Mitochondriale overdracht van van muizenvet afgeleide mesenchymale stamcellen naar oude eicellen van muizen

Samenvatting

Hier beschrijven we de isolatie van mitochondriën uit van muizenvet afgeleide mesenchymale stamcellen en brengen we de mitochondriën vervolgens over naar oude muizeneicellen om de kwaliteit van de eicellen te verbeteren.

Samenvatting

Door de afname van de kwantiteit en kwaliteit van eicellen gerelateerd aan leeftijd, is de vruchtbaarheid van vrouwen ouder dan 35 jaar sterk afgenomen. De moleculaire mechanismen die de eicelkwaliteit in stand houden, blijven onduidelijk, dus het is momenteel moeilijk om het geboortecijfer van vrouwen ouder dan 35 jaar te verhogen. Eicellen bevatten meer mitochondriën dan welk type cel dan ook in het lichaam, en elke mitochondriale disfunctie kan leiden tot een verminderde eicelkwaliteit. In de jaren 1990 resulteerde de cytoplasmatische overdracht van eicellen in groot succes bij de menselijke voortplanting, maar ging gepaard met ethische controverses. Autologe mitochondriale transplantatie zal naar verwachting een nuttige techniek zijn om de kwaliteit van eicellen die door ouderdom zijn afgenomen te verhogen. In de huidige studie gebruikten we van vet afgeleide stamcellen van oude muizen als mitochondriëndonor om de kwaliteit van de eicellen van oudere muizen te verhogen. Verdere ontwikkeling van autologe mitochondriale transfertechnologie zal een nieuwe en effectieve behandeling bieden voor onvruchtbaarheid bij oudere vrouwen.

Inleiding

Een van de belangrijke factoren die de vruchtbaarheid van vrouwen beïnvloeden, is de veroudering van de eicel; Achteruitgang van de eicelkwaliteit is de belangrijkste oorzaak van onvruchtbaarheid bij oudere vrouwen. De belangrijkste oorzaak van veroudering van de eicel en het moleculaire mechanisme dat de eicelkwaliteit regelt, zijn echter nog onduidelijk. Eerdere studies hebben aangetoond dat zowel het aantal als de kwaliteit van mitochondriën betrokken zijn bij de kwaliteitscontrole van eicellen en de embryonale ontwikkeling ^1,2,3. De afname van de kwantiteit en kwaliteit van mitochondriën hangt nauw samen met veroudering³.

Er zijn veel pogingen gedaan om de functie van mitochondriën in oude eicellen te verbeteren, waaronder het voedingssupplement van mitochondriën en de overdracht van mitochondriën. Bekende, effectieve voedingssupplementen van mitochondriën zijn onder meer co-enzym Q10 (CoQ10), alfa-liponzuur (α-LA) en resveratrol (RSV)⁴. Studies hebben aangetoond dat suppletie met CoQ10 niet alleen de leeftijdsgerelateerde achteruitgang van de kwantiteit en kwaliteit van eicellen kan verbeteren, maar ook de normale ontwikkeling en ovulatie van eicellen kan bevorderen⁵. α-LA vertraagt de achteruitgang van de eicelkwaliteit als gevolg van veroudering en het metabole fenotype van patiënten met polycysteus ovariumsyndroom (PCOS)^6,7. Resveratrol kan het aantal eicellen met abnormale spoelen en onjuiste chromosoomuitlijning verminderen bij ouder wordende muizen, terwijl het de embryonale ontwikkeling op een dosisafhankelijke manier beïnvloedt⁸. Aangezien het klinische effect van voedingssupplementen van mitochondriën echter niet het verwachte niveau heeft bereikt, moeten andere effectieve behandelingen worden onderzocht.

De eerste poging tot overdracht van mitochondriën werd uitgevoerd in 1997. De overdracht van cytoplasma van jonge donoreicellen naar bejaarde ontvangende eicellen verbeterde de eicelkwaliteit van de oudere patiënten, die met succes gezonde baby's baarden⁹, wat de grondgedachte was achter het gebruik van deze techniek. Allogene cytoplasmatische overdracht van eicellen kan echter niet worden toegepast in de klinische praktijk vanwege twee belangrijke redenen: het probleem van genetische heterogeniteit en regelgevingsproblemen veroorzaakt door transplantatie van donormitochondriën. Een eerdere studie toonde aan dat mitochondriale transplantatie met autologe cellen de kwaliteit van eicellen, de embryonale ontwikkeling en de vruchtbaarheid van oudere muizen kon verbeteren¹⁰, die geen ethische problemen of genetische heterogeniteitsproblemen hadden en enkele problemen oplosten die werden veroorzaakt door de overdracht van donoreicelcytoplasma naar ontvangende eicellen^10,11.

Ondertussen was de autologe celoverdracht van mitochondriën superieur aan het effect van eerdere voedingssupplementen van mitochondriën op het verbeteren van de kwaliteit van eicellen¹¹. Daarom is mitochondriale transplantatie met autologe cellen de juiste keuze voor de klinische toepassing van deze technologie¹². Van vet afgeleide stamcellen (ADSC's) kunnen worden verkregen door minimaal invasieve technologie, zijn gemakkelijk te isoleren en te kweken en kunnen een ideale "zaadcel" zijn voor regeneratieve geneeskunde. Mitochondriën zijn rijk aan ADSC's en de functie van mitochondriën neemt niet af met de leeftijd, wat suggereert dat ADSC's een uitstekende bron van mitochondriën zijn^13,14. In dit protocol introduceren we een methode om de mitochondriën van van muizenvet afgeleide mesenchymale stamcellen over te brengen naar oude muizeneicellen om de eicelkwaliteit te verbeteren. Dit is een nuttig model voor menselijke ADSC autologe mitochondriale transfertechnologie.

Protocol

Alle beschreven dierproeven werden goedgekeurd door de Animal Research Ethics Committee van het Third Affiliated Hospital, Soochow University. Alle activiteiten volgen de juiste richtlijnen voor dierenverzorging en -gebruik en nationale richtlijnen. Zie de Materiaaltabel voor meer informatie over alle materialen, instrumenten en reagentia die in dit protocol worden gebruikt.

1. Isolatie en karakterisering van verouderde mesenchymale stamcellen (ADSC's) van muizen

1. Offer de oude muizen (10 maanden oud, gemiddeld drie) door cervicale dislocatie onder pentobarbital-natriumanesthesie en week ze 5 minuten in 75% alcohol voordat u vetweefsel isoleert.
   OPMERKING: Weken in 75% alcohol gedurende 5 minuten kan de besmetting van primaire cellen effectief verminderen.
2. Maak een incisie van 2 cm in de huid van de bilaterale lies, leg het onderhuidse vet bloot en gebruik een pincet om het onderhuidse vet te isoleren. Verzamel het bilaterale liesvet van de muizen met behulp van een gesteriliseerde oogheelkundige schaar (vermijd het knippen van het onderhuidse weefsel). Plaats het vetweefsel in een steriele centrifugebuis van 15 ml op ijs en transporteer het onmiddellijk naar het celkweeklaboratorium.
3. Breng het vetweefsel over naar een plaat met 6 putjes, spoel deze 3x af met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) die 100 E/ml penicilline en streptomycine bevat. Verwijder de bloedvaten, vette fascia en bindweefsel onder het vetweefsel en snijd ze in stukjes van ~0,5 cm x 0,5 cm x 0,5 cm.
   OPMERKING: Bij het isoleren van vetstamcellen is er vaak sprake van besmetting van vasculaire endotheelcellen. Verwijdering van de bloedvaten uit vetweefsel kan de besmetting van vasculaire endotheelcellen verminderen.
4. Breng het versnipperde vetweefsel over naar hetzelfde volume collagenase type I-oplossing (0,1% eindconcentratie van collagenase type I) en verteer gedurende 30 minuten bij 37 °C.
5. Voeg een gelijk volume volledig kweekmedium (DMEM F-12-medium met 10% foetaal runderserum) toe om het collagenase type I te neutraliseren, centrifugeer bij 600 × g gedurende 10 minuten en gooi het bovenstaande en vetweefsel weg.
6. Resuspendeer de celkorrel in het volledige kweekmedium. Verwijder het onverteerde weefsel door filtratie door een celzeef van 40 μm en centrifugeer vervolgens gedurende 5 minuten bij 600 × g .
7. Resuspendeer de celsuspensie met 5 ml van het volledige kweekmedium en gebruik een pipet van 1 ml om voorzichtig op en neer te pipetten om een eencellige suspensie te vormen. Controleer de celsuspensie onder een microscoop door een aliquot op een hemocytometer te plaatsen om te bevestigen dat er alleen schroeiende cellen zijn, zonder aggregaten. Voeg de eencellige suspensie toe aan een^2-cellige kweekkolf van 25 cm en kweek in een incubator met 5 % CO₂ -cellen bij 37 °C.
8. Verander het kweekmedium 48 uur later. Blijf het kweekmedium elke 2-3 dagen vervangen.
9. Maak de cellen na 7-10 dagen los voor celpassatie wanneer hun samenvloeiing 80%-90% bereikt. Verwijder het volledige kweekmedium en was de cellen met 2 ml PBS. Voeg vervolgens 2 ml 0,05% trypsine/EDTA toe om de celdissociatie uit te voeren^15,16.
10. Voeg gedurende 14 dagen adipogeen inductiemedium toe om differentiatie van de ADSC's in adipoctyes te induceren. Voeg gedurende 28 dagen osteogeen inductiemedium toe aan de ADSC's op 2% met gelatine beklede platen met 24 putjes om hun differentiatie in osteoblasten te induceren. Voor neurale differentiatie kweekt u de ADSC's met neuraal inductiemedium en detecteert u vervolgens neuronspecifiek enolase en neurofilamentmediator polypeptide met behulp van immunofluorescentie¹⁵.
    1. Fixeer de cellen in 4% paraformaldehyde gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door permeabilisatie met 0,5% Triton X-100 in PBS gedurende 15 minuten.
    2. Na blokkering met 3% BSA in PBS, incubeer de cellen met primaire antilichamen (zie Tabel met materialen) verdund in blokkeeroplossing bij 4 °C gedurende een nacht.
    3. Incubeer de cellen gedurende 45 minuten met secundaire antilichamen en kleur ze vervolgens gedurende 10 minuten met DAPI. Onderzoek vervolgens de cellen met een fluorescentiemicroscoop.
11. Verzamel de eencellige ADSC-suspensie met 0,05% trypsine/EDTA, centrifugeer bij 600 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en suspendeer opnieuw in PBS om de celdichtheid aan te passen tot 1 × 10⁶/ml. Verdeel de cel in microcentrifugebuisjes van 1,5 ml (100 μl/buisje) en voeg FITC-gelabelde konijn anti-muis CD29, CD90, CD34 en HLA-DR monoklonale antilichamen toe, met een antilichaamconcentratie van 0,5 μg/ml. Behandel de controlegroep met dezelfde hoeveelheid konijn IgG FITC, broed gedurende 30 minuten op ijs en spoel af met PBS om het ongeconjugeerde antilichaam te verwijderen. Detecteer de ADSC-oppervlaktemarkers door middel van flowcytometrie¹³.

2. Isolatie van mitochondriën uit vetstamcellen

OPMERKING: Alle isolatieoperaties van de mitochondriën moeten op ijs worden uitgevoerd.

1. Wanneer de ADSC's groeien tot 90% dichtheid, verteer de cellen dan met 2 ml 0,05% trypsine/EDTA, centrifugeer op 600 × g gedurende 5 minuten, verzamel en tel de cellen, en neem 1 × 10⁷ cellen voor elke extractie.
2. Resuspendeer de cellen in 2 ml mitochondriale extractiebuffer (voor bufferbereiding: 10 ml 0,1 M Tris-MOPS, 1 ml 0,1 M EGTA/Tris en 20 ml 1 M sucrose; breng het volume op 100 ml met gedestilleerd water en stel de pH in op 7,4) met 1x proteaseremmercocktail na het wassen met 2 ml steriel PBS, en broed vervolgens 5 minuten op ijs.
3. Homogeniseer de cellen 20x-30x met een glashomogenisator (2,0 ml) en controleer de mate van homogenisatie door trypanblauwe kleuring.
   OPMERKING: Het aandeel van de gekleurde cellen moet ~80% zijn. Overmatige homogenisatie zal de structuur van de mitochondriën beschadigen.
4. Centrifugeer de cel homogenaat bij 600 × g gedurende 15 minuten, breng het bovenstaande in een nieuwe, voorgekoelde microcentrifugebuis van 1,5 ml en herhaal de handeling één keer.
5. Centrifugeer het bovenstaande gedurende 15 minuten bij 7.500 × g en gooi het supernatant weg. Was het mitochondriale neerslag en suspendeer het opnieuw door ~100 μL voorgekoelde mitochondriale injectiebuffer toe te voegen (225 mM mannitol, 75 mM sucrose, 10 mM KCl, 10 mM Tris-HCl en 5 mM KH₂PO₄, pH 7,2), in een concentratie van 1-5 mg/ml (totale eiwitconcentratie). Transporteer de mitochondriale suspensie op ijs.
6. Analyseer de functie en zuiverheid van de geïsoleerde mitochondriën door middel van JC-1 flowcytometrische analyse en Western blot (VDAC1, β-actine en Lamin B)¹³.
   1. Verdeel de geïsoleerde mitochondriën in drie groepen: dimethylsulfoxide (DMSO), JC-1 gekleurd en JC-1 gekleurd met 30 minuten carbonylcyanide 3-chloorfenylhydrazon (CCCP) voorbehandeling.
   2. Na het centrifugeren bij 7.500 × g gooit u het bovenstaande weg en onderbreekt u de buffer.
   3. Leg de fluorescentie-intensiteit vast van de JC-1-monomeren (FITC-kanaal) en aggregaten (PE-kanaal) die zijn opgevangen door flowcytometrie. Evalueer de geïsoleerde mitochondriale membraanpotentialen door de verhoudingen van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van het PE-kanaal tot het FITC-kanaal te meten.
      OPMERKING: Voer de bovenstaande stappen in het donker uit.

3. Ovariële superstimulatie

1. Injecteer 10 maanden oude vrouwelijke C57BL/6-muizen intraperitoneaal met 10 IE drachtige merrieserumgonadotrofine (PMSG) voor superovulatie. Injecteer na 48 uur 10 IE humaan choriongonadotrofine (hCG) intraperitoneaal.
2. Scheur 13 uur na de injectie van hCG de gezwollen eileider met een microscopisch pincet. Maak de cumuluscomplexen los uit de gezwollen eileider. Los de cumuluscellen op in M2-medium met hyaluronidase (0,3 mg/ml) bij 37 °C.
   OPMERKING: De oplostijd is minder dan 5 minuten. Beperk de tijd waarin het cumuluscomplex wordt blootgesteld aan hyaluronidase tot een minimum, aangezien langdurige blootstelling het ontwikkelingspotentieel van de eicel kan aantasten.

4. Mitochondriale overdracht samen met ICSI

1. Doe het sperma zonder staart in de mitochondriale vloeistof. Verkrijg sperma zonder staart door te snijden met behulp van echografie¹⁷. Plaats het sperma zonder staart in de mitochondriale vloeistof, zodat er 100 spermacellen in 50 μL van de mitochondriale vloeistof zitten.
   OPMERKING: Aangezien de mitochondriale suspensie enigszins stroperig is en in vitro niet stabiel is, moet u de injectie binnen 30 minuten voltooien en de micro-injectienaald onmiddellijk vervangen wanneer deze verstopt raakt. De optimale binnendiameter van de micro-injectienaald is 5 μm.
2. Injecteer ~2 pL mitochondriale ademhalingsbuffer of mitochondriale suspensie met sperma in de eicellen met behulp van een micro-injector onder een omgekeerde microscoop (200x; zie materiaaltabel) binnen 30 minuten volgens het protocol van Hiramoto zoals beschreven door Mehlmann en Kline^10,18.
   OPMERKING: De geïnjecteerde mitochondriale suspensie is goed voor 1%-3% van het totale volume eicellen. Controleer het volume (1%-3%) van de mitochondriale suspensie in het cytoplasma om de consistentie van de injectie te garanderen.
3. Plaats na injectie de bevruchte eicellen gedurende 15 minuten in M2-medium voor evenwicht en breng de overlevende bevruchte eieren over naar M16-kweekmedium.
4. Onderzoek de overlevende vruchtbare eieren door de gladde morfologie, pronucleaire vorming en het vrijkomen van het tweede poollichaam te observeren¹⁹. Observeer, fotografeer en tel de embryo's om 09:00 uur en 18:00 uur elke dag gedurende 4 dagen. Verzamel en vries ten slotte de blastocysten in en bewaar ze in een koelkast van -80 °C voor het bepalen van het ATP- en mtDNA-kopienummer om het aantal en de verbetering van mitochondriale transplantatie te evalueren.
   1. Bereid het standaardplasmide (plasmide voor absolute kwantificering, zoals eerder beschreven¹³) voor voor de bepaling van het mitochondriale kopienummer volgens het kopienummer van 1 × 10⁷, 1 × 10⁶, 1 × 10⁵, 1 × 10⁴, 1 × 10³, 1 × 10² en 1 × 10¹. Breng de embryo's over naar de sterilisatiebuis en voeg 20 μL lysaatbuffer toe om het mitochondriaal DNA vrij te maken. Inactiveer vervolgens de protease in het lysaat bij 55 °C gedurende 20 minuten en 95 °C gedurende 10 minuten.
   2. Bepaal het aantal mtDNA-kopieën door middel van fluorescentie kwantitatieve PCR met behulp van de volgende opstelling: 5 μL PCR-mix, 0,5 μL B6 primer-forward, 0,5 μL B6 primer-rev, 2 μL pyrolyseproduct en 2 μL ddH₂O. Volg de PCR-omstandigheden: fase 1, 95 °C gedurende 3 min; fase 2, 95 °C gedurende 30 s, 58 °C gedurende 30 s en 72 °C gedurende 30 s; Herhaal de cyclus 40x.

Resultaten

In dit protocol hebben we ADSC's geïsoleerd en gekarakteriseerd uit muizenvet (Figuur 1). Om geïsoleerde mitochondriën te verkrijgen, moet het celmembraan worden verstoord met behulp van een glashomogenisator. (Figuur 2A). Het is belangrijk om een uniforme mitochondriale fractie te verkrijgen zonder grote klonten, zodat de micro-injectiebuis niet verstopt raakt. Eerst moeten 200 μL en vervolgens 10 μL pipetpunten worden gebruikt...

Discussie

Eicellen bevatten meer mitochondriën dan welk type cel dan ook in het lichaam, met ~1-5 × 10⁵ mtDNA-kopienummers. Mitochondriën zijn essentieel voor de rijping, bevruchting en embryonale ontwikkeling van de eicel, dus elke mitochondriale disfunctie kan leiden tot een verminderde eicelkwaliteit. Verminderde mitochondriale kwantiteit en kwaliteit zijn nauw verwant aan fysiologische veroudering. In dit protocol werd een eenvoudige methode geïntroduceerd voor het isoleren van mito...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.05% trypsin/EDTA	Gibco	25300054	Cell Culture
4% paraformaldehyde	beyotime	P0099	immunofluorescence
40 μm cell strainer	Corning	352340	ADSC isolation
adipogenic induction	Cyagen	HUXXC-90031	Multidirectionele differentiatie
Alizarin red staining solution	Sigma	A5533	Multidirectionele differentiatie
Antibody against CD29	BD Biosciences	558741	flow analysis
Antibody against CD34	BD Biosciences	560942	flow analysis
Antibody against CD90	BD Biosciences	553016	flow analysis
Antibody against HLA-DR	BD Biosciences	555560	flow analysis
β-actin	Abcam	ab-8226	Mitochondriale functietest
BSA	Sigma	V900933	immunofluorescence
CCCP	Solarbio	C6700	mitochondria JC-1 flow analysis
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q711	qPCR
collagenase type I	Sigma	SCR103	ADSC isolation
DAPI	Invitrogen	D1306	immunofluorescence
DMEM-F12	Gibco	11320033	Cell Culture
DMSO	Sigma	276855	mitochondria JC-1 flow analysis
EGTA	Sigma	324626	Mitochondria isolatie
FBS	Gibco	10100147	Cell Culture
Flow cytometry	BD Biosciences	FACSCanto™ II	Kenmerken van ADSC's
fluorescence microscope	leica	DM2500	immunofluorescence
gelatin	Sigma	48722	Multidirectionele differentiatie
glass homogenization tube	Sangon	F519062	Mitochondria isolatie
hCG	Aibei	M2520	Ovariële superstimulatie
hyaluronidase	Sigma	H1115000	Ovariële superstimulatie
Inverted microscope	Olympus	IMT-2	Microinjectie
Isolated Mitochondria Staining Kit	Sigma	CS0760	mitochondria JC-1 flow analysis
JC-1	Sigma	T4069	Mitochondriale functietest
KCl	Sigma	P5405	Mitochondria overdracht
KH2PO4	Sigma	P5655	Mitochondria overdracht
LaminB	Abcam	ab-16048	Mitochondriale functietest
M16 Medium	Sigma	M7292	embryo celcultuur
M2 Medium	Sigma	M7167	embryo celcultuur
mannitol	Sigma	M9546	Mitochondria overdracht
Microinjector	Olympus+ eppendorf	IX73	Mitochondria overdracht
MitoTracker red	Invitrogen	M22425	Mitochondria staining
MOPS	Sigma	M1442	Mitochondria isolatie
neurofilament mediator polypeptide (NFM)	Santa Cruz Biotechnology	sc-16143	Multidirectionele differentiatie
neurogenic induction	Gibco	A1647801	Multidirectionele differentiatie
Neuron-specific enolase (NSE)	Santa Cruz Biotechnology	sc-292097	Multidirectionele differentiatie
Oil Red O	Sangon	E607319	Adipogene differentiatie
oil red O solution	Sigma	O1516	Multidirectionele differentiatie
osteogenic induction	Cyagen	HUXXC-90021	Multidirectionele differentiatie
PBS (phosphate buffered saline)	Hyclone	SH30256.LS	Cell Culture
penicillin and streptomycin	Hyclone	SV30010	Cell Culture
PMSG	Aibei	M2620	Ovariële superstimulatie
protease Inhibitor cocktail	Sigma	P8340	Mitochondria isolatie
sucrose	Sigma	V900116	Mitochondria isolatie
Tris	Sigma	648314	Mitochondria isolatie
Tris-HCl	Sigma	108319	Mitochondria overdracht
Triton X-100	beyotime	P0096	immunofluorescence
VDAC	Abcam	ab-14734	Mitochondriale functietest