Method Article

Geïndustrialiseerde, kunstmatige intelligentie-geleide lasermicrodissectie voor proteomische analyse op microschaal van de tumormicro-omgeving

DOI:

10.3791/64171

⸱

June 3rd, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Women’s Health Integrated Research Center, Gynecologic Cancer Center of Excellence, Department of Obstetrics and Gynecology, Uniformed Services University and Walter Reed National Military Medical Center, 2The Henry M. Jackson Foundation for the Advancement of Military Medicine, 3The John P. Murtha Cancer Center Research Program, Department of Surgery, Uniformed Services University, 4Women’s Health Integrated Research Center, Inova Women’s Service Line, Inova Health System

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een high-throughput workflow voor kunstmatige intelligentie-gedreven segmentatie van pathologie-bevestigde gebieden van belang van gekleurde, dunne weefselsectiebeelden voor verrijking van histologie-opgeloste celpopulaties met behulp van lasermicrodissectie. Deze strategie omvat een nieuw algoritme dat de overdracht van afbakeningen die interessante celpopulaties aangeven, rechtstreeks naar lasermicroscopen mogelijk maakt.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De tumormicro-omgeving (TME) vertegenwoordigt een complex ecosysteem dat bestaat uit tientallen verschillende celtypen, waaronder tumor-, stroma- en immuuncelpopulaties. Om proteoomniveauvariatie en tumorheterogeniteit op schaal te karakteriseren, zijn high-throughput-methoden nodig om selectief discrete cellulaire populaties te isoleren in solide tumormaligniteiten. Dit protocol beschrijft een workflow met hoge doorvoer, mogelijk gemaakt door kunstmatige intelligentie (AI), die beelden van hematoxyline en eosine (H &E) -gekleurde, dunne weefselsecties segmenteert in pathologie-bevestigde regio's die van belang zijn voor selectieve oogst van histologie-opgeloste celpopulaties met behulp van lasermicrodissectie (LMD). Deze strategie omvat een nieuw algoritme dat de overdracht mogelijk maakt van regio's die celpopulaties van belang aangeven, geannoteerd met behulp van digitale beeldsoftware, rechtstreeks naar lasermicroscopen, waardoor meer gemakkelijke collecties mogelijk worden. Succesvolle implementatie van deze workflow werd uitgevoerd, wat het nut van deze geharmoniseerde methode aantoont om selectief tumorcelpopulaties uit de TME te oogsten voor kwantitatieve, multiplexed proteomische analyse door massaspectrometrie met hoge resolutie. Deze strategie integreert volledig met routinematige histopathologische beoordeling, waarbij gebruik wordt gemaakt van digitale beeldanalyse om verrijking van cellulaire populaties van belang te ondersteunen en is volledig generaliseerbaar, waardoor geharmoniseerde oogsten van celpopulaties van de TME mogelijk zijn voor multinomische analyses.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De TME vertegenwoordigt een complex ecosysteem bevolkt door een zeer diverse reeks celtypen, zoals tumorcellen, stromale cellen, immuuncellen, endotheelcellen, andere mesenchymale celtypen en adipocyten, samen met een complexe extracellulaire matrix1. Dit cellulaire ecosysteem varieert binnen en tussen verschillende ziekteorgaanlocaties, wat resulteert in complexe tumorheterogeniteit 2,3. Recente studies hebben aangetoond dat heterogene tumoren en tumoren met een lage tumorcellulaliteit (lage zuiverheid) vaak correleren met een slechte ziekteprognose 2,3.

Om het moleculaire samenspel tussen tumor- en niet-tumorcelpopulaties binnen de TME op schaal te begrijpen, zijn gestandaardiseerde en high-throughput strategieën nodig om selectief verschillende cellulaire populaties te oogsten die van belang zijn voor downstream multinomische analyse. Kwantitatieve proteomica vertegenwoordigt een snel evoluerende en steeds belangrijkere techniek om het begrip van kankerbiologie te bevorderen. Tot op heden heeft het overwicht van studies die proteomics gebruiken dit gedaan met eiwitten geëxtraheerd uit hele tumorweefselpreparaten (bijv. Gecryopeerd), wat leidt tot een tekort aan inzicht in het begrip van heterogeniteit op proteoomniveau in de TME 4,5,6.

De ontwikkeling van strategieën voor het verzamelen van monsters die naadloos integreren met en gebruikmaken van informatie uit klinische pathologieworkflows, zal een nieuwe generatie histologie-opgeloste proteomics mogelijk maken die zeer complementair zijn aan gouden standaard, diagnostische pathologieworkflows. LMD maakt directe en selectieve verzameling van cellulaire subpopulaties of regio's van belang (ROIs) mogelijk door microscopische inspectie van histologisch gekleurd weefsel dunne secties7. Recente grote ontwikkelingen in digitale pathologie en AI-enabled analyse hebben aangetoond dat het mogelijk is om unieke compositorische kenmerken en ROI's binnen de TME op een geautomatiseerde manier te identificeren, waarvan er vele correleren met moleculaire veranderingen en klinische ziektekenmerken, zoals resistentie tegen therapie en ziekteprognose8.

De workflow die wordt beschreven in het hier gepresenteerde protocol maakt gebruik van commerciële softwareoplossingen om selectief tumor-ROI's te annoteren binnen digitale histopathologiebeelden en maakt gebruik van softwaretools die intern zijn ontwikkeld om deze tumor-ROI's over te brengen naar lasermicroscopen voor geautomatiseerde verzameling van discrete cellulaire populaties van belang die naadloos integreert met downstream multinomische analyseworkflows. Deze geïntegreerde strategie vermindert de tijd van de LMD-operator aanzienlijk en minimaliseert de duur waarvoor weefsels bij omgevingstemperatuur moeten zijn. De integratie van geautomatiseerde functieselectie en LMD-oogst met high-throughput kwantitatieve proteomica wordt aangetoond door een differentiële analyse van de TME van twee representatieve epitheliale eierstokkanker histologische subtypen, hooggradige sereuze eierstokkanker (HGSOC) en ovarium clear cell carcinoom (OCCC).

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle onderzoeksprotocollen werden goedgekeurd voor gebruik onder een door de Westerse IRB goedgekeurd protocol "An Integrated Molecular Analysis of Endometrial and Ovarian Cancer to Identify and Validate Clinically Informative Biomarkers" dat wordt beschouwd als vrijgesteld onder de Amerikaanse federale regelgeving 45 CFR 46.102 (f). Alle experimentele protocollen met menselijke gegevens in deze studie waren in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki. Geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle proefpersonen die bij het onderzoek betrokken waren.

LET OP: De volgende reagentia die in het hele protocol worden gebruikt, zijn bekende of vermoedelijke carcinogenen en/of bevatten gevaarlijke materialen: ethanol, DEPC-water, Mayer's Hematoxyline-oplossing, Eosine Y-oplossing, methanol, acetonitril en mierenzuur. Een goede behandeling, zoals beschreven in de respectieve veiligheidsinformatiebladen (SDS), en het gebruik van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM' s) is verplicht.

1. Het genereren van het standaard shape list data (.sld) bestand met calibrator fiducials

OPMERKING: De protocolstappen die in deze sectie worden beschreven, zijn specifiek voor gebruik met een omgekeerde lasermicroscoop en de bijbehorende software (zie de tabel met materialen). Het maken van een standaard .sld-bestand is slechts één keer nodig per lasermicroscoop. Het resulterende bestand kan worden gebruikt voor het snijden van fiducials in alle PEN-dia's die daarna worden gebruikt. Geschatte tijd: 5 min (eenmalig).

  1. Open de LMD-software en laad het polyethyleenntalaatmembraan (PEN) met de voorkant naar beneden op het LMD-podium, met het label het dichtst bij de gebruiker. Schakel het vakje Regel(s) sluiten aan de rechterkant van het programmavenster uit.
  2. Gebruik de PtoP-functie (point to point) onder hoge vergroting (63x) om drie "V"-pijlen te tekenen die als kalibratiefiducialen dienen. Begin bij één extern punt op de V, teken een lijn naar het middelpunt van de V en klik met één klik. Teken vervolgens een tweede lijn van het centrale punt van de V naar het einde van het tweede externe V-punt en dubbelklik om een enkele, niet-gesloten V-vorm van de twee lijnen te maken.
    OPMERKING: Deze kalibratiefiducials moeten in drie hoeken van de dia worden geplaatst: rechtsvoor, rechtsachter, linksachter.
  3. Selecteer de optie AF (autofocus) voordat u gaat knippen . Knip de dia in positie 1, verplaats deze naar elk van de resterende diaposities en traceer nauwkeurig over de kalibratiesneden.
  4. Sla het .sld-bestand op en selecteer de optie Opslaan zonder kalibratie in het pop-upvenster om te voorkomen dat de kalibratiefiducials in het membraan worden gesneden.
    OPMERKING: Een representatief .sld-bestand met standaard kalibratorfiducials voor vier diaposities is opgenomen in Aanvullend bestand 1.

2. LMD dia('s) voorbereiding

OPMERKING: De protocolstappen die in deze sectie worden beschreven, zijn specifiek voor gebruik met een omgekeerde lasermicroscoop en de bijbehorende software (zie de tabel met materialen). Geschatte tijd: 5 min.

  1. Zorg ervoor dat de dia volledig droog is voordat u de referentiekalibratiefiducials snijdt. Open de LMD-software en open het standaard kalibratie-SLD-bestand onder de optie Shapes importeren .
  2. Selecteer de optie AF (autofocus) voordat u gaat knippen . Laad de dia('s) met het weefsel naar beneden gericht en het label schuift dichter bij de operator in de diahouder op het LMD-podium.
  3. Gebruik de lasermicroscoop en het standaard kalibratie -sld-bestand om kalibratiefiducials in het PEN-membraan te snijden.
    1. OPTIONEEL: Snijd de kalibratiefiducialen in het PEN-membraan voor of nadat de weefselsectie(s) op de dia is/worden geplaatst. Als de kalibratiefiducialen worden gesneden voorafgaand aan het plaatsen van het weefsel, zorg er dan voor dat het weefsel en/of het fixatief niet overlappen met de kalibratoren wanneer het weefsel in stap 2.5 op de dia wordt geplaatst. Als kalibratiefiducialen worden gesneden na het plaatsen van het weefsel, stop dan na het voltooien van stap 2.4 en ga verder met rubriek 3.
  4. Bekijk alle kalibratoren afzonderlijk om ervoor te zorgen dat elke snede compleet en zichtbaar is.
    OPMERKING: Gebruik de functie Verplaatsen en knippen om de laser handmatig te richten op kalibratiefiducials die niet volledig door het PEN-membraan zijn gesneden.
  5. Plaats het bevroren of formaline-gefixeerde, paraffine-ingebedde (FFPE) weefselgedeelte op de dia met de kalibratiefiducialen.

3. Weefselkleuring

OPMERKING: Geschatte tijd: 30 min.

  1. Bevestig de bevroren LMD-weefselglaasjes in 70% ethanol (EtOH) met fosfataseremmer cocktailreagentia gedurende 5 minuten.
  2. Was de dia's gedurende 1 min in diethylpyrocarbomaat (DEPC) water dat fosfataseremmer cocktailreagentia bevat.
  3. Was de dia's gedurende 1 min in DEPC-water.
  4. Incubeer de dia's in Mayer's Hematoxylin-oplossing gedurende 3 minuten.
  5. Spoel de dia's gedurende 3 minuten af in DEPC-water.
  6. Spoel de glaasjes in een verse uitwisseling van DEPC-water gedurende 1 min.
  7. Incubeer de dia's in waterige Eosine Y-oplossing gedurende 1 s.
  8. Spoel de dia's 2 x 5 s in 95% EtOH.
  9. Spoel de dia's 3 x 10 s in 100% EtOH.
  10. Veeg de overtollige EtOH van de achterkant van de dia's en laat de dia's aan de lucht drogen.
  11. Bewaar de dia's bij -80 °C als lmd niet onmiddellijk moet worden uitgevoerd.

4. Diabeeldvorming

OPMERKING: De protocolstappen die in deze sectie worden beschreven, zijn specifiek voor gescande dia's (zie de tabel met materialen) en de resulterende afbeeldingen die zijn opgeslagen als SVS-bestanden. Gebruik een scanner en de bijbehorende software die afbeeldingsbestanden genereert in een indeling die de beeldanalysesoftware (zie de tabel met materialen) kan openen. Bestandstypen met piramidale tiffs die worden ondersteund, zijn JPG, TIF, MRXS, QPTIFF, component TIFF, SVS, AFI, SCN, LIF, DCM, OME. TIFF, ND2, VSI, NDPI, NDPIS, CZI, BIF, KFB en ISYNTAX. Geschatte tijd: 5 min.

  1. Schakel de scanner in en open de diascannersoftware. Laad de dia met het weefsel naar boven gericht op de enkele diatrap in de scanner. Zorg ervoor dat de glijbaan volledig droog is en plaats voorzichtig een deklip over het weefsel. Gebruik geen ethanol of dompelolie onder de deklip.
  2. Leg de micrograafafbeelding vast met behulp van instellingen die zijn gekalibreerd om aan te passen voor het PEN-membraan in plaats van de glasachtergrond en om achtergrondmembraanvlekken te negeren, volgens de instructies van de fabrikant.
  3. Pas het afbeeldingsgebied aan door de binnenste groene omtrek te slepen en het formaat ervan te wijzigen om het hele PEN-membraangebied vast te leggen, indien nodig. Voeg vier scherpstelpunten toe aan het weefsel door te dubbelklikken op de snapshot-overzichtsafbeelding en drie scherpstelpunten op het membraan in de buurt van de kalibratiefiducials (één scherpstelpunt per elk van de drie kalibratiefiducialen).
    OPMERKING: De vier scherpstelpunten kunnen bijna overal op het weefselgedeelte worden geplaatst, hoewel het plaatsen op weefsel dat te donker gekleurd is en zwart lijkt, ertoe kan leiden dat de scan mislukt.
  4. Selecteer in het menu Beeld de optie Videomonitor. Pas de scherpstelling handmatig aan met behulp van de schuifregelaar fijn en/of macrofocus, indien nodig, voor elk punt rond het LMD-weefsel. Leg de beeldscan vast onder hoge vergroting (20x). Controleer of alle kalibratiefiducials zichtbaar en duidelijk zijn in de opgeslagen afbeelding.

5. Geautomatiseerde selectie van functies met behulp van beeldanalysesoftware

  1. Voor hele tumorcollecties (geschatte tijd: 5 min; gevalsafhankelijk):
    1. Open de beeldanalysesoftware (zie de materiaaltabel). Selecteer Afbeeldingen openen en selecteer in het pop-upvenster het SVS-afbeeldingsbestand dat is gegenereerd door de dia op de AT2-scanner te scannen.
      OPMERKING: Een representatief .svs-afbeeldingsbestand is opgenomen in Aanvullend bestand 2.
    2. Navigeer naar het tabblad Annotaties . Selecteer het gereedschap Pen op de werkbalk Annotatie en teken een vorm rond het weefsel.
    3. Selecteer de vorm en klik met de rechtermuisknop op de afbeelding. Selecteer in het vervolgkeuzemenu Geavanceerd de optie Partitioneren (betegeld).Select In het vervolgkeuzemenu Geavanceerd. Stel de tegelgrootte en ruimte tussen respectievelijk 500 en 40 in en selecteer OK om de tegels te genereren. Selecteer en verwijder de omtrekvorm die is gebruikt om de tegels te genereren in stap 5.1.2.
    4. Selecteer het vervolgkeuzemenu Laagacties | Exporteren om de betegelde annotaties op te slaan als een ANNOTATIEBESTAND.
      OPMERKING: Een representatief .annotatiebestand voor een hele tumorweefselverzameling is opgenomen in Aanvullend bestand 3.
    5. Maak een map voor de sessie of het project en sla het ANNOTATIEBESTAND op in een submap met de unieke id voor de dia.
    6. Navigeer naar het tabblad Annotaties . Selecteer de vervolgkeuzelijst Laagacties | Verwijder alle lagen om alle annotaties uit de afbeelding te verwijderen. Selecteer het pengereedschap en teken een korte lijn vanaf de binnenste punt van de pijlpunt voor elke kalibratiefiducial. Teken de lijnen van de markeringen in de volgende volgorde: linksboven, rechtsboven, rechtsonder.
    7. Selecteer het vervolgkeuzemenu Laagacties | Exporteren om de regelannotaties op te slaan als een ANNOTATIEBESTAND. Voeg _calib toe aan de bestandsnaam en plaats het bestand in de submap met de coördinaten voor de betegelde vormen.
      OPMERKING: Een representatief _calib.annotatiebestand is opgenomen in aanvullend bestand 4.
    8. Kopieer het adres voor het hoofdproject of de hoofdmap van de sessie. Open het XML-importgenererende script "Malleator" (beschikbaar via https://github.com/GYNCOE/Mitchell.et.al.2022) met behulp van de geïntegreerde IDLE-ontwikkelomgeving en plak het adres van de projectmap tussen de aanhalingstekens onder aan het script.
    9. Selecteer het vervolgkeuzemenu Uitvoeren | Voer Module uit om het script uit te voeren.
      OPMERKING: De .xml LMD-importbestand wordt gegenereerd in de submap die voor de afbeelding/dia is gemaakt. Een representatief .xml dossier wordt verstrekt in aanvullend dossier 5.
  2. Alleen voor lmd-verrijkte collecties (geschatte tijd: 15 min; afhankelijk van de zaak):
    1. Open de beeldanalysesoftware (zie de materiaaltabel). Selecteer Afbeeldingen openen en selecteer in het pop-upvenster het SVS-afbeeldingsbestand dat is gegenereerd door de dia te scannen.
    2. Navigeer naar het tabblad Annotaties . Selecteer en gebruik het gereedschap Rechthoekannotatie om een vak rond het weefsel te tekenen.
    3. Selecteer de annotatie van het vak en klik met de rechtermuisknop op de afbeelding. Selecteer het vervolgkeuzemenu Geavanceerd | Partitionering (betegeld) optie. Stel de tegelgrootte en ruimte tussen respectievelijk 500 en 40 in en selecteer OK om de tegels te genereren. Selecteer en verwijder de annotatie van het omtrekvak die wordt gebruikt om de tegels in stap 5.2.2 te genereren.
    4. Selecteer het vervolgkeuzemenu Laagacties | Exporteren om de betegelde annotaties op te slaan als een ANNOTATIEBESTAND.
    5. Plaats een opgeslagen kopie van het Python "Dapọ" (beschikbaar via https://github.com/GYNCOE/Mitchell.et.al.2022) algoritme, ontwikkeld om de AI-geclassificeerde annotatielagen samen te voegen, in dezelfde map als het betegelde annotatiesbestand.
    6. Kopieer de naam van het betegelde annotatiebestand. Open het Python-programma met behulp van de geïntegreerde IDLE-ontwikkelomgeving en plak de naam van het betegelde annotatiebestand tussen de aanhalingstekens onder aan het programma.
    7. Selecteer het vervolgkeuzemenu Uitvoeren | Module uitvoeren. Wacht tot er een nieuw bestand is gegenereerd waarin alle betegelde annotaties onder één laag zijn samengevoegd.
    8. Open de software voor afbeeldingsanalyse en navigeer naar het tabblad Annotaties . Selecteer het vervolgkeuzemenu Laagacties | Verwijder alle lagen om alle annotaties uit de afbeelding te verwijderen.
    9. Selecteer het vervolgkeuzemenu Laagacties | Importeer lokaal annotatiebestand. Selecteer in het pop-upvenster het samengevoegde ANNOTATIEBESTAND dat door het script is gegenereerd. Zorg ervoor dat alle geïmporteerde tegels zich onder dezelfde annotatielaag bevinden.
    10. Navigeer naar het tabblad Classifier en volg de instructies van de fabrikant om vormen voor de ROI's te genereren. Voordat u de classifier uitvoert, selecteert u de gewenste annotatielaag(en) (d.w.z. de tumor- of stromalaag) door het vakje of de ROI-vakjes op het tabblad Annotaties onder de Geavanceerde classificatieopties aan te vinken. Gebruik de optie Annotatielaag in het menu Acties van classifier om de classifier uit te voeren.
    11. Zodra de Classifier-analyse is voltooid, navigeert u naar het tabblad Annotaties en selecteert u de annotatielaag die op basis van de analyse is gegenereerd. Selecteer het vervolgkeuzemenu Laagacties | Verwijder alle lagen maar huidig om alle andere annotatielagen uit de afbeelding te verwijderen.
    12. Selecteer het vervolgkeuzemenu Laagacties | Exporteren om de annotaties op te slaan als een ANNOTATIEBESTAND. Maak een map voor de sessie of het project en sla het ANNOTATIEBESTAND op in een submap met de unieke id voor de dia.
      OPMERKING: Een representatief .annotatiebestand voor een geclassificeerde LMD-verrijkte weefselverzameling is opgenomen in aanvullend dossier 6.
    13. Navigeer naar het tabblad Annotaties, selecteer de vervolgkeuzelijst Laagacties | Verwijder alle lagen om alle annotaties uit de afbeelding te verwijderen. Selecteer het pengereedschap en teken een korte lijn van elke kalibratiefiducial. Teken lijnen uit de markeringen in de volgende volgorde: linksboven, rechtsboven, rechtsonder.
    14. Selecteer het vervolgkeuzemenu Laagacties | Exporteren om de regelannotaties op te slaan als een ANNOTATIEBESTAND. Voeg _calib toe aan de bestandsnaam en plaats het bestand in de submap met de coördinaten voor de betegelde vormen.
    15. Kopieer het adres voor het hoofdproject of de hoofdmap van de sessie. Open het XML-importgenererende script "Malleator" (beschikbaar via https://github.com/GYNCOE/Mitchell.et.al.2022) met behulp van de geïntegreerde IDLE-ontwikkelomgeving en plak vervolgens het adres van de projectmap tussen de aanhalingstekens onder aan het script.
    16. Selecteer het vervolgkeuzemenu Uitvoeren | Voer Module uit om het script uit te voeren.
      OPMERKING: De .xml LMD-importbestand wordt gegenereerd in de submap die voor de afbeelding/dia is gemaakt.

6. Laser microdissectie

OPMERKING: De protocolstappen die in deze sectie worden beschreven, zijn specifiek voor gebruik met een omgekeerde lasermicroscoop en de bijbehorende software (zie de tabel met materialen). Geschatte tijd: 2 uur; afhankelijk van de zaak.

  1. Laad de gemarkeerde membraanschuif (met kalibratiefiducialen) met het weefsel naar beneden gericht en de labelzijde dichter bij de operator in de diahouder op de lasermicroscooptrap.
  2. Selecteer Shapes importeren in het vervolgkeuzemenu Bestand . Selecteer het .xml LMD-importbestand dat voor de dia is gegenereerd. Selecteer Nee in het pop-upvenster om te voorkomen dat referentiepunten uit het bestand worden geladen en Nee in het tweede pop-upvenster om te voorkomen dat eerder opgeslagen referentiepunten worden gebruikt voor kalibratie.
  3. Volg de aanwijzingen van de LMD-toepassing en lijn het kalibratiekruis uit op elk van de drie kalibratiefiducials op de dia. Zoek naar kalibratiefiducials die linksboven, rechtsboven en rechtsonder in de diaafbeelding in de afbeeldingsanalysesoftware worden weergegeven en die overeenkomen met referentiepunten in respectievelijk de rechtervoor-, rechter- en linkerachterhoek van de omgekeerde LMD-dia op het microscooptrapwerk. Schakel tussen het gebruik van de 5x objectieflens om te lokaliseren en het 63x objectief om elke kalibratie fiducial uit te lijnen. Selecteer Nee in het pop-upvenster om te voorkomen dat de referentiepunten worden opgeslagen in het bestand en OK in het tweede pop-upvenster om te bevestigen dat de dia is ingevoegd.
  4. Verplaats de lens met 5x objectief in positie en selecteer Ja in het pop-upvenster om de werkelijke vergroting te gebruiken. Zodra de geïmporteerde vormen worden weergegeven, richt u de camera op het weefsel.
  5. Markeer en selecteer alle vormen in het venster Lijst met vormen , sleep ze op hun plaats met behulp van een of twee annotaties binnen het gezichtsveld als verwijzingen en lijn de verticale z-as uit om met de laser te snijden.
  6. Bekijk de geïmporteerde vormen en wijs ze toe aan de juiste buispositie voor verzameling. Druk op Start Cut om de laser te starten.
    OPMERKING: Geïmporteerde vormen in het .xml bestand worden automatisch toegewezen aan de positie "no cap" in het venster Shapes List . Om weefsel te oogsten, moeten de geïmporteerde vormen opnieuw worden toegewezen aan een positie met een geladen buis.

7. Eiwitvertering door drukcyclustechnologie (PCT)

OPMERKING: Geschatte tijd: 4 uur (3 uur zonder droogtijd vacuümcentrifuge).

  1. Plaats 0,5 ml buizen met de afgedekte PCT MicroTubes met LMD geoogst weefsel in 20 μL van 100 mM TEAB/10% acetonitril in een thermocycler en verwarm gedurende 30 minuten op 99 °C en koel vervolgens gedurende 10 minuten af tot 50 °C.
  2. Draai de buizen gedurende 30 s op 4.000 × g en verwijder vervolgens de MicroTubes uit de buizen van 0,5 ml. Verwijder met het MicroCap-gereedschap de MicroCaps van de PCT MicroTubes en gooi ze weg. Voeg trypsine (zie de tabel met materialen) toe in een verhouding van 1 μg per 30 mm2 weefsel en plaats een MicroPestle in de MicroTube met behulp van de MicroCap-tool.
  3. Breng de MicroTubes over in een barocycler cartridge en monteer de complete cartridge. Plaats de patroon in de barocycler drukkamer en zet het deksel vast. Barocycle bij 45.000 psi voor 50 s en atmosferische druk voor 10 s bij 50 °C voor 60 cycli.
  4. Zodra barocycling is voltooid, brengt u de microbuizen over naar een microcentrifugebuis van 0,5 ml en centrifugeert u gedurende 2 minuten bij 4.000 × g.
  5. Verwijder de MicroTube uit de microcentrifugebuis van 0,5 ml met behulp van het dopgereedschap. Verwijder de stamper voorzichtig met behulp van het dopgereedschap en spoel de onderste helft van de stamper af met 20 μL vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS) -kwaliteit water en verzamel de was in een schone microcentrifugebuis van 0,5 ml.
  6. Tik voorzichtig op de MicroTube op de bovenkant van de bank om de vloeistof naar de bodem te verplaatsen en breng alle oplossing van de MicroTube over in de microcentrifugebuis van 0,5 ml.
  7. Voeg 20 μL water van LC-MS-kwaliteit toe aan de MicroTube en tik het zachtjes op de bovenkant van de bank. Breng de wasoplossing over in de buis van 0,5 ml en herhaal deze wasstap nogmaals.
  8. Vacuümcentrifuge om de monsters te drogen tot ~2 μL en voeg 100 μL van 100 mM TEAB toe, pH 8,0.
  9. Bepaal de peptideconcentratie met behulp van een colorimetrische assay (bicinchoninic acid (BCA) assay; zie de Tabel van Materialen) volgens het protocol van de fabrikant.

8. Tandem-mass tag (TMT) labeling en EasyPep opschonen

OPMERKING: Geschatte tijd: 7 h 20 min (2 h 20 min zonder vacuümcentrifuge droogtijd).

  1. Breng de isobare TMT-etiketteringsreagentia voor opening op kamertemperatuur. Voeg 500 μL 100% acetonitril toe aan elke TMT-injectieflacon (5 mg). Incubeer gedurende 10 minuten met af en toe vortexing.
  2. Los 5 μg van het peptidemonster op in 100 μL van 100 mM TEAB, pH 8,0, en voeg 10 μL van een bepaald TMT-reagens toe. Construeer en neem referentiepools op die elk individueel monster in het experiment vertegenwoordigen in elke TMT-multiplexset van monsters om kwantificering van monsters over meerdere TMT-multiplexente vergemakkelijken 9. Incubeer reacties gedurende 1 uur bij omgevingstemperatuur met af en toe schudden/tikken.
  3. Doof de TMT-etiketteringsreactie door 10 μL 5% hydroxylamine toe te voegen en gedurende 30 minuten bij omgevingstemperatuur te incuberen met af en toe tikken. Na het blussen combineert u de TMT-gelabelde monsters in één buis en droogt u tot ongeveer 200 μL.
  4. Voeg 1.800 μL mierenzuur toe. Controleer de pH met pH-papier: als pH ~ 3, voeg 1 ml mierenzuur toe; als de pH >3, voeg dan 10-20 μL van 5% mierenzuur toe tot pH ~3. Voeg 0,1% mierenzuur toe om het uiteindelijke volume van 3 ml te bereiken.
  5. Verwijder het lipje onderaan de Peptide Clean-up Column, verwijder de dop en plaats deze in een conische buis van 15 ml. Breng het TMT-gelabelde monster over naar de kolom en ga verder met opruimen volgens het protocol van de fabrikant.
  6. Vacuümcentrifugeer om de geëlueerde peptiden te drogen tot ~ 20 μL, breng over naar een LC-injectieflacon met 25 mM ammoniumbicarbonaat voor een laatste volume van 80 μL en ga over tot offline fractionering.

9. TMT multiplex sample fractionering en pooling

OPMERKING: Geschatte tijd: 3 h 30 min (1 h 30 min zonder vacuümcentrifuge droogtijd).

  1. Fractioneer de TMT-gelabelde peptidemultiplexen door basische omgekeerde fasechromatografie in 96 fracties door een toenemende lineaire gradiënt (0,69% min-1) van mobiele fase B (acetonitril) te ontwikkelen tot mobiele fase A (10 mM NH4HCO3, pH 8,0).
  2. Genereer 36 aaneengeschakelde fracties door monsterputten te poolen. Vacuümcentrifugeer om fracties te drogen tot ~2 μL en resuspendeer in 25 mM ammoniumbicarbonaat (eindconcentratie 1,5 μg/10 μL), centrifugeer bij 15.000 × g gedurende 10-15 minuten en breng over naar LC-injectieflacons voor MS-analyse.

10. Vloeistofchromatografie tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS)

OPMERKING: Geschatte tijd: Instrumentmethode en experimenteel ontwerp afhankelijk.

  1. Kalibreer de massaspectrometer volgens de instructies/protocollen van de fabrikant.
  2. Bereid verse mobiele fasen en normen voor en voer passende LC-pre-runpreparaten uit (inclusief maar niet beperkt tot spoelmiddelen, spoellucht en lektestscripts voor het instrument waarnaar wordt verwezen [zie de materiaaltabel]). Equilibrate voor- en analytische kolommen en monsterlus voorafgaand aan het starten van analyses.
  3. Voorafgaand aan en tussen seriële TMT-multiplexanalyses, valideren dat het LC-MS-systeem voldoet aan eerder gebenchmarkte prestatiemetingen met behulp van kwaliteitsborging / kwaliteitscontrole (QA / QC) TMT-gelabelde peptide-digests en (bijv. MSPE (zie de tabel met materialen), HeLa).
  4. Laad autosampler injectieflacons op de juiste posities in de LC autosampler. Analyseer individuele fracties met een geschikte gradiënt/MS-methode. Wissel ongeveer eenmaal daags een "wash"-run af met de peptidestandaard (bijv. peptideretentietijdkalibratie [PRTC]) om chromatografische en massaspectrale prestaties te evalueren. Na de analyse van elke TMT multiplex sample fraction-serie, voert u QA/QC TMT-benchmarkstandaarden uit om de systeemprestaties te evalueren.
  5. Voer massaspectrometerevaluatieroutines uit na QA/QC TMT-benchmarkstandaarden om de prestaties na het monster te beoordelen en kalibreer vervolgens het systeem zoals in stap 10.1 voor de volgende monsterset.

11. Bioinformatische data-analyse

OPMERKING: Geschatte tijd: Experimenteel ontwerp afhankelijk.

  1. Breng alle voorbeeldgegevens (bijv. .raw bestanden) over naar een geschikt netwerkopslag-/computerstation.
  2. Doorzoek alle fracties samen met behulp van de gewenste data-analysetoepassing (bijv. Proteome Discover, Mascot) met behulp van geschikte parameters9 tegen een soortspecifieke eiwitreferentiedatabase om peptidespectrale matches (PSM's) te genereren en TMT-reporterionsignaalintensiteiten te extraheren. Filter PSM's op basis van geschikte kwaliteitscontrolestatistieken en aggregeer genormaliseerde, mediane log2-getransformeerde TMT-reporter-ionverhoudingen in wereldwijde eiwitniveau abundanties, zoals eerder beschreven 3,9.
  3. Vergelijk eiwitveranderingen in interessante omstandigheden met behulp van de gewenste differentiële analysesoftware.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vers ingevroren weefsel dunne secties van twee HGSOC- en twee OCCC-patiënten werden geanalyseerd met behulp van deze geïntegreerde AI-gestuurde weefsel ROI-identificatie, segmentatie, LMD en kwantitatieve proteomische analyseworkflow (figuur 1). Representatieve H &E-gekleurde weefselsecties voor elke tumor werden beoordeeld door een door de raad gecertificeerde patholoog; tumorcellulaliteit varieerde van 70% tot 99%. Weefsels werden dun gesneden op PEN-membraandia's (Supplemental File 2) en voorgesneden met calibratorfiducialen (Supplemental File 1), waardoor integratie van positionele oriëntatiegegevens van annotaties gegenereerd in de beeldanalysesoftware (zie de Tabel van materialen) met Cartesiaanse coördinatenoriëntatie in de LMD-software mogelijk werd. Na H&E-kleuring werden beelden met hoge resolutie (20x) van de PEN-dia's met het weefsel plus kalibratoren vastgelegd.

Tumor- en stromale celpopulaties in de micrografieën werden gesegmenteerd met behulp van beeldanalysesoftware (zie de tabel met materialen) voor selectieve oogst door LMD, samen met oogsten die de volledige dunne sectie van het weefsel vertegenwoordigen (bijv. Volledig tumorweefsel) (figuur 1). Niet-discriminerende annotaties voor hele tumorweefselcollecties werden gegenereerd door het hele weefselgedeelte te verdelen met tegels van 500 μm2, waardoor een opening van 40 μm tussen tegels overbleef om de integriteit van het PEN-membraan te behouden en te voorkomen dat het membraan tijdens LMD krulde. Op dia's voor histologie-opgeloste LMD-verrijking werd de AI-classificator in de beeldanalysesoftware (zie de Tabel van Materialen) getraind om onderscheid te maken tussen tumor- en stromale cellen, samen met de lege glazen dia-achtergrond. Representatieve tumor-, stroma- en blanco glasgebieden werden handmatig gemarkeerd en de classificatortool werd gebruikt om deze ROI's in het hele weefselgedeelte te segmenteren. De gesegmenteerde lagen die volledig weefsel, tumorepitheel en stroma vertegenwoordigen, werden afzonderlijk opgeslagen als afzonderlijke ANNOTATIEBESTANDEN (aanvullend bestand 3 en aanvullend bestand 6). In een afzonderlijke kopie van het afbeeldingsbestand (zonder de gepartitioneerde ROI-annotaties) werd een korte lijn vanaf de middelste punt van elk van de drie fiduciële kalibratoren geannoteerd en opgeslagen als een .annotatiebestand met dezelfde bestandsnaam als elk van de LMD-annotatielaagbestanden, maar toegevoegd met het achtervoegsel "_calib" (Aanvullend bestand 4). Deze lijnen werden gebruikt om de positie van de PEN-membraankalibratoren te co-registreren met de annotatievormlijstgegevens die in de beeldanalysesoftware zijn getekend.

De huidige studie biedt twee algoritmen, "Malleator" en "Dapọ" in Python om deze AI-gestuurde LMD-workflow te ondersteunen, die beschikbaar zijn op https://github.com/GYNCOE/Mitchell.et.al.2022. Het Malleator-algoritme haalt de specifieke Cartesiaanse coördinaten voor alle individuele annotaties (tissue ROI en kalibratoren) uit de gekoppelde .annotatiebestanden en voegt deze samen tot één XML-importbestand (Extensible Markup Language) (Supplemental File 5). Het Malleator-algoritme gebruikt met name de mapnaam van een bovenliggende map als invoer om alle submapmappen te doorzoeken en genereert .xml bestanden voor submappen die nog geen .xml samengevoegd bestand hebben. Het Malleator-algoritme voegt alle annotatielagen in de beeldanalysesoftware (zie de tabel met materialen) samen in één laag en converteert de door AI gegenereerde vormlijstgegevens, die worden opgeslagen als het eigen .annotatiebestandstype, naar .xml indeling die compatibel is met de LMD-software. Na het samenvoegen van de annotatie- en kalibratorbestanden wordt het door het algoritme gegenereerde .xml bestand opgeslagen en geïmporteerd in de LMD-software. Kleine aanpassingen zijn nodig om de uitlijning van annotaties handmatig aan te passen, wat ook dient om de verticale (z-vlak) positie van de diatrap op de lasermicroscoop te registreren. Het Dapọ-algoritme wordt specifiek gebruikt voor LMD-verrijkte collecties. Gepartitioneerde tegels worden automatisch toegewezen aan afzonderlijke annotatielagen door de beeldanalysesoftware. Het Dapọ-algoritme voegt alle gepartitioneerde tegels samen in één annotatielaag voordat het Classifier-gereedschap wordt gebruikt, waardoor de classifier-analyseruntijd voor lmd-verrijkte collecties wordt verkort.

De hele tumor en LMD-verrijkte weefselmonsters werden verteerd, gelabeld met TMT-reagentia, gemultiplext, offline gefractioneerd en geanalyseerd via kwantitatieve MS-gebaseerde proteomics zoals eerder beschreven9. De gemiddelde peptideopbrengst (43-60 μg) en herstel (0,46-0,59 μg/mm2) voor monsters die met deze AI-gestuurde workflow werden geoogst, waren vergelijkbaar met eerdere rapporten 9,10. Een totaal van 5.971 eiwitten werden mede gekwantificeerd over alle monsters (aanvullende tabel S1). Unsupervised hiërarchische clustering met behulp van de 100 meest variabele eiwitten resulteerde in segregatie van de HGSOC- en OCCC-histotypen van de LMD-verrijkte en hele tumormonsters (figuur 2A), vergelijkbaar met die eerder beschreven11. Daarentegen clusterden de LMD-verrijkte stromamonsters van zowel HGSOC als OCCC samen en onafhankelijk van de LMD-verrijkte tumor en hele tumormonsters. Van de 5.971 gekwantificeerde eiwitten waren er 215 significant veranderd (LIMMA adj. p < 0,05) tussen hele tumorcollecties van HGSOC- en OCCC-specimens (aanvullende tabel S2). Deze veranderde eiwitten werden vergeleken met die geïdentificeerd om HGSOC- en OCCC-tumorweefsel te differentiëren door Hughes et al.11. Van de 76 kenmerkende eiwitten gekwantificeerd door Hughes et al., werden er 57 mede gekwantificeerd in deze dataset en waren sterk gecorreleerd (Spearman Rho = 0,644, p < 0,001) (figuur 2B).

figure-results-1
Figuur 1: Samenvatting van de geïntegreerde workflow voor geautomatiseerde weefselgebied van belang selectie voor laser microdissectie voor downstream kwantitatieve proteomics. Kalibratiefiducials worden op PEN-membraanglaasjes gesneden om positionele oriëntatiegegevens van AI-afgeleide segmenten van weefsel-ROI samen te registreren in de beeldanalysesoftware HALO, met horizontale positionering op de LMD-microscoop. Het Malleator-algoritme wordt gebruikt om de geannoteerde segmentatiegegevens over alle annotatielagen voor een dia samen te voegen met het _calib referentiebestand en om deze te converteren naar een .xml bestand dat compatibel is met de LMD-software. LMD-geoogst weefsel voor proteomische analyse wordt verteerd en geanalyseerd door kwantitatieve proteomica met hoge doorvoer zoals eerder beschreven9. Afkortingen: LMD = laser microdissectie; ROI = regio van belang; TMT = tandem massa tag; Kwantificeren = kwantificering; Ident. = identificatie; LC-MS/MS = vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Analyse van de eiwitten in LMD-verrijkte en hele tumormonsters. (A) Niet-gecontroleerde hiërarchische clusteranalyse van de 100 meest variabel overvloedige eiwitten in HGSOC- en OCCC LMD-verrijkte en hele tumormonsters. (B) Correlatie van log2 fold-change eiwitrijkdom tussen HGSOC en OCCC hele tumoroogsten in de huidige studie (Mitchell et al., x-axis) en een vergelijkbare studie door Hughes et al. (y-as)11. Afkortingen: LMD = laser microdissectie; HGSOC = hooggradige sereuze eierstokkanker; OCCC = ovarium clear cell carcinoom; log2FC = log2-getransformeerde proteomische abundantie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende tabel S1: Abundanties van 5.971 eiwitten die medekwantificeerd zijn in alle LMD-verrijkte en hele tumormonsters van HGSOC- en OCCC-weefselmonsters. Afkortingen: LMD = laser microdissectie; HGSOC = hooggradige sereuze eierstokkanker; OCCC = ovarium clear cell carcinoom. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende tabel S2: Differentieel tot expressie gebrachte eiwitten (215) in hele tumorcollecties van HGSOC versus OCCC (LIMMA adj. p < 0,05). Afkortingen: HGSOC = hooggradige sereuze eierstokkanker; OCCC = ovarium clear cell carcinoom. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullend bestand 1: Bestand met representatieve vormlijstgegevens (.sld) met standaardkalibratorfiducialen voor vier diaposities. Het bestand kan worden geïmporteerd in de LMD-software. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: Representatief .svs-beeldbestand van een H&E-gekleurd weefselgedeelte met hoge resolutie (20x). Het bestand kan worden geopend en bekeken met behulp van beeldanalysesoftware of LMD-software. Afkorting: H&E = hematoxyline en eosine; LMD = laser microdissectie. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 3: Representatief .annotatiebestand van gepartitioneerde hele tumorsegmenten. Het bestand kan worden geïmporteerd in beeldanalysesoftware. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 4: Representatieve _calib.annotatiebestand van calibratorfiduciële segmenten. Coördinateninformatie vertegenwoordigt de oosterse positionering van de korte kalibratorlijnen die uit elke pijlpunt fiduciaal zijn getrokken. Het bestand kan worden geïmporteerd in beeldanalysesoftware. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 5: Representatief .xml-bestand (Extensible Markup Language) gegenereerd door het Malleator-algoritme. Het bestand kan worden geïmporteerd in de laser microdissectie software. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 6: Representatief .annotatiebestand van gepartitioneerde AI-geclassificeerde segmenten voor LMD-verrijkte collecties. Het bestand kan worden geïmporteerd in beeldanalysesoftware. Afkortingen: AI = kunstmatige intelligentie; LMD = laser microdissectie. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hoewel er meerdere onderzoeks precedenten zijn geweest gericht op het ontwikkelen en/of verbeteren van workflows voor verrijking van doelcellulaire subpopulaties uit FFPE en/of vers ingevroren weefsels en methodologieën voor het handhaven van de monsterkwaliteit tijdens de verwerking 9,12,13,14,15, bestaat er een aanzienlijke behoefte aan het ontwikkelen van geautomatiseerde strategieën voor het voorbereiden van klinische weefselmonsters voor moleculaire analyses om variabiliteit te verminderen en de reproduceerbaarheid te vergroten. Deze workflow beschrijft een gestandaardiseerd, semiautomatiseerd protocol dat bestaande softwaretools voor beeldanalyse integreert (zie de tabel met materialen) voor histologie-opgeloste oogst van discrete celpopulaties door LMD uit klinische weefselmonsters.

Ruimtelijk opgeloste LMD-verrijking van ROIs die discrete celpopulaties vastleggen, vertegenwoordigt een volgende generatie weefselverwerkingsstap voorafgaand aan multinomische analyses om moleculaire karakterisering en identificatie te verbeteren en celselectieve biomarkerontdekking te vergemakkelijken. Dit protocol verbetert bestaande methodologieën door de vaak lange blootstelling van weefselsecties aan de omgeving te verminderen die wordt geassocieerd met handmatige segmentatie van ROI door een histoloog (die >1-2 uur kan duren voorafgaand aan de LMD-verzameling). Deze workflow maakt het in plaats daarvan mogelijk om ROI vooraf te identificeren door AI-gestuurde classificatie en segmentatie. Het beperken van de verblijftijd van weefsel zal valse variaties verminderen in de beoordelingen van zeer labiele moleculaire doelen, zoals fosfopeptiden en mRNA, of voor op antilichamen gebaseerde analytische technieken die afhankelijk zijn van een doeleiwit in zijn oorspronkelijke conformatie voor detectie.

Het snijden van nette kalibratorfiducials op de PEN-membraandia die duidelijk zichtbaar zijn in de gescande diaafbeelding is een van de belangrijkste componenten die de integratie van de beeldanalysesoftware (zie de tabel met materialen) met de LMD-workflow mogelijk maken. Door ervoor te zorgen dat de kalibratoren een nauwkeurig ("schoon") punt hebben aan de onderkant van de "V"-vorm, kan een nauwkeurig punt in de beeldanalysesoftware worden geselecteerd voor de kalibratorlijnen waaruit moet worden getrokken, zoals beschreven in stappen 5.1.6 en 5.2.13. Uitlijning van deze punten tijdens het importeren in de LMD-software is van cruciaal belang voor het correct overlappen van de annotaties (vergemakkelijkt door het genereren van een compatibel .xml bestand met behulp van de "Malleator" en / of "Dapọ" -algoritmen) op de relevante weefsel-ROI op de fysieke LMD-dia. Het is noodzakelijk om alle vormen te markeren en gezamenlijk "slepen en neerzetten" op zijn plaats, zelfs wanneer de uitlijning nauwkeurig is bij het importeren in de LMD-software om de verticale (z-plane) positie van de diatrap op de lasermicroscoop te registreren. Kleine aanpassingen aan de positionering van de annotaties over de weefsel-ROI kunnen ook tijdens deze stap worden gemaakt, indien nodig.

Een beperking van de huidige versie van het Malleator-algoritme is dat het niet compatibel is met de vooraf gedefinieerde annotatievormtools die door de beeldanalysesoftware worden geleverd (zie de tabel met materialen), hoewel toekomstige updates / versies van het algoritme erop gericht zullen zijn deze compatibiliteit te verbeteren. Het .annotatiebestand voor vormen die met deze gereedschappen zijn getekend, bevat slechts twee sets gekoppelde x- en y-coördinaten voor elke annotatie, zonder de volledige ruimtelijke oriëntatie rond die punten. Het huidige gebruik van deze hulpprogramma's resulteert erin dat de annotaties worden geconverteerd naar rechte lijnen die tijdens het importproces door slechts twee punten worden gedefinieerd. Handmatige definitie van weefsel ROI-segmenten is vereist voor een succesvolle conversie naar XML-indeling en LMD-import. Dit kan worden uitgevoerd door elke ROI handmatig te definiëren met individuele polygonale annotaties uit de vrije hand die specifiek zijn voor het doelgebied of door een geschatte cirkelvormige of rechthoekige annotatie toe te passen op alle weefsel-ROI-segmenten, indien gewenst, en zal compatibel zijn met deze workflow.

Hoewel de hier gepresenteerde workflow werd gedemonstreerd voor proteomische analyse van vers ingevroren menselijke kankerweefselmonsters, kan deze AI-gestuurde LMD-workflow gelijkwaardig worden gebruikt met FFPE-weefsels, niet-kankerachtige weefseltypen en die van niet-menselijke bronnen. Het kan ook andere downstream moleculaire profileringsworkflows ondersteunen, waaronder transcriptomische, genomische of fosfoproteomische analyses. Deze workflow kan ook gebruikmaken van andere toepassingen van de beeldanalysesoftware (zie de tabel met materialen), inclusief mogelijkheden die verband houden met celtellingen of andere analytische modules, waaronder de module "Multiplex IHC" of de add-on "Tissue Microarray (TMA)". Toekomstige toepassingen van deze workflow kunnen ook baat hebben bij het vooraf definiëren van het aantal cellen per ROI-segment, waardoor gelijkwaardige cellulaire inputs in meerdere collecties worden gegarandeerd, of door alternatieve methoden te gebruiken om cellulaire ROI's van belang te definiëren, zoals door immunohistochemie of celsociologie.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

T.P.C. is lid van ThermoFisher Scientific, Inc SAB en ontvangt onderzoeksfinanciering van AbbVie.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Financiering voor dit project werd gedeeltelijk verstrekt door het Defense Health Program (HU0001-16-2-0006 en HU0001-16-2-00014) aan de Uniformed Services University voor het Gynaecologisch Kankercentrum van uitmuntendheid. De sponsors hadden geen rol in het ontwerp, de uitvoering, de interpretatie of het schrijven van de studie. Disclaimer: De standpunten die hierin worden uitgedrukt, zijn die van de auteurs en weerspiegelen niet het officiële beleid van het ministerie van leger / marine / luchtmacht, het ministerie van Defensie of de Amerikaanse regering.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1260 Infinity II SystemAgilent Technologies IncOffline LC system
96 MicroCaps (150uL) in bulkPressure Biosciences IncMC150-96
96 MicroPestles in bulkPressure Biosciences IncMP-96
96 MicroTubes in bulk (no caps)Pressure Biosciences IncMT-96
9mm MS Certified Clear Screw Thread KitsFisher Scientific03-060-058Sample vial for offline LC frationation and mass spectrometry
Acetonitrile, Optima LC/MS GradeFisher ChemicalA995-4Mobile phase solvent
Aperio AT2Leica Microsystems23AT2100Slide scanner
Axygen PCR Tubes with 0.5 mL Flat CapFisher Scientific14-222-292Sample tubes; size fits PCT tubes and thermocycler
Barocycler 2320EXTPressure Biosciences Inc2320-EXTBarocycler
BCA Protein Assay KitFisher ScientificP123225
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor CocktailRoche11836170001
Easy-nLC 1200Thermo Fisher ScientificLiquid Chromatography 
EasyPep Maxi Sample Prep KitThermo Fisher ScientificNCI5734Post-label sample clean up column
EASY-SPRAY C18 2UM 50CM X 75Fisher ScientificES903Analytical column
Eosin Y Solution AqueousSigma AldrichHT110216
Formic Acid, 99+ %Thermo Fisher Scientific28905Mobile phase additive
ggplot2 version 3.3.5CRANhttps://cran.r-project.org/web/packages/ggplot2/
HALOIndica LabsImage analysis software
IDLE (Integrated Development and Learning Environment)Python Software Foundation
iheatmapr version 0.5.1CRANhttps://cran.r-project.org/web/packages/iheatmapr/
iRT KitBiognosysKi-3002-1LC-MS QAQC Standard
limma version 3.42.2Bioconductorhttps://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html
LMD Scanning stage Ultra LMT350Leica Microsystems11888453LMD stage model outfitted with PCT tube holder
LMD7 (software version 8.2.3.7603)Leica MicrosystemsLMD apparatus (microscope, laser, camera, PC, tablet)
Mascot ServerMatrix ScienceData analysis software
Mass Spec-Compatible Human Protein Extract, DigestPromegaV6951LC-MS QAQC Standard
Mayer’s Hematoxylin SolutionSigma AldrichMHS32
PEN Membrane Glass SlidesLeica Microsystems11532918
Peptide Retention Time Calibration MixtureThermo Fisher Scientific88321LC-MS QAQC Standard
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2Sigma AldrichP5726
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3Sigma AldrichP0044
Pierce LTQ Velos ESI Positive Ion Calibration SolutionThermo Fisher Scientific88323Instrument calibration solution
PM100 C18 3UM 75UMX20MM NV 2PKFisher Scientific164535Pre-column
Proteome DiscovererThermo Fisher ScientificOPTON-31040Data analysis software
PythonPython Software Foundation
Q Exactive HF-XThermo Fisher ScientificMass spectrometer
R version 3.6.0CRANhttps://cran-archive.r-project.org/bin/windows/base/old/2.6.2/
RColorBrewer version 1.1-2CRANhttps://cran.r-project.org/web/packages/RColorBrewer/
Soluble Smart Digest KitThermo Fisher Scientific3251711Digestion reagent
TMTpro 16plex Label Reagent SetThermo Fisher ScientificA44520isobaric TMT labeling reagents
Veriti 60 well thermal cyclerApplied Biosystems4384638Thermocycler
Water, Optima LC/MS GradeFisher ChemicalW6-4Mobile phase solvent
ZORBAX Extend 300 C18, 2.1 x 12.5 mm, 5 µm, guard cartridge (ZGC)Agilent Technologies Inc821125-932Offline LC trap column
ZORBAX Extend 300 C18, 2.1 x 150 mm, 3.5 µmAgilent Technologies Inc763750-902Offline LC analytical column

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. An evolving story of the metastatic voyage of ovarian cancer cells: cellular and molecular orchestration of the adipose-rich metastatic microenvironment. Oncogene. 38 (16), 2885-2898 (2019).">Motohara, T., et al. An evolving story of the metastatic voyage of ovarian cancer cells: cellular and molecular orchestration of the adipose-rich metastatic microenvironment. Oncogene. 38 (16), 2885-2898 (2019).
  2. Systematic pan-cancer analysis of tumour purity. Nature Communications. 6, 8971(2015).">Aran, D., Sirota, M., Butte, A. J. Systematic pan-cancer analysis of tumour purity. Nature Communications. 6, 8971(2015).
  3. Extensive three-dimensional intratumor proteomic heterogeneity revealed by multiregion sampling in high-grade serous ovarian tumor specimens. iScience. 24 (7), 102757(2021).">Hunt, A. L., et al. Extensive three-dimensional intratumor proteomic heterogeneity revealed by multiregion sampling in high-grade serous ovarian tumor specimens. iScience. 24 (7), 102757(2021).
  4. Proteogenomic characterization of endometrial carcinoma. Cell. 180 (4), 729-748 (2020).">Dou, Y., et al. Proteogenomic characterization of endometrial carcinoma. Cell. 180 (4), 729-748 (2020).
  5. Integrated proteogenomic characterization of human high-grade serous ovarian cancer. Cell. 166 (3), 755-765 (2016).">Zhang, H., et al. Integrated proteogenomic characterization of human high-grade serous ovarian cancer. Cell. 166 (3), 755-765 (2016).
  6. Proteogenomic characterization reveals therapeutic vulnerabilities in lung adenocarcinoma. Cell. 182 (1), 200-225 (2020).">Gillette, M. A., et al. Proteogenomic characterization reveals therapeutic vulnerabilities in lung adenocarcinoma. Cell. 182 (1), 200-225 (2020).
  7. Protein pathway biomarker analysis of human cancer reveals requirement for upfront cellular-enrichment processing. Laboratory Investigation. 90 (5), 787-796 (2010).">Silvestri, A., et al. Protein pathway biomarker analysis of human cancer reveals requirement for upfront cellular-enrichment processing. Laboratory Investigation. 90 (5), 787-796 (2010).
  8. Deep learning in cancer pathology: a new generation of clinical biomarkers. British Journal of Cancer. 124 (4), 686-696 (2021).">Echle, A., et al. Deep learning in cancer pathology: a new generation of clinical biomarkers. British Journal of Cancer. 124 (4), 686-696 (2021).
  9. Molecular analysis of clinically defined subsets of high-grade serous ovarian cancer. Cell Reports. 31 (2), 107502(2020).">Lee, S., et al. Molecular analysis of clinically defined subsets of high-grade serous ovarian cancer. Cell Reports. 31 (2), 107502(2020).
  10. Standardization and harmonization of distributed multi-center proteotype analysis supporting precision medicine studies. Nature Communications. 11 (1), 5248(2020).">Xuan, Y., et al. Standardization and harmonization of distributed multi-center proteotype analysis supporting precision medicine studies. Nature Communications. 11 (1), 5248(2020).
  11. Quantitative profiling of single formalin fixed tumour sections: proteomics for translational research. Scientific Reports. 6 (1), 34949(2016).">Hughes, C. S., et al. Quantitative profiling of single formalin fixed tumour sections: proteomics for translational research. Scientific Reports. 6 (1), 34949(2016).
  12. A portrait of tissue phosphoprotein stability in the clinical tissue procurement process. Molecular & Cellular Proteomics. 7 (10), 1998-2018 (2008).">Espina, V., et al. A portrait of tissue phosphoprotein stability in the clinical tissue procurement process. Molecular & Cellular Proteomics. 7 (10), 1998-2018 (2008).
  13. Laser capture microdissection technology. Expert Review of Molecular Diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).">Espina, V., Heiby, M., Pierobon, M., Liotta, L. A. Laser capture microdissection technology. Expert Review of Molecular Diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).
  14. Automated dissection protocol for tumor enrichment in low tumor content tissues. Journal of Visualized Experiments. (169), e62394(2021).">Havnar, C. A., et al. Automated dissection protocol for tumor enrichment in low tumor content tissues. Journal of Visualized Experiments. (169), e62394(2021).
  15. One-step preservation of phosphoproteins and tissue morphology at room temperature for diagnostic and research specimens. PLoS One. 6 (8), (2011).">Mueller, C., et al. One-step preservation of phosphoproteins and tissue morphology at room temperature for diagnostic and research specimens. PLoS One. 6 (8), (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Laser MicrodissectionTumor MicroenvironmentAI Image AnalysisProteomic AnalysisMass SpectrometryTissue SegmentationHistology WorkflowCell Population IsolationDigital PathologyMultiplexed Proteomics

Related Articles