Methodenartikel

Ontleedende cel-autonome functie van fragiele X mentale retardatie-eiwit in een auditief circuit door In Ovo-elektroporatie

DOI:

10.3791/64187

⸱

6 juli 2022

 ,  ,  , 
1Division of Histology & Embryology, Key Laboratory for Regenerative Medicine of the Ministry of Education, College of Medicine, Jinan University, 2Department of Clinical Pathology, First Affiliated Hospital of Jinan University, 3Program in Neuroscience, Department of Biomedical Sciences, College of Medicine, Florida State University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van ovo-elektroporatie hebben we een methode ontwikkeld om selectief het auditieve binnenoor en de cochleaire kern in kippenembryo's te transfecteren om een celgroepspecifieke knockdown van fragiele X mentale retardatie-eiwit te bereiken tijdens discrete perioden van circuitassemblage.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fragiele X mentale retardatie-eiwit (FMRP) is een mRNA-bindend eiwit dat de lokale eiwittransformatie reguleert. FMRP-verlies of disfunctie leidt tot afwijkende neuronale en synaptische activiteiten bij fragiele X-syndroom (FXS), dat wordt gekenmerkt door intellectuele achterstand, sensorische afwijkingen en sociale communicatieproblemen. Studies naar FMRP-functie en FXS-pathogenese zijn voornamelijk uitgevoerd met Fmr1 (het gen dat codeert voor FMRP) knock-out bij transgene dieren. Hier rapporteren we een in vivo methode voor het bepalen van de cel-autonome functie van FMRP tijdens de periode van circuitassemblage en synaptische vorming met behulp van kippenembryo's. Deze methode maakt gebruik van fase-, plaats- en richtingsspecifieke elektroporatie van een geneesmiddel-induceerbaar vectorsysteem met Fmr1 klein haarspeld-RNA (shRNA) en een EGFP-verslaggever. Met deze methode bereikten we selectieve FMRP-knockdown in het auditieve ganglion (AG) en in een van zijn hersenstamdoelen, de nucleus magnocellularis (NM), waardoor een componentspecifieke manipulatie binnen het AG-NM-circuit werd geboden. Bovendien maakt het mozaïekpatroon van de transfectie controles binnen het dier en naburige neuron / vezelvergelijkingen mogelijk voor verbeterde betrouwbaarheid en gevoeligheid bij het analyseren van gegevens. Het induceerbare vectorsysteem biedt temporele controle over het begin van genbewerking om accumulerende ontwikkelingseffecten te minimaliseren. De combinatie van deze strategieën biedt een innovatief hulpmiddel om de cel-autonome functie van FMRP in synaptische en circuitontwikkeling te ontleden.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fragiele X-syndroom (FXS) is een neurologische ontwikkelingsstoornis die wordt gekenmerkt door een verstandelijke beperking, sensorische afwijkingen en autistisch gedrag. In de meeste gevallen wordt FXS veroorzaakt door een wereldwijd verlies van fragiel X-mentaal retardatie-eiwit (FMRP; gecodeerd door het Fmr1-gen) vanaf vroege embryonale stadia1. FMRP is een RNA-bindend eiwit dat normaal tot expressie komt in de meeste neuronen en gliacellen in de hersenen, evenals in sensorische organen 2,3,4. In zoogdierhersenen wordt FMRP waarschijnlijk geassocieerd met honderden mRNA's die coderen voor eiwitten die belangrijk zijn voor verschillende neurale activiteiten5. Studies van conventionele Fmr1 knock-out dieren toonden aan dat FMRP-expressie bijzonder belangrijk is voor de assemblage en plasticiteit van synaptische neurotransmissie6. Verschillende voorwaardelijke en mozaïek knock-outmodellen hebben verder aangetoond dat FMRP-acties en -signalen variëren tussen hersengebieden, celtypen en synaptische locaties tijdens verschillende ontwikkelingsgebeurtenissen, waaronder axonale projectie, dendritische patronen en synaptische plasticiteit 7,8,9,10,11,12,13,14 . Acute functie van FMRP bij het reguleren van synaptische transmissie werd bestudeerd door intracellulaire toediening van remmende FMRP-antilichamen of FMRP zelf in hersenplakken of gekweekte neuronen 15,16,17,18. Deze methoden bieden echter niet de mogelijkheid om FMRP-misexpressie-geïnduceerde gevolgen tijdens de ontwikkeling te volgen. Het ontwikkelen van in vivo methoden om de cel-autonome functies van FMRP te onderzoeken is dus in grote behoefte, en naar verwachting zal het helpen bepalen of de gerapporteerde anomalieën bij FXS-patiënten directe gevolgen zijn van FMRP-verlies in de geassocieerde neuronen en circuits, of secundaire gevolgen afgeleid van netwerkbrede veranderingen tijdens ontwikkeling19.

De auditieve hersenstam van kippenembryo's biedt een uniek voordelig model voor diepgaande functionele analyses van FMRP-regulatie in circuit- en synapsontwikkeling. De gemakkelijke toegang tot embryonale kippenhersenen en de gevestigde ovo-elektroporatietechniek voor genetische manipulatie hebben sterk bijgedragen aan ons begrip van de ontwikkeling van de hersenen in vroege embryonale stadia. In een onlangs gepubliceerde studie werd deze techniek gecombineerd met geavanceerde moleculaire hulpmiddelen die temporele controle van FMRP-misexpressie20,21 mogelijk maken. Hier is de methodologie geavanceerd om selectieve manipulaties van presynaptische en postsynaptische neuronen afzonderlijk te induceren. Deze methode is ontwikkeld in het auditieve hersenstamcircuit. Akoestisch signaal wordt gedetecteerd door haarcellen in het auditieve binnenoor en vervolgens overgebracht naar het auditieve ganglion (AG; ook wel het spiraalganglion bij zoogdieren genoemd). Bipolaire neuronen in de AG innerveren haarcellen met hun perifere processen en sturen op hun beurt een centrale projectie (de gehoorzenuw) naar de hersenstam waar ze eindigen in twee primaire cochleaire kernen, de nucleus magnocellularis (NM) en de nucleus angularis (NA). Neuronen in de NM zijn structureel en functioneel vergelijkbaar met de bolvormige bossige cellen van de anteroventrale cochleaire kern van zoogdieren. Binnen de NM synapsen gehoorzenuwvezels (ANF's) op de somata van NM-neuronen via de grote eindbulb van Held terminals22. Tijdens de ontwikkeling ontstaan NM-neuronen uit rhombomeren 5 en 6 (r5/6) in de achterhersenen23, terwijl AG-neuronen zijn afgeleid van neuroblasten die zich in de otocyste24 bevinden. Hier beschrijven we de procedure om selectief FMRP-expressie in de presynaptische AG-neuronen en in de postsynaptische NM-neuronen afzonderlijk af te slaan.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eieren en kippenembryo's werden met zorg en respect behandeld in overeenstemming met de dierprotocollen die zijn goedgekeurd door de Jinan University Animal Care and Use Committee.

1. Bereiding van eieren en plasmide

  1. Eierbereiding
    1. Verkrijg verse bevruchte kippeneieren (Gallus gallus) van de South China Agricultural University en bewaar bij 16 °C vóór de incubatie. Voor optimale levensvatbaarheid, zet alle eieren voor incubatie binnen een week na aankomst.
    2. Plaats de eieren horizontaal en broed bij 38 °C gedurende 46-48 uur tot Hamburger en Hamilton (HH) stadium 1225 voor neurale buistransfectie, of gedurende 54-56 uur tot HH13 voor otocyste transfectie. Omdat de dierlijke pool van het ei lichter is dan de plantaardige paal, plaatst horizontale plaatsing het embryo op de bovenkant van het ei voor eenvoudige manipulatie. Wees voorzichtig om het ei horizontaal te houden in deze en alle volgende stappen.
    3. De locatie van het embryo verschijnt als een donker gebied op de eierschaal bij het werpen van licht vanaf de bodem van het ei met behulp van een zaklamp. Gebruik in de gewenste HH-stadia deze zaklampmethode om de locatie van het embryo op de eierschaal met potlood te markeren.
    4. Veeg de eieren af met gaas dat 75% ethanol bevat. Boor een gat in het puntige uiteinde van de eieren met behulp van de punt van de schaar en verwijder 2 ml albumine met een naaldspuit van 18 G. Zorg ervoor dat het gat alleen groot genoeg is om naaldinbrenging mogelijk te maken. Veeg eventuele lekkende albumine weg met gaas en sluit het gat af met doorzichtige tape.
    5. Om scheuren te minimaliseren en om vallend schelpafval tijdens het vensteren te voorkomen, bedekt u de bovenkant van eieren met doorzichtige tape, gecentreerd op het met potlood gemarkeerde donkere gebied.
  2. Plasmide DNA extractie
    1. Kloon kip Fmr1 shRNA met behulp van een transposon-gebaseerd Tet-on systeem zoals eerder beschreven20. Dit systeem bevat drie plasmiden: pCAGGS-T2TP, pT2K-CAGGS-rtTA-M2 en pT2K-BI-TRE-EGFP-Fmr1 shRNA, dat een geneesmiddel-induceerbaar vectorsysteem biedt waarmee de expressie van Fmr1-shRNA en EGFP na transfectie tot zwijgen wordt gebracht en kan worden ingeschakeld door doxycycline (Dox) inductie.
      OPMERKING: Deze plasmiden zijn momenteel niet beschikbaar in een repository. De auteurs stemmen ermee in om de plasmiden op redelijk verzoek te verstrekken.
    2. Extraheer plasmide-DNA's met behulp van een endotoxinevrije bereidingskit volgens de instructies van de fabrikant en stort neer door 1/15 volume van 7,5 M natriumacetaat en 1 volume van 100% isopropanol toe te voegen.
    3. Zet plasmiden 's nachts neer bij -20 °C en centrifugeer bij 13.000 x g gedurende 10 minuten. Los de pellet op met de Tris-EDTA-buffer in de kit tot een eindconcentratie van 4-5 μg/μL. Plasmiden kunnen gedurende 12 maanden bij -20 °C worden bewaard zonder verminderde transfectie-efficiëntie.
    4. Meng op de dag van elektroporatie grondig 2 μL van elk plasmide in een steriele centrifugebuis met behulp van een pipetpunt. Het resulterende volume van 6 μL van het plasmidemengsel is voldoende om drie dozijn eieren te elektropoteren. Om het plasmide tijdens elektroporatie te visualiseren, voegt u 1 μL 0,1% snelgroen (bereid in steriel ddH2O) toe voor elke 6 μL DNA-mengsel26, waardoor het plasmidemengsel blauw wordt.

2. In ovo elektroporatie

  1. Eivensters en embryo-identificatie
    1. Verwijder op de dag van elektroporatie de eieren uit de broedmachine, een dozijn eieren per keer. Eieren langer dan 1 uur uit hun broedmachine houden, introduceert ontwikkelingsvariaties en vermindert de levensvatbaarheid.
    2. Veeg alle operatiegereedschappen af met gaas dat 75% ethanol bevat.
    3. Leg elk ei in een op maat gemaakte schuimhouder. Veeg het met tape bedekte gebied af met 75% ethanol en knip een venster (1-2 cm2) rond de omtrek van de potloodmarkering met een kleine schaar (figuur 1A). Houd bij het knippen de schaar plat om te voorkomen dat het embryo eronder wordt beschadigd.
    4. Plaats het vensterei onder een stereomicroscoop met een 10x oculair en 2x zoom en identificeer het embryo. Pas de hoek en helderheid van de lichtbron aan voor een betere visualisatie.
      OPMERKING: Het vergt oefening en ervaring om het embryo te visualiseren en de neurale buis in dit stadium te identificeren.
      1. Voor beginners, gebruik de volgende optionele inktinjectie om de identificatie van embryo's te vergemakkelijken. Bereid 10% Indiase inktoplossing in 0,01 M fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en autoclaaf van tevoren. Vul een spuit van 1 ml met de inktoplossing en plaats vervolgens een naald van 27 G. Buig de naald in een hoek van 45° met een tang.
      2. Steek onder de microscoop voorzichtig vanaf de rand van het gebied opaca en steek de naald onder het embryo in. Injecteer ~ 50 μL inkt, die onder het gebied pellucida diffundeert voor embryovisualisatie. De inkt vormt een donkere achtergrond voor een duidelijke visualisatie van het embryo.
        OPMERKING: Verwijder de lucht uit de spuit voordat u deze inbrengt en injecteert. Wanneer u bedreven bent in het visualiseren, vermijd dan de stap van de inktinjectie, omdat dit de overlevingskans vermindert.
  2. Neurale buisinjectie en elektroporatie
    OPMERKING: Deze procedure wordt uitgevoerd bij HH12 voor het transfecteren van NM-neuronen in de hersenstam.
    1. Trek glazen haarvaten (~ 1 mm in diameter en 100 mm lang) in pipetten met behulp van een pipettrekker. Open onder een ontleedmicroscoop voorzichtig de punt van de capillaire naald tot 10-20 μm in diameter met een tang. Bewaar de pipetten (meestal 5-10 tegelijk) in een opbergdoos tot gebruik.
    2. Vul een capillaire pipet met 0,5-1 μL van het plasmidemengsel door negatieve druk uit te oefenen door een rubberen buis aan het einde van de pipet. Dit kan worden bereikt door een spuit of luchtpomp.
    3. Plaats het ei onder de microscoop zodat het embryo verticaal georiënteerd is met de staart bij u in de buurt (of horizontaal voor het injecteren van capillaire pipetten met behulp van een drieassige manipulator). Houd de capillaire pipet met één hand of met de drieassige manipulator en drijf de punt van de pipet naar de r5/6 in een staart-tot-koprichting.
      OPMERKING: Het meest voorste achterhersenengebied is r1 en elke volgende uitstulping langs de neurale buis is een individueel rhombomeer. R5/6 bevindt zich op hetzelfde anteroposteriorniveau als de otocyste, wat een gemakkelijk herkenbare bekerachtige structuur is (figuur 1B-C).
    4. Prik de punt voorzichtig door het vitellinemembraan en in de dorsale neurale buis en trek vervolgens de pipet een beetje terug zodat de punt in het lumen van de neurale buis zit. Injecteer het plasmidemengsel door luchtdruk uit te oefenen totdat het getinte plasmide volledig diffundeert in r5/6 en zich uitstrekt tot r3 en r4.
      OPMERKING: Het is niet nodig om een sleuf op het vitellinemembraan te maken voor injectie.
    5. Controleer op een succesvolle injectie, die wordt bereikt wanneer de blauwe plasmide-oplossing snel door de neurale buis diffundeert zonder te lekken (figuur 1B-C). Wanneer er lekkage optreedt, vervaagt het blauw snel.
    6. Plaats onmiddellijk na de injectie een platina bipolaire elektrode aan weerszijden van de neurale buis (figuur 1D). Lever twee pulsen van 12 V en 50 ms met een elektroporator. Observeer luchtbellen aan de uiteinden van de bipolaire elektrode, met meer aan de negatieve kant.
    7. Controleer op succesvolle elektroporatie, die wordt bereikt wanneer het getinte plasmidemengsel het neurale buisweefsel in de buurt van de positieve kant van de elektrode binnendringt. Verwijder na elektroporatie voorzichtig de bipolaire elektrode.
    8. Bedek het venster op de eierschaal met een stuk transparante film dat in vierkanten in 2 is voorgesneden en met 75% ethanol is bespoten. Leg het ei terug in de broedmachine.
    9. Reinig de bipolaire elektrode door 10-20 pulsen van 12 V en 50 ms duur in zoutoplossing af te geven voordat u doorgaat naar het volgende ei.
  3. Otocyst injectie en elektroporatie
    OPMERKING: Deze procedure wordt uitgevoerd bij HH13 voor het transfecteren van haarcellen en AG-neuronen in het binnenoor.
    1. Bij HH13 (dat is ~embryonale dag 2.5) is het embryo gedraaid zodat de rechterkant van het hoofd naar boven is gericht. Plaats het ei onder de microscoop zo dat het embryo verticaal is, met de staart bij u in de buurt. Houd de capillaire pipet vast en prik de rechterotocyst voorzichtig in dorsolaterale richting (figuur 2A).
      OPMERKING: In dit stadium verschijnt de otocyst als een kleine cirkelvormige structuur aan de bovenkant van het lichaam op hetzelfde anteroposteriorniveau als r5/6.
    2. Injecteer het plasmidemengsel met luchtdruk totdat de otocyste is gevuld met blauwe oplossing27. Controleer op een succesvolle injectie, die wordt bereikt wanneer het blauwe plasmidemengsel zich in de otocyste bevindt en niet lekt.
    3. Plaats onmiddellijk na de injectie de bipolaire elektrode op de otocyste zoals afgebeeld in figuur 2B. Plaats de positieve en negatieve zijden respectievelijk voor en achteraan ten opzichte van de otocyste. Lever twee pulsen van 12 V en 50 ms duur met de elektroporator.
    4. Controleer op succesvolle elektroporatie, die wordt bereikt wanneer het blauwe plasmidemengsel het weefsel van de otocyste in de buurt van de positieve kant van de elektrode binnendringt. Verwijder na elektroporatie voorzichtig de bipolaire elektrode. Bedek het venster op de eierschaal met een transparante film en breng het ei terug naar de couveuse.

3. Toediening van Dox om plasmidetranscriptie te initiëren en te onderhouden

  1. Bereiding van de Dox-oplossing
    1. Meet 100 mg Dox-poeder onder een chemische kap en los het op in 100 ml steriel PBS om een werkoplossing van 1 mg / ml te maken. Filtreer de oplossing met een filter van 0,22 μm en bewaar 1 ml aliquots bij -20 °C. Bescherm tegen licht 20,28.
  2. Toediening van Dox
    1. Voor volledige genbewerking, op 24 uur voor de gewenste leeftijd, ontdooi een Dox aliquot op ijs. Laat 50 μL Dox direct op het chorioallantoïsche membraan van het ei vallen met behulp van een spuit die de transparante film binnendringt. Sluit het naaldgat na injectie af met transparante film of tape.
    2. Om het knockdown-effect te behouden, dient u Dox om de andere dag toe totdat het weefsel in het gewenste ontwikkelingsstadium is geoogst.

4. Weefseldissectie en -sectie

  1. Hersenstam
    1. Voor embryo's in embryonaal stadium 3 (E3) en E6, open de eierschaal en knip het bijbehorende membraan met een schaar. Schep het embryo eruit en dompel het onder in 4% paraformaldehyde (PFA) in 0,1 M fosfaatbuffer.
    2. Voor E9-embryo's opent u de eierschaal, onthoofdt u het embryo met een schaar en brengt u de kop over op een plaat met siliciumbodem gevuld met PBS. Pin het hoofd naar beneden door de banen en snijd de bovenkant van de schedel uit elkaar. Plaats de tang voorzichtig van beide kanten onder de hersenen en til de hele hersenen uit de schedel met de schouders van de tang. Dompel de hersenen onder in 4% PFA.
    3. Voor E15- en E19-embryo's opent u de eierschaal, onthoofdt u het embryo met een schaar en plaatst u de kop op een plaat met siliconenbodem gevuld met PBS. Knip de huid bovenop het hoofd open om de schedel bloot te leggen.
    4. Snijd verticaal door de schedel met een scheermes om de voorhersenen en de caudale hersenen te scheiden. Dompel het caudale blok onder in PBS, verwijder de bovenkant van de schedel en haal vervolgens de hersenen van de schedel.
    5. Pin de hersenen vast door de optische kwab en scheid het cerebellum en de hersenstam. Zorg ervoor dat u de auditieve hersenstam, die zich direct onder het cerebellum bevindt, niet beschadigt. Verwijder zoveel mogelijk dura uit de hersenstam en dompel het vervolgens onder in 4% PFA.
    6. Houd embryo's en hersenweefsels 's nachts in 4% PFA bij 4 °C, behalve voor E19-hersenstammen, die gedurende 24 uur onder dezelfde conditie moeten worden bewaard.
    7. Na fixatie droogt u het weefsel in PBS met 30% sucrose uit totdat het bezinkt, wat meestal 1-3 dagen duurt, afhankelijk van de leeftijd.
    8. Sectie van de hersenstam (E15 en E19) op 30 μm op het coronale vlak met behulp van een glijdende microtoom. Verzamel secties in PBS en bewaar bij 4 °C voordat immunostaining.
    9. Voor E3- en E6-embryo's en E9-hersenstammen, sectie bij 50 μm transversaal. Verzamel secties in PBS en bewaar bij 4 °C. Monteer de secties op gelatine-gecoate microscoopglaasjes voordat ze immunostainen. Het verzamelen van dikkere secties voor deze leeftijden vergemakkelijkt de weefselbehandeling.
  2. Gehoorgang
    1. Na het verwijderen van de hersenstammen van E9-, E15- en E19-embryo's, is het gehoorkanaal, dat is ingebed in het temporale bot, gemakkelijk identificeerbaar onder de schedel en is het temporale bot gemakkelijk te scheiden van de omliggende schedel. Voor E9-embryo's fixeert u het hele temporale bot in 4% PFA. Verwijder voor oudere embryo's de benige structuur van het temporale bot om het gehoorkanaal te isoleren en het gehoorkanaal in 4% PFA te fixeren.
    2. Bewaar alle temporale botten en gehoorgangen in 4% PFA bij 4 °C 's nachts voordat weefsel zich insluit.
    3. Voer weefselinbedding uit zoals beschreven. Bereid de inbeddingsoplossing als volgt: Week 10% gelatine (van runderhuid) in koud water totdat de gelatinekorrels opzwellen en bezinken (ongeveer 30 min). Verwarm het mengsel tot ~50 °C om de gelatine op te lossen en voeg 20% sucrose toe aan de gelatine-oplossing en roer om op te lossen. Bewaar de gelatine-sucrose-oplossing bij 4 °C gedurende maximaal een maand.
    4. Verwarm voor gebruik de gelatine-sucrose-oplossing op 37 °C. Week de temporale botten/gehoorkanalen in de warme gelatine-sucrose-oplossing op een 96-well plaat bij 37 °C totdat ze bezinken, meestal 30-60 min.
    5. Bekleed de bodem van de putten van een 12-well plaat met een strook transparante film. Voeg een laag warme gelatine-sucrose-oplossing toe en wacht tot deze stolt. Breng een temporale bot / auditieve kanaal over naar elke put.
    6. Implanteer het weefsel met een tweede laag warme gelatine-sucrose-oplossing. Pas de positie van het weefsel aan zodat het zich in het midden van de gel bevindt en het gehoorkanaal horizontaal is georiënteerd. Plaats de plaat voorzichtig in een koelkast van 4 °C en wacht tot de gel stevig is.
    7. Trek aan de transparante filmstrook om het gelweefselblok uit de put te verplaatsen. Snijd extra gel in een vierkant blok en snijd een hoek van het blok om de oriëntatie te identificeren. Wikkel het gelatineblok met een stuk folie, vries het droogijs in en bewaar het vervolgens bij -80 °C tot het in sectie is genomen.
    8. Doorsnede van het blok op 20 μm langs de lengtegraad van het gehoorkanaal met een cryostaat. Monteer de secties direct op met gelatine beklede microscoopglaasjes. Bewaar de dia's bij -80 °C voordat ze immunostainen.
    9. Voordat u immunostaining gebruikt, dompelt u de dia's gedurende 5 minuten onder in voorverwarmd PBS (45 °C) om de gelatine op te lossen en wast u de dia's vervolgens 3x met PBS op kamertemperatuur om resterende gelatine te verwijderen.

5. Immunostaining en microscoop beeldvorming

OPMERKING: Er worden twee soorten immunostaining uitgevoerd, afhankelijk van of secties op dia's zijn gemonteerd of vrij zweven in PBS.

  1. Immunostaining op dia's
    1. Was de dia's 3x gedurende 10 minuten elk met PBS. Omcirkel het gebied met de secties met een oliepen om te voorkomen dat vloeistof lekt tijdens het kleuren. Bedek de secties met een blokkerende oplossing met 5% normaal geitenserum in PBS en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
    2. Verdun de primaire antilichamen (voor de uiteindelijke gebruikte concentratie raadpleegt u de tabel met materialen) in PBS met 0,3% TritonX-100 en 5% normaal geitenserum. Verwijder de blokkerende oplossing en bedek de secties vervolgens met de primaire antilichaamoplossing. Incubeer de dia's bij 4 °C 's nachts in een doos met een laag gedestilleerd water op de bodem.
    3. Spoel de dia's 3x gedurende 10 minuten af met PBS. Breng fluorescerende secundaire antilichamen verdund op 1:500 in PBS met 0,3% TritonX-100 aan op dia's. Incubeer de dia's bij kamertemperatuur gedurende 4 uur, afgeschermd van licht.
    4. Was de dia's 3x met PBS. Laat voorzichtig twee druppels montagemedium op de dia's vallen en bedek de secties met coverslips. Zorg ervoor dat u geen luchtbellen genereert tussen de coverslip en de dia.
  2. Immunostaining voor embryo's en vrij zwevende secties
    1. Was de embryo's/secties met PBS 3x gedurende 10 minuten elk in een putplaat. Verdun de primaire antilichamen in PBS met 0,3% TritonX-100 en 5% normaal geitenserum in centrifugale buizen. Breng elk embryo/elke sectie over in een buis met een glazen haak en incubeer op een shaker bij 60 rpm 's nachts bij 4 °C.
    2. Was embryo's/secties 3x met PBS gedurende 10 minuten elk in een putplaat. Breng elk embryo/elke sectie over in een donkere centrifugale buis gevuld met fluorescerende secundaire antilichaamoplossing en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 4 uur op de shaker.
    3. Was de embryo's/secties 3x met PBS in een putplaat. Gebruik een borstel om de secties op gelatine-gecoate microscoopglaasjes in een schaal van 15 cm met PBS te monteren. Nadat de dia's enigszins zijn gedroogd (~ 5 min), breng twee druppels montagemedium aan en plaats een coverslip. Zorg ervoor dat u geen luchtbellen genereert tussen de coverslip en de dia. Bewaar de hele montageweefsels in PBS voor beeldvorming.
  3. Beeldvorming
    1. Beeld de hele montageweefsels in PBS voor in een schaal met een siliconen bodem met koolstofpoeder, dat een zwarte achtergrond biedt. Leg beelden vast en verwerk ze met behulp van een Commercieel Olympus-softwarepakket voor beeldverwerking, zoals eerder beschreven29.
    2. Beeld de secties op de dia's af met een confocale microscoop zoals eerder beschreven20. Stel de secties voor op een enkel brandpuntsvlak met 10x, 20x en 63x doelstellingen. Leg alle afbeeldingen van hetzelfde dier vast met dezelfde parameters. Zorg ervoor dat u het laserniveau en de instellingen voor beeldvormingsacquisitie aanpast om signaalverzadiging te voorkomen.
    3. Voer beeldverwerking uit met behulp van de Fiji-software. Pas ter illustratie de helderheid, het contrast en het gamma van afbeeldingen aan met behulp van professionele beeldbewerkingssoftware.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Door ovo-elektroporatie uit te voeren op verschillende locaties en in verschillende ontwikkelingsstadia, bereikten we selectieve FMRP-knockdown in de auditieve periferie of in de auditieve hersenstam.

FMRP knockdown in NM
Klein haarspeld RNA (shRNA) tegen de kip Fmr1 werd ontworpen en gekloond in het Tet-On vectorsysteem zoals eerder beschreven20. De opstelling voor in ovo-elektroporatie is weergegeven in

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om de cel-autonome functie van FMRP te bepalen, is het manipuleren van de expressie ervan in individuele celgroepen of celtypen noodzakelijk. Aangezien een van de belangrijkste functies van FMRP is om synaptische vorming en plasticiteit te reguleren, is het selectief manipuleren van elke synaptische component van een bepaald circuit een voorwaarde voor een volledig begrip van het FMRP-mechanisme in synaptische communicatie. Met behulp van ovo-elektroporatie van kippenembryo's de...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd ondersteund door: een national natural science foundation of China grant (nr. 32000697); het wetenschaps- en technologieprogramma van Guangzhou (202102080139); de Guangdong Natural Science Foundation (2019A1515110625, 2021A1515010619); de Fondsen voor fundamenteel onderzoek voor de Centrale Universiteiten (11620324); een onderzoeksbeurs van Key Laboratory of Regenerative Medicine, Ministerie van Onderwijs, Jinan University (Nr. ZSYXM202107); de fondsen voor fundamenteel onderzoek voor de centrale universiteiten van China (21621054); en de Medical Scientific Research Foundation van de provincie Guangdong in China (20191118142729581). We bedanken het medisch experimenteel centrum van Jinan University. Wij danken Dr. Terra Bradley voor de zorgvuldige bewerking van het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Ei-incubatie
16 °C koelkastMAGATWordt gebruikt voor het bewaren van bevruchte eieren.
Ei-incubatorSHANGHAI BOXUNGZX-9240MBE
Bevruchte eierenFarm of South China Agricultural UniversityEieren moeten binnen een week worden gebruikt voor optimale levensvatbaarheid.
Plasmidvoorbereiding
CentrifugeSigma10016
Fast greenSolarbioG1661Maak 0,1% werkoplossing in gedestilleerd water en autoclaveer.
Plasmid Maxi-prep kitQIAGEN12162Los plasmide-DNA op in Tris-EDTA (TE) buffer; endotoxine-vrije voorbereidingskit
NatriumacetaatSigma-AldrichS2889Maak 7,5M werkoplossing in nuclase-vrij water.
Electroporatie en doxycycline-toediening
ElectroporatorBTXECM399
1 mL / 5 mL spuitGUANGZHOU KANGFULAI
DissectiemicroscoopCNOPTECSZM-42
DoxcyclineSigma-AldrichD9891Gebruik verse aliquoten voor elke dosis en bewaar bij -20 °C.
Glas capillairBEIBOBOMEIRD09100.9-1.1 mm*100 mm
Laboratorium parafilmPARAFILMPM996transparante film
PipettrekkerCHENGDU INSTRUMENT FACTORYWD-2Trekvoorwaarde: 500 °C gedurende 15 s
Platinum elektrodenZelfgemaakt0.5 mm diameter, 1.5 mm interval.
RubriekslangSigma-AldrichA5177
Weefseldissectie en fixatie
PincetRWDF11020-11Tip grootte: 0.05*0.01 mm
Andere chirurgische gereedschappenRWD
ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127Frisse gemaakte 4% PFA oplossing in fosfaatgebufferd zout kan worden bewaard bij 4 °C tot maximaal 1 week.
SYLGARD 184 Silicone Elastomer KitDOW01673921Voor zwarte achtergrondplaten wordt voedselkwaliteit koolstofpoeder aangebracht.
Sectievorming
CryostatLEICACM1850
GelatineSigma-AldrichG9391Van runderhuid.
Schuifende microtoomLEICASM2010
Immunokleuring
Alexa Fluor 488 geit anti-MuisAbcamab1501131:500 verdunning, RRID: AB_2576208
Alexa Fluor 555 geit anti-konijnAbcamab1500781:500 verdunning, RRID: AB_2722519
DAPIAbcamab2853901: 1000 verdunning
Fluoromount-G montagemediumSouthern BiotechSb-0100-01
FMRP antilichaamY. Wang, Florida State University#82631:1000 verdunning, RRID: AB_2861242
Islet-1 antilichaamDSHB39.3F71:100 verdunning, RRID: AB_1157901
Netwell plaatCorning3478
Neurofilament antilichaamSigma-AldrichN41421:1000 verdunning, RRID: AB_477272
Parvalbumin antilichaamSigma-AldrichP30881:10000 verdunning, RRID: AB_477329
SNAP25 antilichaamAbcamab660661:1000 verdunning, RRID: AB_2192052
Beeldvorming
Adobe photoshopADOBEbeeldbewerkingssoftware
Confocale microscoopLEICASP8
Fluorescente stereomicroscoopOLYMPUSMVX10
Olympus Image-Pro Plus 7.0OLYMPUcommercieel beeldverwerkingssoftwarepakket

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hagerman, R. J., et al. Fragile X syndrome. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17065(2017).
  2. Hinds, H. L., et al. Tissue specific expression of FMR-1 provides evidence for a functional role in fragile X syndrome. Nature Genetics. 3 (1), 36-43 (1993).
  3. Frederikse, P. H., Nandanoor, A., Kasinathan, C. Fragile X Syndrome FMRP co-localizes with regulatory targets PSD-95, GABA receptors, CaMKIIalpha, and mGluR5 at fiber cell membranes in the eye lens. Neurochemical Research. 40 (11), 2167-2176 (2015).
  4. Zorio, D. A., Jackson, C. M., Liu, Y., Rubel, E. W., Wang, Y. Cellular distribution of the fragile X mental retardation protein in the mouse brain. Journal of Comparative Neurology. 525 (4), 818-849 (2017).
  5. Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
  6. Bakker, C. E., Oostra, B. A. Understanding fragile X syndrome: insights from animal models. Cytogenetic and Genome Research. 100 (1-4), 111-123 (2003).
  7. Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).
  8. Deng, P. Y., Sojka, D., Klyachko, V. A. Abnormal presynaptic short-term plasticity and information processing in a mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 31 (30), 10971-10982 (2011).
  9. Patel, A. B., Hays, S. A., Bureau, I., Huber, K. M., Gibson, J. R. A target cell-specific role for presynaptic Fmr1 in regulating glutamate release onto neocortical fast-spiking inhibitory neurons. Journal of Neuroscience. 33 (6), 2593-2604 (2013).
  10. Patel, A. B., Loerwald, K. W., Huber, K. M., Gibson, J. R. Postsynaptic FMRP promotes the pruning of cell-to-cell connections among pyramidal neurons in the L5A neocortical network. Journal of Neuroscience. 34 (9), 3413-3418 (2014).
  11. Higashimori, H., et al. Selective deletion of astroglial FMRP dysregulates glutamate transporter GLT1 and contributes to Fragile X syndrome phenotypes in vivo. Journal of Neuroscience. 36 (27), 7079-7094 (2016).
  12. Hodges, J. L., et al. Astrocytic contributions to synaptic and learning abnormalities in a mouse model of Fragile X syndrome. Biological Psychiatry. 82 (2), 139-149 (2017).
  13. Gonzalez, D., et al. Audiogenic seizures in the Fmr1 knock-out mouse are induced by Fmr1 deletion in subcortical, VGlut2-expressing excitatory neurons and require deletion in the inferior colliculus. Journal of Neuroscience. 39 (49), 9852-9863 (2019).
  14. Bland, K. M., et al. FMRP regulates the subcellular distribution of cortical dendritic spine density in a non-cell-autonomous manner. Neurobiology of Disease. 150, 105253(2021).
  15. Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. Fragile X mental retardation protein induces synapse loss through acute postsynaptic translational regulation. Journal of Neuroscience. 27 (12), 3120-3130 (2007).
  16. Pfeiffer, B. E., et al. Fragile X mental retardation protein is required for synapse elimination by the activity-dependent transcription factor MEF2. Neuron. 66 (2), 191-197 (2010).
  17. Deng, P. Y., et al. FMRP regulates neurotransmitter release and synaptic information transmission by modulating action potential duration via BK channels. Neuron. 77 (4), 696-711 (2013).
  18. Yang, Y. M., et al. Identification of a molecular locus for normalizing dysregulated GABA release from interneurons in the Fragile X brain. Molecular Psychiatry. 25 (9), 2017-2035 (2020).
  19. Razak, K. A., Dominick, K. C., Erickson, C. A. Developmental studies in fragile X syndrome. Journal of Neurodevelopmental Disorders. 12 (1), 13(2020).
  20. Wang, X., Zorio, D. A. R., Schecterson, L., Lu, Y., Wang, Y. Postsynaptic FMRP regulates synaptogenesis in vivo in the developing cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 38 (29), 6445-6460 (2018).
  21. Wang, X., et al. Temporal-specific roles of fragile X mental retardation protein in the development of the hindbrain auditory circuit. Development. 147 (21), (2020).
  22. Rubel, E. W., Fritzsch, B. Auditory system development: primary auditory neurons and their targets. Annual Review of Neuroscience. 25, 51-101 (2002).
  23. Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain. Developmental Biology. 224 (2), 138-151 (2000).
  24. Chervenak, A. P., Hakim, I. S., Barald, K. F. Spatiotemporal expression of Zic genes during vertebrate inner ear development. Developmental Dynamics. 242 (7), 897-908 (2013).
  25. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
  26. Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem. Journal of Visualized Experiments. (124), e56628(2017).
  27. Evsen, L., Doetzlhofer, A. Gene transfer into the chicken auditory organ by in ovo micro-electroporation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53864(2016).
  28. Schecterson, L. C., Sanchez, J. T., Rubel, E. W., Bothwell, M. TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis. Journal of Neuroscience. 32 (40), 14000-14009 (2012).
  29. Wang, X. Y., et al. High glucose environment inhibits cranial neural crest survival by activating excessive autophagy in the chick embryo. Scientific Reports. 5, 18321(2015).
  30. Yu, X., Wang, X., Sakano, H., Zorio, D. A. R., Wang, Y. Dynamics of the fragile X mental retardation protein correlates with cellular and synaptic properties in primary auditory neurons following afferent deprivation. Journal of Comparative Neurology. 529 (3), 481-500 (2021).
  31. Li, H., et al. Islet-1 expression in the developing chicken inner ear. Journal of Comparative Neurology. 477 (1), 1-10 (2004).
  32. Carr, C. E., Boudreau, R. E. Central projections of auditory nerve fibers in the barn owl. Journal of Comparative Neurology. 314 (2), 306-318 (1991).
  33. Sandell, L. L., Butler Tjaden, N. E., Barlow, A. J., Trainor, P. A. Cochleovestibular nerve development is integrated with migratory neural crest cells. Developmental Biology. 385 (2), 200-210 (2014).
  34. Cramer, K. S., Bermingham-McDonogh, O., Krull, C. E., Rubel, E. W. EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system. Developmental Biology. 269 (1), 26-35 (2004).
  35. Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1. Journal of Neuroscience. 33 (9), 3879-3890 (2013).
  36. Curnow, E., Wang, Y. New animal models for understanding FMRP functions and FXS pathology. Cells. 11 (10), 1628(2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Fragiel X syndroomFMRP knockdownkippenembryoklein hairpin RNAEGFP reporterauditieve ganglionnucleus magnocellularisneurale buistransfectie

Gerelateerde artikelen