijder het materiaal dat niet door de mieren is meegenomen uit de foerageerkamer wanneer u nieuwe aanbiedt en zorg ervoor dat het altijd schoon is.
   1. Als de werknemers gezonde schimmel overbrengen naar de foerageerkamer, verstoor deze dan, laat het deksel van de container open en breng neutraal talkpoeder aan op het oppervlak van de kamerrand. Voer deze procedure alleen uit als er nog wat ruimte op de schimmelkamer is, op deze manier zullen de werknemers de schimmel terug naar de container overbrengen zonder deze of onvolwassenen te verliezen.
4. Als er meer schimmeltuin nodig is, voeg dan nog een gestucte container toe en verplaats er een deel van de schimmelspons in. Totdat de schimmel de helft van de container bereikt, voegt u bladeren toe in de schimmelkamer. De groei van de schimmeltuin moet geleidelijk gebeuren om de koloniebalans niet in gevaar te brengen. Als een grotere container gewenst is, zorg er dan voor dat de schimmel de hele ruimte van de kleinste containers inneemt voordat u deze overbrengt. Kolonieafval en droge bladeren mogen zich niet ophopen in de tuinkamer van de schimmel.
5. Controleer de gipsbasis van de containers, want na verloop van tijd kan deze een donkerbruine kleur krijgen en ineffectief worden door mierenuitscheiding, transport van afvalstoffen en hoge vochtigheidsconcentratie. Ook kunnen sommige kolonies de laag snijden en weggooien. Breng in deze gevallen de schimmeltuin over naar een nieuwe gepleisterde container.

Resultaten

Een stroomdiagram dat het proces van mierenverzameling weergeeft, is weergegeven in figuur 6. Hier worden enkele resultaten weergegeven die zijn verkregen met behulp van het protocol van verzameling, onderhoud en nestopstellingen zoals hierboven beschreven.

Figuur 6: Stroomdiagram voor het verzamelen...

Discussie

Het hier beschreven protocol om bladsnijgantonen in stand te houden is al meer dan drie decennia op een assertieve en repliceerbare manier ontwikkeld en toegepast. Het maakte de ontwikkeling mogelijk van onderzoek dat zou worden beperkt door veldomstandigheden. Daardoor kwamen gezonde mieren en kolonies beschikbaar voor onderzoek op verschillende gebieden zoals vergelijkende morfologie, toxicologie^51,52, histologie⁵³ en microbiologie 54,55...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Entomologic forceps	N/A	N/A	N/A
Glastank	N/A	N/A	Gehard glas, op maat gemaakt
Slang	N/A	N/A	Transparant, PVC 1/2 Inch x 2,0 mm
Latex handschoenen	Descarpack	550301	N/A
Nitril handschoenen	Descarpack	433301	N/A
Open arena	N/A	N/A	Polypropyleenkrat
Gipspoeder	N/A	N/A	Gipspoeder gebruikt in de bouw, moet absorberend zijn
Kunststof containers voor verzameling	Prafesta	Natuurlijk Cód.: 8231/Natuurlijk Cód.: 8262	Met deksel, transparant, polypropyleen
Kunststof containers voor nesten	Prafesta	Uit productie	Polystyreen, hermetisch
Teflon	Dupont	N/A	Polytetrafluorethyleen vloeistof (PTFE Dispertion 30)