Ontleedende cel-autonome functie van fragiele X mentale retardatie-eiwit in een auditief circuit door In Ovo-elektroporatie

Summary

Met behulp van ovo-elektroporatie hebben we een methode ontwikkeld om selectief het auditieve binnenoor en de cochleaire kern in kippenembryo's te transfecteren om een celgroepspecifieke knockdown van fragiele X mentale retardatie-eiwit te bereiken tijdens discrete perioden van circuitassemblage.

Abstract

Fragiele X mentale retardatie-eiwit (FMRP) is een mRNA-bindend eiwit dat de lokale eiwittransformatie reguleert. FMRP-verlies of disfunctie leidt tot afwijkende neuronale en synaptische activiteiten bij fragiele X-syndroom (FXS), dat wordt gekenmerkt door intellectuele achterstand, sensorische afwijkingen en sociale communicatieproblemen. Studies naar FMRP-functie en FXS-pathogenese zijn voornamelijk uitgevoerd met Fmr1 (het gen dat codeert voor FMRP) knock-out bij transgene dieren. Hier rapporteren we een in vivo methode voor het bepalen van de cel-autonome functie van FMRP tijdens de periode van circuitassemblage en synaptische vorming met behulp van kippenembryo's. Deze methode maakt gebruik van fase-, plaats- en richtingsspecifieke elektroporatie van een geneesmiddel-induceerbaar vectorsysteem met Fmr1 klein haarspeld-RNA (shRNA) en een EGFP-verslaggever. Met deze methode bereikten we selectieve FMRP-knockdown in het auditieve ganglion (AG) en in een van zijn hersenstamdoelen, de nucleus magnocellularis (NM), waardoor een componentspecifieke manipulatie binnen het AG-NM-circuit werd geboden. Bovendien maakt het mozaïekpatroon van de transfectie controles binnen het dier en naburige neuron / vezelvergelijkingen mogelijk voor verbeterde betrouwbaarheid en gevoeligheid bij het analyseren van gegevens. Het induceerbare vectorsysteem biedt temporele controle over het begin van genbewerking om accumulerende ontwikkelingseffecten te minimaliseren. De combinatie van deze strategieën biedt een innovatief hulpmiddel om de cel-autonome functie van FMRP in synaptische en circuitontwikkeling te ontleden.

Introduction

Fragiele X-syndroom (FXS) is een neurologische ontwikkelingsstoornis die wordt gekenmerkt door een verstandelijke beperking, sensorische afwijkingen en autistisch gedrag. In de meeste gevallen wordt FXS veroorzaakt door een wereldwijd verlies van fragiel X-mentaal retardatie-eiwit (FMRP; gecodeerd door het Fmr1-gen) vanaf vroege embryonale stadia¹. FMRP is een RNA-bindend eiwit dat normaal tot expressie komt in de meeste neuronen en gliacellen in de hersenen, evenals in sensorische organen ^2,3,4. In zoogdierhersenen wordt FMRP waarschijnlijk g....

Protocol

Eieren en kippenembryo's werden met zorg en respect behandeld in overeenstemming met de dierprotocollen die zijn goedgekeurd door de Jinan University Animal Care and Use Committee.

1. Bereiding van eieren en plasmide

1. Eierbereiding
   1. Verkrijg verse bevruchte kippeneieren (Gallus gallus) van de South China Agricultural University en bewaar bij 16 °C vóór de incubatie. Voor optimale levensvatbaarheid, zet alle eieren voor incubatie binnen een week na aankomst.
   2. Plaats de eieren horizontaal en broed bij 38 °C gedurende 46-48 uur tot Hamburger en Hamilton (HH) stadium 12²⁵

Results

Door ovo-elektroporatie uit te voeren op verschillende locaties en in verschillende ontwikkelingsstadia, bereikten we selectieve FMRP-knockdown in de auditieve periferie of in de auditieve hersenstam.

FMRP knockdown in NM
Klein haarspeld RNA (shRNA) tegen de kip Fmr1 werd ontworpen en gekloond in het Tet-On vectorsysteem zoals eerder beschreven²⁰. De opstelling voor in ovo-elektroporatie is weergegeven in

Discussion

Om de cel-autonome functie van FMRP te bepalen, is het manipuleren van de expressie ervan in individuele celgroepen of celtypen noodzakelijk. Aangezien een van de belangrijkste functies van FMRP is om synaptische vorming en plasticiteit te reguleren, is het selectief manipuleren van elke synaptische component van een bepaald circuit een voorwaarde voor een volledig begrip van het FMRP-mechanisme in synaptische communicatie. Met behulp van ovo-elektroporatie van kippenembryo's de.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Egg incubation
16 °C refrigerator	MAGAT		Used for fertilized egg storage.
Egg incubator	SHANGHAI BOXUN	GZX-9240MBE
Fertilized eggs	Farm of South China Agricultural University		Eggs must be used in one week for optimal viability.
Plasmid preparation
Centrifuge	Sigma	10016
Fast green	Solarbio	G1661	Make 0.1% working solution in distilled water and autoclave.
Plasmid Maxi-prep kit	QIAGEN	12162	Dissolve plasmid DNA in Tris-EDTA (TE) buffer; endotoxin-free preparation kit
Sodium Acetate	Sigma-Aldrich	S2889	Make 7.5M working solution in nuclase-free water.
Electroporation and Doxycycline Administration
Electroporator	BTX	ECM399
1 mL / 5 mL Syringe	GUANGZHOU KANGFULAI
Dissecting microscope	CNOPTEC	SZM-42
Doxcycline	Sigma-Aldrich	D9891	Use fresh aliquots for each dose and store at -20 °C.
Glass capillary	BEIBOBOMEI	RD0910	0.9-1.1 mm*100 mm
Laboratory parafilm	PARAFILM	PM996	transparent film
Pipette puller	CHENGDU INSTRUMENT FACTORY	WD-2	Pulling condition: 500 °C for 15 s
Platinum elctrodes	Home made		0.5 mm diameter, 1.5 mm interval.
Rubber tube	Sigma-Aldrich	A5177
Tissue Dissection and Fixation
Forceps	RWD	F11020-11	Tip size: 0.05*0.01 mm
Other surgery tools	RWD
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127	Freshly made 4% PFA solution in phosphate-buffered saline can be stored in 4 °C for up to 1 week.
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	DOW	01673921	For black background plates, food-grade carbon powder is applied.
Sectioning
Cryostat	LEICA	CM1850
Gelatin	Sigma-Aldrich	G9391	From bovine skin.
Sliding microtome	LEICA	SM2010
Immunostaining
Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse	Abcam	ab150113	1:500 dilution, RRID: AB_2576208
Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit	Abcam	ab150078	1:500 dilution, RRID: AB_2722519
DAPI	Abcam	ab285390	1: 1000 dilution
Fluoromount-G mounting medium	Southern Biotech	Sb-0100-01
FMRP antibody	Y. Wang, Florida State University	#8263	1:1000 dilution, RRID: AB_2861242
Islet-1 antibody	DSHB	39.3F7	1:100 dilution, RRID: AB_1157901
Netwell plate	Corning	3478
Neurofilament antibody	Sigma-Aldrich	N4142	1:1000 dilution, RRID: AB_477272
Parvalbumin antibody	Sigma-Aldrich	P3088	1:10000 dilution, RRID: AB_477329
SNAP25 antibody	Abcam	ab66066	1:1000 dilution, RRID: AB_2192052
Imaging
Adobe photoshop	ADOBE		image editing software
Confocal microscope	LEICA	SP8
Fluorescent stereomicroscope	OLYMPUS	MVX10
Olympus Image-Pro Plus 7.0	OlYMPUS		commercial image processing software package