Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Organotypische retinale explantculturen van makaken

1.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64178

⸱

24 augustus 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Yunnan Eye Institute & Key Laboratory of Yunnan Province, Yunnan Eye Disease Clinical Medical Center, Affiliated Hospital of Yunnan University, Yunnan University, 2Institute for Ophthalmic Research, Eberhard-Karls-Universität Tübingen

In dit artikel

Samenvatting

Netvliesexplantaten verkregen uit wilde makaken werden in vitro gekweekt. Retinale degeneratie en de cGMP-PKG signaleringsroute werd geïnduceerd met behulp van de PDE6-remmer zaprinast. cGMP-accumulatie in de explantaten bij verschillende zaprinastconcentraties werd geverifieerd met behulp van immunofluorescentie.

Samenvatting

Erfelijke retinale degeneratie (RD) wordt gekenmerkt door progressieve fotoreceptorceldood. Overactivatie van de cyclische guanosinemonofosfaat (cGMP)-afhankelijke proteïnekinase (PKG) route in fotoreceptorcellen veroorzaakt fotoreceptorceldood, vooral in modellen met fosfodiësterase 6b (PDE6b) mutaties. Eerdere studies over RD hebben voornamelijk muizenmodellen gebruikt, zoals rd1 - of rd10-muizen . Gezien de genetische en fysiologische verschillen tussen muizen en mensen, is het belangrijk om te begrijpen in hoeverre de netvliezen van primaten en knaagdieren vergelijkbaar zijn. Makaken delen een hoge mate van genetische gelijkenis met mensen. Daarom werden wild-type makaken (leeftijd 1-3 jaar) geselecteerd voor de in vitro cultuur van retinale explantaten die het retina-retinale pigmentepitheel (RPE)-choroidecomplex bevatten. Deze explants werden behandeld met verschillende concentraties van de PDE6-remmer zaprinast om de cGMP-PKG-signaleringsroute te induceren en RD-pathogenese te simuleren. cGMP-accumulatie en celdood in retinale explantaten van primaten werden vervolgens geverifieerd met behulp van immunofluorescentie en de TUNEL-test. Het retinale model van primaten dat in deze studie is vastgesteld, kan dienen voor relevante en effectieve studies naar de mechanismen van cGMP-PKG-afhankelijk RD, evenals voor de ontwikkeling van toekomstige behandelingsbenaderingen.

Inleiding

Erfelijke retinale degeneratie (RD) wordt gekenmerkt door progressieve fotoreceptorceldood en wordt veroorzaakt door mutaties in een grote verscheidenheid aan pathogene genen1. Het eindresultaat van RD is verlies van het gezichtsvermogen en in de overgrote meerderheid van de gevallen blijft de ziekte tot op de dag van vandaag onbehandelbaar. Daarom is het belangrijk om de cellulaire mechanismen te bestuderen die leiden tot fotoreceptordood met behulp van modellen die de menselijke ziektetoestand getrouw weergeven. Hier zijn op primaten gebaseerde modellen van bijzonder belang vanwege hun nabijheid tot de mens. Met name kunnen dergelijke modellen de ontwikkeling bevorderen van geschikte therapeutische interventies die fotoreceptorceldood kunnen stoppen of vertragen.

Eerder onderzoek naar de mechanismen van celdood bij RD heeft aangetoond dat de afname of het verlies van fosfodiësterase 6 (PDE6) activiteit veroorzaakt door RD-triggerende genmutaties leidt tot verminderde hydrolyse van cyclisch guanosinemonofosfaat (cGMP)2,3. cGMP is een specifieke agonist van de cyclische nucleotide-gated ionkanalen (CNGCs) in de staafbuitensegmenten (ROSs) en is ook een sleutelmolecuul dat verantwoordelijk is voor de omzetting van lichtsignalen in elektrische signalen in gewervelde fotoreceptorcellen4. Verminderde cGMP-hydrolyse veroorzaakt de accumulatie van cGMP in ROSs, wat leidt tot de opening van CNGCs 5. Bijgevolg worden de fototransductieroutes geactiveerd, wat resulteert in een toename van kationconcentraties in fotoreceptorcellen. Dit proces legt een metabole belasting op fotoreceptoren, die bij overactivering, bijvoorbeeld door mutaties in PDE6, celdood kunnen veroorzaken.

Veel studies hebben aangetoond dat een significante overaccumulatie van cGMP in fotoreceptoren van muismodellen met verschillende RD-genmutaties de activering van cGMP-afhankelijk eiwitkinase (PKG)3,6 kan veroorzaken. Dit leidt tot een aanzienlijke toename van afstervende, TUNEL-positieve cellen en een geleidelijke verdunning van de fotoreceptorcellaag. Eerdere studies suggereren dat PKG-overactivatie veroorzaakt door verhoogde cGMP-niveaus een noodzakelijke en voldoende voorwaarde is voor de inductie van fotoreceptorceldood 2,5. Studies op verschillende muismodellen van RD hebben ook aangetoond dat PKG-activering geïnduceerd door verhoogde cGMP-niveaus in fotoreceptoren, leidt tot overactivatie van downstream-effectoren zoals poly-ADP-ribose polymerase 1 (PARP1), histon deacetylase (HDAC) en calpaïne 2,7,8,9. Dit impliceert causale associaties tussen deze verschillende doeleiwitten en fotoreceptorceldood.

Eerder onderzoek naar de pathologie, toxicofarmacologie en therapie van RD was echter voornamelijk gebaseerd op muismodellen voor RD10,11,12. Niettemin blijven er enorme moeilijkheden bestaan bij de klinische vertaling van deze resultaten. Dit komt door de aanzienlijke genetische en fysiologische verschillen tussen muizen en mensen, vooral met betrekking tot de netvliesstructuur. Daarentegen delen niet-menselijke primaten (NHP's) ook een hoge mate van gelijkenis met mensen met betrekking tot genetische kenmerken, fysiologische patronen en regulatie van omgevingsfactoren. Zo werd optogenetische therapie onderzocht als middel om de retinale activiteit te herstellen in een NHP-model13. Lingam en collega's toonden aan dat goede productiepraktijken van door mensen geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide retinale fotoreceptorvoorlopercellen kegelfotoreceptorschade in NHP14 kunnen redden. Daarom zijn NHP-modellen belangrijk voor de verkenning van RD-pathogenese en de ontwikkeling van effectieve behandelmethoden. In het bijzonder zouden NHP-modellen van RD, die pathogene mechanismen vertonen die vergelijkbaar zijn met die bij mensen, een cruciale rol kunnen spelen in studies over de ontwikkeling en in vivo toxicofarmacologische analyse van nieuwe geneesmiddelen.

Gezien de lange levenscyclus, het hoge niveau van technische problemen en de hoge kosten die gemoeid zijn met het opzetten van in vivo primatenmodellen, hebben we een in vitro niet-menselijk primaat (NHP) model opgesteld met behulp van culturen van geëxplanteerde makaken netvlies. Eerst werden wild-type makaken van 1-3 jaar oud geselecteerd voor in vitro kweek van retinale explantaten, waaronder het retina-RPE-choroïde complex. Explants werden vervolgens behandeld met verschillende concentraties van de PDE6-remmer zaprinast (100 μM, 200 μM en 400 μM) om de cGMP-PKG-signaalroute te induceren. Fotoreceptorceldood werd gekwantificeerd en geanalyseerd met behulp van de TUNEL-test en cGMP-accumulatie in explantaten werd geverifieerd via immunofluorescentie. Gezien de hoge mate van gelijkenis met betrekking tot celverdeling en morfologie, dikte van de retinale laag en andere fysiologische kenmerken van het netvlies tussen apen en mensen, kan de vaststelling van de cGMP-PKG-signaleringsroute in het in vitro retinale model toekomstig onderzoek naar de pathogenese van RD vergemakkelijken, evenals studies naar de ontwikkeling en toxicofarmacologie van nieuwe geneesmiddelen voor RD-behandeling.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De dierstudie werd beoordeeld en goedgekeurd door de Ethics Review Committee van het Institute of Zoology, de Chinese Academy of Sciences (IACUC-PE-2022-06-002) en de dierethische beoordeling en het dierprotocol van de Yunnan University (YNU20220149).

1. Bereiding van retinale explantaten

  1. Verkrijg oogbollen van primaten van wilde makaken van 1 tot 3 jaar oud, bewaar in weefselopslagoplossing en transport op ijs binnen 3 uur na enucleatie nadat de apen zijn geofferd of na natuurlijke dood.
  2. Los voor de bereiding van proteïnase K-oplossing 25 mg proteïnase K op in 250 μL gedestilleerd water en voeg vervolgens 225 μL van de oplossing toe aan 18,5 ml basaal medium (R16).
  3. Was de oogbollen gedurende 30 s in 10 ml 5% povidon-jodium (povidon-jodium: water = 1:19) en dompel ze in 5% penicilline / streptomycine (PEN / STREP):p hosfaat-gebufferde zoutoplossing = 1:19 gedurende 1 minuut om bacteriële besmetting te voorkomen. Incubeer vervolgens de oogbollen in 10 ml R16 medium gedurende 5 minuten.
  4. Verwarm de proteïnase K-oplossing voor in een incubator van 37 °C. Dompel vervolgens de oogbollen onder in 10 ml proteïnase K-oplossing en incubeer gedurende 2 minuten. Dompel de oogbollen onder in 10 ml R16 + foetaal runderserum (1:1) oplossing, incubeer gedurende 5 minuten en breng de oogbollen vervolgens over op 10 ml vers R16 voor een laatste wasbeurt.
  5. Scheid de sclera, het hoornvlies, de iris, de lens en het glasachtig lichaam en knip het netvlies van 4 kanten af met een pincet en een schaar (figuur 1A-L).
  6. Snijd retinale explantaten met trephinebladen in vijf secties- een 4 mm trephineblad voor de nasale / temporele / superieure / inferieure kant en een 6 mm trephineblad voor de centrale zijde (met optische schijf en macula; Figuur 1M-O). Snijd op de volgende afstand van de oogzenuwkop: 1,5 mm voor nasaal, 4 mm voor tijdelijk en 2 mm voor zowel superieure als inferieure zijde.
  7. Breng de netvliesexplantaten (met netvlies en vaatvlies) over met oogliddepressor en plaats ze in het midden van de insert, fotoreceptorzijde naar boven (figuur 1P). Plaats ongeveer 1 ml volledig medium (R16 aangevuld met BSA, transferrine, progesteron, insuline, T3, corticosteron, vitamine B1, vitamine B12, retinol, retinylacetaat, DL-tocoferol, tocoferylacetaat, linolzuur, L-cysteïne HCl, glutathion, glutamine, vitamine C) onder het membraan op de plaat om het netvlies volledig te bedekken.

2. Retinale explantatiecultuur van primaten

  1. Kweek retinale explantaten in volledig medium en plaats in een 37 °C incubator belucht met bevochtigd 5% CO2.
  2. Breng medicamenteuze behandeling in de juiste concentratie aan op het retinale kweekmedium (bijv. zaprinast in concentraties van 100 μM, 200 μM of 400 μM). Gebruik ten minste drie explantaten per behandelingsconditie en gebruik explantaten zonder geneesmiddel als controle. Behandel met een medicijn gedurende 4 dagen.

3. Fixatie en cryo-sectie

  1. Incubeer retinale explantaten met 1 ml paraformaldehyde (PFA) gedurende 45 minuten, spoel ze kort af met 1 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en incubeer vervolgens met 10% sucrose gedurende 10 minuten, 20% sucrose gedurende 20 minuten en 30% sucrose gedurende 30 minuten (1 ml voor elke netvliesexplant).
  2. Snijd retinale explantaten met behulp van trephinebladen om consistentie te garanderen in de grootte van de explantaten verkregen van verschillende locaties met de volgende kenmerken: vier kwadranten in de periferie, 6 mm in het midden. Breng vervolgens de retinale explantaten over in een blikdoos (ongeveer 1,5 cm x 1,5 cm x 1,5 cm) met O.C.T. inbeddingsmedium om het weefsel te bedekken. Vries de weefselsecties onmiddellijk in vloeibare stikstof in en plaats ze in een koelkast van -20 °C voor opslag.
  3. Gebruik een scherp mes om de agar in een klein blok met het weefselmonster te snijden, snijd de monsterblokken in secties van 10 μm en plaats ze op adhesiemicroscoopglaasjes met een zachte borstel. Droog vervolgens gedurende 45 minuten bij 40 °C en bewaar bij -20 °C tot gebruik.

4. Immunohistochemie (figuur 2)

  1. cGMP kleuring
    1. Droog de dia's en teken een hydrofobe ring rond de netvliessecties met een vloeistofblokkerpen om de monsters te bedekken.
    2. Dompel dia's gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur onder in 200 μL van 0,3% fosfaatbufferzoutoplossing en Triton X-100 per dia (PBST) en vervolgens in een blokkerende oplossing (5% normaal ezelserum, 0,3% PBST, 1% BSA, 200 μL per dia) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    3. Incubeer de monsters 's nachts met het primaire antilichaam (1:250, schapen anti-cGMP, 200 μL per dia) bereid in de blokkerende oplossing bij 4 °C, en spoel vervolgens 3x met PBS gedurende 10 minuten (200 μL per dia).
    4. Incubeer de monsters met secundair antilichaam (1:300, Donkey anti sheep Alxea Fluor 488, 200 μL per dia) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en spoel vervolgens af met PBS gedurende 10 min, 3x. Bedek de monsters met een antifade montagemedium dat 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) bevat en bewaar bij 4 °C gedurende ten minste 30 minuten vóór de beeldvorming.
  2. TUNEL kleuring
    1. Droog de dia's bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten en trek een waterafstotende barrièrering rond retinale weefselmonsters met de vloeistofblokkerpen en incuber ze vervolgens gedurende 15 minuten in 40 ml PBS.
    2. Incubeer dia's in 42 ml (per vijf dia's) TBS (0,05 M Tris-buffer) bij 37 °C. Zuig de TBS uit en incuber de monsters met 6 μL proteïnase K gedurende 5 minuten. Was vervolgens dia's 3x met TBS gedurende telkens 5 minuten.
    3. Stel de dia's bloot aan 40 ml ethanol-azijnzuuroplossing in de choplin, dek af met een transparante plaat en incubeer bij -20 °C gedurende 5 minuten. Was de dia's 3x met TBS telkens 5 min.
    4. Stel de dia's bloot aan een blokkerende oplossing (1% BSA; 200-300 μL per dia volgens de vereiste) en incubeer gedurende 1 uur in een vochtigheidskamer.
    5. Bereid TUNEL-kitoplossing, TMR-rood, in de volgende verhouding: 62,50 μL blokkeringsoplossing (1% BSA), 56,25 μL etiketteringsoplossing (TMR-dUTP) en 6,25 μL van het enzym (verhouding voor elke dia). Voeg ongeveer 130 μL van deze oplossing per dia toe en incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C. Was vervolgens de dia's met PBS gedurende 5 minuten (200 μL per dia), 2x.
    6. Plaats afdekplaten met 1-2 druppels antifade montagemedium met DAPI over de monsters en incuber de dia's vervolgens bij 4 °C gedurende ten minste 30 minuten voordat ze worden afgebeeld.
  3. cGMP kleuring gecombineerd met TUNEL kleuring
    1. cGMP-kleuring werd gevolgd door TUNEL-kleuring. Volg de stappen van TUNEL-kleuring van stap 4.2.1 tot stap 4.2.5 en ga vervolgens verder met de stappen van cGMP-kleuring van stap 4.1.2 tot stap 4.1.4.
  4. Voer licht- en fluorescentiemicroscopie uit met cameraparameters als volgt: belichtingstijd = 125 ms, ROI-grootte = 2752 x 2208, Kleur = B / M. Leg beelden vast met behulp van de software. Stel vier verschillende velden voor met een digitale camera met een vergroting van 20x van elke sectie en verkrijg representatieve foto's van de centrale delen van het netvlies met behulp van DAPI (465 nm), EGFP (509 nm), TMP (578 nm), waarbij Z-Stack-scanning een interval = 1 μm en optioneel = 1,251 μm heeft.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In deze studie werd de retinale explantatiecultuur van makaken apen uitgevoerd met explantaten die het retina-RPE-choroïde complex bevatten (figuur 1, aanvullende figuur S1). In vergelijking met de in vitro kweek van retinale cellen met behulp van het netvlies zonder de aangehechte RPE en het vaatvlies, vergemakkelijkt onze explantatiecultuur een betere celoverleving en verlengt dienovereenkomstig de overleving van fotoreceptorcellen.

We ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Visuele fototransductie verwijst naar het biologische proces waarbij lichtsignalen worden omgezet in elektrische signalen door fotoreceptorcellen in het netvlies van het oog. Fotoreceptorcellen zijn gepolariseerde neuronen die in staat zijn tot fototransductie en er zijn twee verschillende soorten fotoreceptoren die staven en kegeltjes worden genoemd naar de vormen van hun buitenste segmenten. Staafjes zijn verantwoordelijk voor het scotopische zicht en kegeltjes zijn verantwoordelijk voor fotopisch en hoog scherpte zich...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Alle auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.

Dankbetuigingen

Deze studie werd ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (nr. 81960180), de Zinke heritage foundation en de Charlotte and Tistou Kerstan Foundation, Yunnan Eye Disease Clinical Medical Center (ZX2019-02-01). We danken Prof. Longbao Lv (Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Kunming, China) voor het delen van de apenoogballen die in deze studie zijn gebruikt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Bovine Serum Albumin (BSA)SigmaB2064Blocking oplossing
CorticosteroneSigmaC2505Aanvullingen van compleet medium
DL-tocopherolSigmaT1539Aanvullingen van compleet medium
Donkey anti sheep, Alxea Fluor 488Life technologies corporationA11015Secundaire antilichaam van cGMP
Ethanol-azijnzuur oplossingShyuanyeR20492Fixeervloeistof
Fetal Bovine SerumGemini900-108Blocking oplossing
FluorescentiemicroscoopCarl ZeissAxio Imager.M2Immunofluorescence beeldvorming
GlutamineSigmaG8540Aanvullingen van compleet medium
GlutathioneSigmaG6013Aanvullingen van compleet medium
In Situ Cell Death Detection Kit, TMR redRoche12156792910TUNEL-assay
InsulinSigma16634Aanvullingen van compleet medium
L-cysteine HClSigmaC7477Aanvullingen van compleet medium
LinolzuurSigmaL1012Aanvullingen van compleet medium
MACS Tissue Storage SolutionMiltenyi130-100-008Geoptimaliseerde opslag van verse orgaan- en weefselmonsters
Normal Donkey SerumSolarbioSL050Blocking oplossing
Paraformaldehyde(PFA)BiosharpBL539AFixeermiddel
PEN. / STREP. 100×MilliporeTMS-AB2-CPenicilline / Streptomycine antibiotica
Fosfaat bufferoplossing(PBS)SolarbioP1010Buffer oplossing
Povidon-jodiumShanghailikang310411Desinfectiemiddel
ProgesteronSigmaP8783Aanvullingen van compleet medium
Proteinase KMillpore539480Eiwitafbraak
R16 mediumLife technologies corporation074-90743ABasismedium
RetinolSigmaR7632Aanvullingen van compleet medium
RetinylacetaatSigmaR7882Aanvullingen van compleet medium
Sheep anti-cGMPJan de Vente, Maastricht University, the NetherlandsPrimair antilichaam van cGMP
SucroseGHTECH57-50-1Ontwateringsmiddel
T3SigmaT6397Aanvullingen van compleet medium
Tissue-Tek medium (O.C.T. Compound)SAKURA4583Inbeddingsmedium
TocoferylacetaatSigmaT1157Aanvullingen van compleet medium
TransferrineSigmaT1283Aanvullingen van compleet medium
TranswellCorning Incorporated3412Cel / weefselkweek
Tris-buffer (TBS)SolarbioT1080Blocking buffer
Triton X-100Solarbio9002-93-1Oppervlakteactieve stof
VECTASHIELD Medium met DAPIVectorH-1200Montage medium
Vitamine B1SigmaT1270Aanvullingen van compleet medium
Vitamine B12SigmaV6629Aanvullingen van compleet medium
Vitamine CSigmaA4034Aanvullingen van compleet medium
ZaprinastSigmaZ0878PDE6-remmer
Zeiss Imager M2 Microscoop Zeiss, Oberkochen,Duitslandrechtopstaande microscoop
LSM 900 Airyscanlaserscanningmicroscoop met hoge resolutie
Zeiss Axiocam Zeiss, Oberkochen,Duitslanddigitale camera
Zeiss Axiovision4.7
Adobe
Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA)
Primate oogbollen van wildtype-makakKUNMING INSTITUTE OF ZOOLOGYSYXK (figure-materials-1) K2017 -0008
Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japan
TUNEL kit oplossing (REF12156792910, Roche,Duitsland),

Referenties

  1. O'Neal, T. B., Luther, E. E. StatPearls. , StatPearls Publishing. Copyright 2022, StatPearls Publishing LLC (2022).
  2. Power, M., et al. Cellular mechanisms of hereditary photoreceptor degeneration - Focus on cGMP. Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100772(2020).
  3. Paquet-Durand, F., Hauck, S. M., van Veen, T., Ueffing, M., Ekström, P. PKG activity causes photoreceptor cell death in two retinitis pigmentosa models. Journal of Neurochemistry. 108 (3), 796-810 (2009).
  4. Tolone, A., Belhadj, S., Rentsch, A., Schwede, F., Paquet-Durand, F. The cGMP pathway and inherited photoreceptor degeneration: Targets, compounds, and biomarkers. Genes (Basel). 10 (6), 453(2019).
  5. Arango-Gonzalez, B., et al. Identification of a common non-apoptotic cell death mechanism in hereditary retinal degeneration. PLoS One. 9 (11), 112142(2014).
  6. Mencl, S., Trifunović, D., Zrenner, E., Paquet-Durand, F. PKG-dependent cell death in 661W cone photoreceptor-like cell cultures (experimental study). Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 511-517 (2018).
  7. Power, M. J., et al. Systematic spatiotemporal mapping reveals divergent cell death pathways in three mouse models of hereditary retinal degeneration. Journal of Comparative Neurology. 528 (7), 1113-1139 (2020).
  8. Sancho-Pelluz, J., et al. Excessive HDAC activation is critical for neurodegeneration in the rd1 mouse. Cell Death & Disease. 1 (2), 24(2010).
  9. Kulkarni, M., Trifunović, D., Schubert, T., Euler, T., Paquet-Durand, F. Calcium dynamics change in degenerating cone photoreceptors. Human Molecular Genetics. 25 (17), 3729-3740 (2016).
  10. Trifunović, D., et al. cGMP-dependent cone photoreceptor degeneration in the cpfl1 mouse retina. Journal of Comparative Neurology. 518 (17), 3604-3617 (2010).
  11. Samardzija, M., et al. HDAC inhibition ameliorates cone survival in retinitis pigmentosa mice. Cell Death & Differentiation. 28 (4), 1317-1332 (2021).
  12. Schön, C., et al. Gene therapy successfully delays degeneration in a mouse model of PDE6A-linked Retinitis Pigmentosa (RP43). Human Gene Therapy. 28 (12), 1180-1188 (2017).
  13. McGregor, J. E., et al. Optogenetic therapy restores retinal activity in primate for at least a year following photoreceptor ablation. Molecular Therapy. 30 (3), 1315-1328 (2022).
  14. Lingam, S., et al. cGMP-grade human iPSC-derived retinal photoreceptor precursor cells rescue cone photoreceptor damage in non-human primates. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 464(2021).
  15. Das, S., et al. The role of cGMP-signalling and calcium-signalling in photoreceptor cell death: perspectives for therapy development. Pflugers Archiv. 473 (9), 1411-1421 (2021).
  16. Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. Functional architecture of the retina: Development and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).
  17. Schnichels, S., et al. Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880(2021).
  18. Maryam, A., et al. The molecular organization of human cGMP specific Phosphodiesterase 6 (PDE6): Structural implications of somatic mutations in cancer and retinitis pigmentosa. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 378-389 (2019).
  19. Huang, L., Kutluer, M., Adani, E., Comitato, A., Marigo, V. New in vitro cellular model for molecular studies of retinitis pigmentosa. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6440(2021).
  20. Zhou, J., Rasmussen, M., Ekström, P. cGMP-PKG dependent transcriptome in normal and degenerating retinas: Novel insights into the retinitis pigmentosa pathology. Experimental Eye Research. 212, 108752(2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Retinale explantaatkweekmakaakretinafotoreceptordegeneratiecGMP PKG routePDE6 remmerimmunofluorescentiekleuringTUNEL assayretinaal pigmentepitheelfluorescentiemicroscopieprimaatretinamodel
Organotypische retinale explantculturen van makaken
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.