Reconstitueren en karakteriseren van Actin-Microtubule Composieten met instelbare motoraangedreven dynamica en mechanica

Samenvatting

Dit artikel presenteert protocollen voor het engineeren en karakteriseren van afstembare driedimensionale composietnetwerken van co-verstrengelde actinefilamenten en microtubuli. Composieten ondergaan actieve herstructurering en ballistische beweging, aangedreven door myosine II- en kinesinemotoren, en worden afgestemd op de relatieve concentraties actine, microtubuli, motoreiwitten en passieve crosslinkers.

Samenvatting

Het samengestelde cytoskelet, bestaande uit interagerende netwerken van semiflexibele actinefilamenten en stijve microtubuli, herstructureert en genereert krachten met behulp van motoreiwitten zoals myosine II en kinesine om belangrijke processen zoals migratie, cytokinese, adhesie en mechanosensing aan te sturen. Hoewel actine-microtubule-interacties de sleutel zijn tot de veelzijdigheid en het aanpassingsvermogen van het cytoskelet, is een begrip van hun interactie met myosine en kinesine-activiteit nog steeds in opkomst. Dit werk beschrijft hoe afstembare driedimensionale composietnetwerken van co-verstrengelde actinefilamenten en microtubuli kunnen worden ontworpen die actieve herstructurering en ballistische beweging ondergaan, aangedreven door myosine II- en kinesinemotoren, en worden afgestemd door de relatieve concentraties van actine, microtubuli, motoreiwitten en passieve crosslinkers. Protocollen voor fluorescentielabeling van de microtubuli en actinefilamenten om composietherstructurering en beweging het meest effectief te visualiseren met behulp van multi-spectrale confocale beeldvorming zijn ook gedetailleerd. Ten slotte worden de resultaten gepresenteerd van data-analysemethoden die kunnen worden gebruikt om niet-evenwichtsstructuur, dynamica en mechanica kwantitatief te karakteriseren. Het opnieuw creëren en onderzoeken van dit instelbare biomimetische platform biedt waardevol inzicht in hoe gekoppelde motorische activiteit, composietmechanica en filamentdynamiek kunnen leiden tot talloze cellulaire processen van mitose tot polarisatie tot mechano-sensatie.

Inleiding

Het cytoskelet is een dynamisch samengesteld netwerk van interagerende biopolymeren dat structurele en mechanische ondersteuning biedt aan cellen. Geassocieerde moleculaire motoren en bindende eiwitten herstructureren en passen het cytoskelet aan om cellen te laten groeien, van vorm te veranderen, te verstijven, te bewegen en zelfs zichzelf te genezen, waardoor talloze cellulaire processen mogelijk worden, variërend van migratie en deling tot mechanosensing ^1,2. Naast zijn betekenis in de cellulaire biofysica, is het cytoskelet ook een typisch voorbeeld van actieve materie met potentiële materiaaltoepassingen, variërend van wondgenezing en medicijnafgifte tot filtratie en zachte robotica 1,3,4,5,6,7,8,9.

De twee belangrijkste kenmerken die het cytoskelet voorzien van zijn unieke structurele en mechanische diversiteit en multifunctionaliteit zijn: 1) het samengestelde karakter, bestaande uit meerdere interagerende eiwitfilamenten, zoals semiflexibele actinefilamenten en stijve microtubuli, evenals hun bijbehorende bindende en verknoopte eiwitten ^3,5,10; en 2) het vermogen om continu te herstructureren, te bewegen, te groven en werk uit te voeren via energieverslindende motoren, zoals myosines en kinesines, duwen en trekken op de filamenteuze eiwitten ^1,7,11,12,13. Hoewel deze elegante complexiteit het cytoskelet in staat stelt om processen te bemiddelen die zo divers zijn als celmotiliteit, cytokinese en wondgenezing 3,6,7,11, belemmert het het vermogen van onderzoekers om de kenmerkende in vivo kenmerken van het cytoskelet te reproduceren in gereconstitueerde in vitro systemen.

De huidige inspanningen op het gebied van grensreconstitutie richten zich op composieten van verstrengelde en verknoopte actinefilamenten en microtubuli ^{3,10,14,15,16,17}, krachtgenererende actomyosinenetwerken ^{2,8,18,19,20,21} en actieve nematica aangedreven door kinesine-microtubule interacties 22,23,24,25,26. Van steady-state actine-microtubule composieten is aangetoond dat ze opkomende mechanische eigenschappen vertonen 15,16,27, zoals verbeterde filamentmobiliteit en verhoogde stijfheid in vergelijking met systemen met één component ²⁷. Studies naar in vitro actomyosinesystemen hebben een breed scala aan structurele en dynamische eigenschappen gemeld die afhankelijk zijn van de concentraties van actine, myosine en crosslinkers 28,29,30,31. Bij voldoende crosslinking ondergaan actomyosinenetwerken bijvoorbeeld grootschalige krimp en verruwing van ^{2,28,30,32,33,34,35,36}, terwijl zonder crosslinkers netwerken een snelle, destabiliserende stroom vertonen en ^19,29 scheuren. . Gereconstitueerde op microtubule gebaseerde actieve nematica die clusters van kinesinemotoren gebruiken om microtubulebundels te crosslinken en aan te trekken, zijn gemeld dat ze langdurige turbulente stromen vertonen, extensie, knikken, breken en genezen 12,22,23,24,25,37,38,39,40,41^, 42,43,44,45,46,47.

Meer recent is aangetoond dat actine-microtubulecomposieten aangedreven door myosine II-minifilamenten leiden tot meer geordende contractie en netwerkintegriteit in vergelijking met de ongeordende stroom en netwerkbreuk die actomyosinenetwerken zonder crosslinkers vertonen 17,26,48. Bovendien wordt de combinatie van composiet robuustheid en krachtgeneratie geoptimaliseerd wanneer actine en microtubuli aanwezig zijn in vergelijkbare concentraties. Belangrijke opkomende kenmerken in dit gebied van formuleringsruimte zijn verbeterde mechanische sterkte²⁶, gecoördineerde beweging van actine en microtubuli²⁶, gestage aanhoudende contractie en mesoschaalherstructurering¹⁷.

Hier worden protocollen beschreven voor het engineeren en afstemmen van co-verstrengelde en verknoopte composieten van microtubuli en actinefilamenten die uit evenwicht worden geduwd door myosine II-minifilamenten en kinesineclusters die respectievelijk op actinefilamenten en microtubuli werken (figuur 1). De dynamiek, structuur en mechanica van deze klasse composieten kunnen worden afgestemd door de relatieve concentraties van de filamenten, motoren en crosslinkers om een rijke faseruimte van advectieve en turbulente stroming, isotrope contractie, versnelling, vertraging, de-mengen, verstijven, ontspanning en scheuren te vertonen. De focus van dit werk ligt op het voorbereiden en afstemmen van deze klasse van actieve cytoskeletale composieten. Om onderzoekers echter te helpen bij het benchmarken en karakteriseren van de beschreven actieve composieten, zijn effectieve beeldvormingsmethoden met behulp van multi-spectrale confocale microscopie ook gedetailleerd. Ten slotte worden resultaten gepresenteerd van belangrijke computationele analysemethoden die kunnen worden gebruikt om de dynamiek, structuur en mechanica van de composieten te meten. Onderzoekers worden aangemoedigd om deze methoden toe te passen - waaronder differentiële dynamische microscopie (DDM), ruimtelijke beeldautocorrelatie (SIA) en deeltjesbeeld velocimetrie (PIV) - omdat ze zijn geoptimaliseerd om de complexe dynamiek en structurele diversiteit van de composieten te karakteriseren 17,26,49.

De hieronder beschreven stappen richten zich op het voorbereiden van de composieten en het afbeelden ervan met behulp van confocale microscopie. Protocollen die post-acquisitie data-analyse en optische pincetmetingen beschrijven, zijn te vinden in eerdere werken 17,26,48,50 en worden op verzoek verstrekt. Alle materialen staan vermeld in de verstrekte materialentabel.

Protocol

1. Bereid gesiliceerde coverslips en microscoopglaasjes voor om adsorptie van eiwitten aan kameroppervlakken te voorkomen

OPMERKING: Dit is een proces van 2 dagen. Gesilaniseerde dia's kunnen tot 1 maand voor gebruik worden bereid.

1. Plaats nr. 1 coverslips (24 mm x 24 mm) en microscoopglaasjes (1 in x 3 in) in een speciaal rek dat in de plasmareiniger past. Plaats het rek in de plasmareiniger en laat het 20 minuten draaien.
2. Breng coverslips en dia's over naar een nieuw rek dat alleen is bestemd voor gebruik met silaan en plaats het rek in een glazen container om de glazen schoon te maken zoals hieronder beschreven.
   1. Dompel coverslips en dia's onder in 100% aceton gedurende 1 uur. Dompel coverslips en dia's onder in 100% ethanol gedurende 10 min.
   2. Dompel coverslips en dia's onder in gedeïoniseerd water (DI) gedurende 5 minuten. Herhaal de reinigingsstappen nog twee keer.
   3. Dompel coverslips en dia's onder in vers bereide 0,1 M KOH gedurende 15 minuten. Dompel coverslips en dia's onder in verse DI gedurende 5 minuten. Herhaal deze stap nog twee keer.
3. Luchtdroge coverslips en dia's gedurende 10 min. Behandel gereinigde coverslips en dia's met silaan om hydrofobe oppervlakken te produceren zoals hieronder beschreven.
   OPMERKING: Voer de volgende stappen uit in een zuurkast.
   1. Dompel gedroogde coverslips en dia's onder in 2% silaan (opgelost in tolueen) gedurende 5 minuten. Gebruik een trechter om silaan terug in de daarvoor bestemde fles te gieten om tot vijf keer te hergebruiken.
   2. Dompel coverslips en dia's onder in 100% ethanol gedurende 5 min. Vervang ethanol door verse ethanol. Dompel coverslips en dia's onder gedurende 5 minuten.
   3. Dompel coverslips en dia's onder in verse DI gedurende 5 minuten. Herhaal de ethanol- en DI-wasstap nog twee keer met telkens verse ethanol en DI. Luchtdroge coverslips en dia's gedurende 10 min.

2. Voorbereiding van actief actine-microtubule composiet aangedreven door myosine mini-filamenten

1. Verwijder inactieve myosine via actinefilamentbinding en voer pull-down uit via ultracentrifugatie zoals hieronder beschreven.
   1. Polymeriseer actine tot filamenten. Gebruik een precisiemicropipette en steriele pipetpunten om te combineren in een microcentrifugebuis: 1,87 μL DI, 1,3 μL 10x G-buffer, 1,3 μL 10x F-buffer, 1,63 μL 4 M KCl, 4,53 μL actine (47,6 μM) en 1,08 μL van 100 μM phalloidine.
      OPMERKING: Om voldoende polymerisatie te garanderen, moeten de actineconcentratie en de molaire verhouding actine:falloidine respectievelijk 18,4 μM en 2:1 zijn.
   2. Pipetteer de oplossing voorzichtig op en neer om te mengen en zet vervolgens ≥1 uur in het donker op ijs. Koel ultracentrifuge tot 4 °C. Verwijder myosine aliquot van -80 °C en zet op ijs.
      OPMERKING: Voltooi stap 2.2 op dit punt terwijl actine polymeriseert.
   3. Voeg na ≥1 uur actinepolymerisatie 1,3 μL 10 mM ATP en 2 μL 19 μM myosine toe aan het gepolymeriseerde actine.
      OPMERKING: De actine:myosine molaire verhouding moet >5 zijn om voldoende verwijdering van inactieve myosinemotoren (d.w.z. dode koppen) te garanderen.
   4. Pipetteer de oplossing voorzichtig op en neer om te mengen. Breng over in een buis van ultracentrifugekwaliteit.
      Centrifugeer bij 4 °C en 121.968 x g gedurende 30 minuten.
2. Bereid een co-verstrengeld composietnetwerk van actinefilamenten en microtubuli zoals hieronder beschreven.
   OPMERKING: Begin 30 minuten voor myosine spin-down (stap 2.1.4).
   1. Stel een warmteblok in op 37 °C. Gebruik een precisiemicropipette en steriele pipetpunten om het volgende aan een microcentrifugebuis toe te voegen: 13,9 μL PEM, 3 μL van 1% Tween20, 1,55 μL van 47,6 μM actine, 0,36 μL van 34,8 μM R-actine, 0,3 μL van 250 mM ATP, 0,87 μL van 100 μM falloidine, 1,91 μL van 5-488-tubuline, 0,3 μL van 100 mM GTP, en 0,75 μL van 200 μM Taxol, tot een totaal volume van 23 μL.
      OPMERKING: De vermelde concentraties actine en tubuline zijn voor een composiet met 2,9 μM actine en 2,9 μM tubuline. De totale eiwitconcentratie is c = c_A + c_T = 5,8 μM en molaire actinefractie is c_A/(c_A + c_T) = Φ_A = 0,5. Zie stap 2.5 om deze waarden aan te passen.
   2. Pipetteer de oplossing voorzichtig op en neer om te mengen en plaats op een warmteblok van 37 °C dat gedurende 1 uur tegen licht is beschermd.
3. Bereid monsterkamers voor op confocale beeldvormingsexperimenten zoals hieronder beschreven.
   OPMERKING: Voer de stappen 2.1.4 en 2.2.2 uit tijdens wachttijden.
   1. Plaats twee gesiliceerde dia's naast elkaar op een hete plaat (uitgeschakeld), leg twee stroken thermoplastische afdichtingsfolie over de dia's ~ 3 mm uit elkaar en plaats twee gesiliceerde coverslips over de thermoplastische afdichtingsfilm om een monsterkamer te vormen.
   2. Zet de hete plaat op lage stand totdat coverslips stevig binden aan dia's met gesmolten thermoplastische afdichtingsfolie (~ 1-2 min). Druk met gelijkmatige druk naar beneden om hechting te garanderen met behoud van ~ 100 μm afstand tussen de twee oppervlakken.
   3. Verwijder de kamers en schakel de hete plaat uit. Label kamers met (+) en (-). De (+) kamer zal voor het actieve monster zijn (met myosine) en de (-) kamer zal de controle zijn (geen myosine). Zorg ervoor dat elke kamer plaats biedt aan ≤ 10 μL vloeistof.
4. Bereid voorbeelden voor op de afbeelding zoals hieronder beschreven.
   OPMERKING: Het is belangrijk om deze stap onmiddellijk na het voltooien van stap 2.1 en 2.2 te voltooien.
   1. Verwijder voorzichtig het myosine-actinemonster uit de ultracentrifuge (stap 2.1.4) en pipetteer onmiddellijk de bovenste 7,5 μL van het supernatant en breng over naar een nieuwe microcentrifugebuis.
   2. Verwijder het actine-microtubulemonster uit het warmteblok en meng voorzichtig 1,5 μL 10x D-glucose, 1,5 μL 10x GOC en 1,5 μL 1 mM blebbistatine. Verdeel de oplossing in twee aliquots van 13,7 μL en label als (+) en (-).
   3. Meng 1,28 μL van het supernatant uit stap 2.4.1 tot (+) aliquot. Meng 1,28 μL DI door het (-) aliquot. Laat elke oplossing langzaam via capillaire werking in de overeenkomstige kamer (stap 2.3) stromen. Pas op dat u geen luchtbellen in het kanaal introduceert.
   4. Sluit de twee open uiteinden van elk kanaal af met sneldrogende epoxy- of UV-lijm. Zorg ervoor dat de lijm volledig droog is voordat u deze op de microscoop legt. Afbeelding onmiddellijk zoals beschreven in stap 3.
      OPMERKING: UV-lijm is voordelig omdat het vrijwel onmiddellijk uithardt bij UV-blootstelling. Omdat blebbistatine echter UV-gevoelig is, is het belangrijk om de lijm (aan de randen van de monsterkamer) alleen lokaal te verlichten met behulp van een kleine UV-toverstaf om te voorkomen dat de blebbistatine wordt gedeactiveerd.
5. Optioneel: varieer de eiwitconcentraties om de dynamiek en structuur van de composieten af te stemmen.
   OPMERKING: De volgende stappen worden voorgestelde wijzigingen in de bovenstaande stappen om de concentraties van actine, microtubuli en myosine indien gewenst te variëren.
   1. Volg de hierboven beschreven stappen, behalve voor de volgende wijzigingen in stap 2.2.1 en 2.4.3.
   2. Om de concentraties van actine en microtubuli te variëren, waardoor c en Φ_A worden aangepast, het volume actine, R-actine en 5-488-tubuline dat in stap 2.2.1 wordt gebruikt, naar wens te verhogen of te verlagen²⁶. Wanneer u de actineconcentratie varieert, past u de molaire concentraties R-actine en falloidine proportioneel aan om dezelfde molaire verhoudingen met actine te behouden. Stel het volume PEM zodanig in dat het uiteindelijke volume van het mengsel 23 μL blijft. Alle andere componentvolumes en concentraties blijven hetzelfde.
   3. Om de myosineconcentratie te variëren, past u het volume myosine dat in stap 2.4.3 aan de (+) aliquot is toegevoegd, naar wens aan. Pas het DI-volume dat aan de (-) aliquot is toegevoegd dienovereenkomstig aan. Pas het PEM-volume in stap 2.2.1 aan om rekening te houden met de toename of afname van het myosinevolume (+) en di (-), zodat het uiteindelijke volume van elk monster ((+) en (-)) 14,98 μL is.

3. Beeldvorming en karakterisering van actieve composieten met behulp van confocale microscopie

1. Om actomyosine-microtubule composieten bereid in stap 2 in beeld te brengen, gebruikt u een laser scanning confocale microscoop (LSCM), of een vergelijkbare microscoop, met een 60x 1.4 NA olie-immersie objectief. Om tegelijkertijd actinefilamenten en microtubuli in afzonderlijke fluorescentiekanalen te visualiseren, gebruikt u een 561 nm-laser met 565/591 nm excitatie- / emissiefilters en een 488 nm-laser met 488/525 nm excitatie- / emissiefilters.
2. Plaats de monsterkamer op de microscoop, zodat het controlekanaal direct boven het objectief wordt geplaatst. Zorg ervoor dat er een olie-interface is tussen het doel en de coverslip.
3. Gebruik de besturingselementen om het besturingscomposiet in beeld te brengen en zoek vervolgens beide oppervlakken van de monsterkamer. Verplaats de z-positie naar het midden van de monsterkamer. Controleer op de aanwezigheid van duidelijke filamenteuze netwerken zoals weergegeven in figuur 2.
4. Nog steeds de controlekamer visualiserend, pas de intensiteit van elke laser aan om gelijktijdige visualisatie van actinefilamenten en microtubuli mogelijk te maken. Handhaaf de laagst mogelijke laserintensiteit om fotobleaching te voorkomen (vaker voorkomend in het actinekanaal) en bloeden door (meestal van de microtubuli in het actinekanaal).
5. Als u het inactieve controlevoorbeeld wilt karakteriseren, verzamelt u drie tijdreeksen (video's) van 256 x 256 vierkante pixels (213 μm x 213 μm) met 2,65 fps voor een totaal van ≥1000 frames. Verzamel elke tijdreeks in een ander gebied van de monsterkamer, gescheiden door ≥ 500 μm. Zorg ervoor dat er minimale detecteerbare beweging is en geen stroom of herstructurering.
6. Sluit de 488 nm laser af en gebruik de podiumbediening om naar de (+) kamer te gaan.
7. Visualiseer met behulp van de 568 nm-laser de microtubuli in het (+) kanaal om de juiste netwerkvorming te garanderen (figuur 2) en identificeer het axiale centrum van de monsterkamer (die kan verschillen van de middelste z-positie van de controlekamer).
8. Schakel de 488 nm laser in en herhaal stap 3.5 hierboven met de volgende wijzigingen. Verzamel tijdreeksen gedurende maximaal 45 minuten en stop de acquisitie wanneer het monster uit het gezichtsveld beweegt, scheurt of fotobleaches vertoont. Neem 5-10 tijdreeksen op en houd de tijd bij waarop elke tijdreeks begint ten opzichte van het begin van de eerste tijdreeks.
9. Analyseer gegevens met behulp van DDM, SIA en PIV zoals beschreven in figuur 3, figuur 4, figuur 5 en eerder 17,48,50,51.
   OPMERKING: De 488 nm-laser activeert lokaal myosine ATPase-activiteit door blebbistatine te deactiveren, dus deze moet alleen worden ingeschakeld aan het begin van de gegevensverzameling, zodat t = 0 aan het begin van de tijdreeks staat. Deze acquisitieparameters zijn geoptimaliseerd voor differentiële dynamische microscopie (DDM) analyse zoals eerder gedaan²⁶.

4. Bereiding van actieve actine-microtubule composieten aangedreven door kinesinemotoren

OPMERKING: De volgende stappen creëren actine-microtubule composieten die uit evenwicht worden gedreven door kinesinemotoren of een combinatie van kinesine en myosine⁵⁰.

1. Bereid kinesine- en myosinemotoren voor zoals hieronder beschreven.
   1. Als u myosine gebruikt, volgt u stap 2.1.
   2. Om kinesinemotorclusters te vormen die binden en krachten uitoefenen tussen paren microtubuli, gebruikt u een micropipette en steriele pipetpunten om het volgende toe te voegen aan een steriele microcentrifugebuis van 1,5 ml:1,16 μL PEM, 2,74 μL 8,87 μM kinesinedimeer, 7,29 μL 83,3 μM NeutrAvidin, 0,81 μL 2mM DTT . Meng voorzichtig door de oplossing op en neer te pipetteren en bescherm beschermd tegen licht (gebruik een zwarte microcentrifugebuis of wikkel in folie) gedurende 30 minuten bij 4 °C.
      OPMERKING: De molaire verhouding van kinesinedimeer tot NA is 1:25.
2. Volg stap 2.3 om monsterkamers voor te bereiden en drie kamers te maken in plaats van twee. Voer deze stap uit tijdens kinesine-incubatie (stap 4.1.2) en myosine-ultracentrifugatie (stap 4.1.1).
3. Bereid een co-verstrengeld composietnetwerk van actinefilamenten en microtubuli voor.
   1. Stel het warmteblok in op 37 °C. Gebruik een micropipette en steriele pipetpunten om het volgende toe te voegen aan een steriele microcentrifugebuis van 1,5 ml: 3,21 μL PEM, 4,5 μL van 1% Tween20, 2,18 μL van 47,6 μM actine, 3,46 μL 5-R-tubuline, 4,5 μL van 100 mM ATP, 4,5 μL van 10 mM GTP, 1,13 μL van 200 μM Taxol en 1,57 μL van 20 μM 488-phalloidine. Zorg ervoor dat het totale volume 25 μL is.
   2. Pipetteer de oplossing voorzichtig op en neer om te mengen en plaats deze op het warmteblok van 37 °C dat gedurende 1 uur tegen licht is beschermd. Verwijder de buis uit het warmteblok en gebruik een micropipette om voorzichtig 0,84 μL van 100 μM falloïdine door elkaar te mengen. Incubeer gedurende 5-10 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.
      OPMERKING: Het toevoegen van falloïdine in deze stap, in plaats van in stap 4.3.1, verbetert de fluorescentie-etikettering van actinefilamenten, omdat 488-falloidine niet hoeft te concurreren met niet-gelabelde falloïdine voor actinebindingsplaatsen.
4. Bereid actieve composieten voor confocale beeldvorming.
   1. Voeg 1,13 μL 200 μM blebbistatine, 1,35 μL 10x Glu en 1,35 μL 10x GOC toe aan de oplossing vanaf stap 4.3.2 en meng voorzichtig door op en neer te pipetteren. Verdeel de oplossing in drie aliquots van 10 μL en label als (K), (K+M) en (-).
   2. Meng 2,54 μL myosine uit stap 2.1.4 met het (K+M) aliquot. Meng er 2,54 μL PEM in (K) en (-) aliquots door.
   3. Gebruik een micropipette en steriele pipetpunten om 2,5 μL kinesineclusters uit stap 4.1.2 toe te voegen aan (K) en (K+M) aliquots. Pipetteer op en neer om te mengen. Meng 2,5 μL PEM tot (-) met dezelfde techniek.
      OPMERKING: De vermelde concentraties actine en tubuline zijn voor een composiet met 2,32 μM actine en 3,48 μM tubuline. De totale eiwitconcentratie is c = c_A + c_T = 5,8 μM en molaire actinefractie is c_A/(c_A + c_T) = Φ_A = 0,4. Kinesine- en myosineconcentraties zijn respectievelijk 0,35 μM en 0,47 μM. Zie stap 2.5 voor algemene richtlijnen voor de aanpassing van c_A, c_T, c en Φ_A.
   4. Gebruik een micropipette om elke oplossing langzaam via capillaire werking in het overeenkomstige kanaal van de bereide monsterkamers (stap 4.2) te laten stromen. Druk heel langzaam en voorzichtig op de pipet om geen luchtbellen in het kanaal te brengen.
   5. Sluit de twee open uiteinden van elk kanaal af met sneldrogende epoxy of UV-uithardende lijm. Zorg ervoor dat de lijm volledig droog is voordat u deze op de microscoop legt.
      OPMERKING: Het is belangrijk dat deze stap snel wordt uitgevoerd om de tijd dat de kinesine werkt te minimaliseren zonder te worden gecontroleerd. Om deze reden wordt epoxy aanbevolen die in 1 min (in plaats van 5 of 10 min) uithardt. UV-uithardende lijm is in dit opzicht voordelig omdat het vrijwel onmiddellijk uithardt bij UV-blootstelling.
5. Afbeelding voorbereide monsters onmiddellijk, na stap 3, met uitzondering van de volgende belangrijke wijzigingen. Omdat kinesine niet wordt gecontroleerd door lichtactivering, begint het onmiddellijk na stap 4.4.3 te werken, dus markeer deze tijd als t = 0. Als u de samengestelde stof zo dicht mogelijk bij de initiële inactieve toestand (t = 0) wilt weergeven, maakt u eerst een afbeelding van de kanalen (K) en (K+M) en noteert u de tijd die is verstreken tussen stap 4.4.3 en het begin van gegevensverzameling (stap 3.8). In de praktijk is deze verstreken tijd ~5 min.

5. Integratie van passieve crosslinkers in actieve composieten

OPMERKING: In deze stappen wordt beschreven hoe u biotinylated actine en tubuline subeenheden en NeutrAvidin (NA) kunt gebruiken om actine passief te koppelen aan actine (A-A) of microtubuli aan microtubuli (M-M) in de actieve composieten beschreven in stap 4.

1. Bereid A-A of M-M crosslinker complexen met gebiotinyleerde eiwitten (biotine-actine of biotine-tubuline), NA en biotine in een verhouding van 2:2:1 biotine-actine/tubuline:biotine:NA. Start dit proces vóór stap 4 .
   1. Gebruik voor A-A-crosslinkers een micropipette en steriele pipetpunten om 2 μL 11,6 μM biotine-actine, 1,39 μL 8,33 μM NA, 2,27 μL 1,02 μM biotine en 4,34 μL PEM toe te voegen aan een microcentrifugebuis. Meng voorzichtig door op en neer te pipetteren.
   2. Gebruik voor M-M crosslinkers een micropipette en steriele pipetpunten om 1,86 μL 4,55 μM biotine-tubuline, 1,11 μL van 8,33 μM NA, 1,82 μL 1,02 μM biotine en 5,21 μL PEM toe te voegen aan een microcentrifugebuis. Meng voorzichtig door op en neer te pipetteren.
   3. Wikkel de buis(en) uit stap 5.1.1 en/of 5.1.2 in thermoplastische afdichtingsfolie om een waterdichte afdichting te creëren. Plaats in een drijfvlot in een temperatuurgeregeld sonicatorbad dat is ingesteld op 4 °C.
   4. Soniceer gedurende 90 min bij 4 °C. In de praktijk is het het beste om de sonicator in een koude kamer te plaatsen en ijspakketten aan het ultrasoonapparaatbad toe te voegen om een lage temperatuur te behouden.
2. Om crosslinkercomplexen op te nemen in monsters voor beeldvorming, volgt u stap 4.3 en wijzigt u stap 4.3.1 zoals hieronder beschreven voor A-A-crosslinking (stap 5.2.1) of M-M-crosslinking (stap 5.2.2).
   1. Combineer voor A-A-crosslinking het volgende in een microcentrifugebuis: 1,94 μL PEM, 4,50 μL van 1% Tween20, 2,18 μL 47,6 μM actine, 3,46 μL van 45,5 μM 5-R-tubuline, 1,13 μL A-A crosslinkers (stap 5.1.1), 4,50 μL van 100 mM ATP, 4,50 μL van 10 mM GTP, 1,13 μL van 200 μM Taxol, en 1,57 μL van 20 μM 488-falloidine. Zorg ervoor dat het totale volume 25 μL is.
   2. Combineer voor M-M crosslinking het volgende in een microcentrifugebuis: 1,97 μL PEM, 4,50 μL van 1% Tween20, 2,18 μL 47,6 μM actine, 3,76 μL van 45,5 μM 5-R-tubuline, 1,13 μL 1:4 verdunning van M-M crosslinkers (stap 5.1.2), 4,50 μL 100 mM ATP, 4,50 μL van 10 mM GTP, 1,13 μL van 200 μM Taxol, en 1,57 μL van 20 μM 488-falloidine. Zorg ervoor dat het totale volume 25 μL is.
3. Volg stap 4.3.2-4.5 met de specifieke concentraties voor een crosslinker:actine molaire verhouding van R_A = 0,02 en crosslinker:tubuline molaire verhouding van R_T = 0,005. Deze R_A - en R_T-waarden resulteren in vergelijkbare lengtes tussen crosslinkers langs actinefilamenten en microtubuli (d_A 60 nm en d_MT 67 nm), geschat met d_A =_I-monomeer/2R_A, waarbij_I-monomeer de lengte is van een actinemonom, en d_MT =_I-ring/26R_T, waarbij_I-ring de lengte is van een ring van 13 tubulinen^{15, 17}.

Resultaten

Om een succesvolle bereiding van actieve composieten te bepalen (figuur 1) en om hun dynamiek en structuur te karakteriseren, wordt een laserscanmicroscoop met ten minste twee fluorescentiekanalen gebruikt om de actinefilamenten en microtubuli tegelijkertijd te visualiseren (figuur 2 en figuur 6). Alle actinefilamenten en microtubuli in de composieten zijn schaars gelabeld, in plaats van doping in tracer heldere filamenten, zoals vaak wordt gedaan in in vitro studies. Deze methode zorgt ervoor dat de gemeten dynamiek en structuur representatief zijn voor het composiet zelf in plaats van de tracers die onder andere omstandigheden worden gevormd dan de composieten. Om deze reden kunnen individuele actinefilamenten en microtubuli doorgaans niet worden opgelost, maar beelden geven de netwerkstructuur van mesoschaal weer (figuur 2 en figuur 6).

Deze labelingbenadering is geoptimaliseerd voor ruimtelijke beeldautocorrelatie (SIA) en differentiële dynamische microscopie (DDM) analyses die de dynamiek en structuur in de wederzijdse Fourierruimte onderzoeken (figuur 4, figuur 5 en figuur 8)52,53,54,55. Deeltjesbeeld velocimetrie (PIV) kan ook worden gebruikt om dynamiek en stromingsvelden weer te geven en te karakteriseren (figuur 3 en figuur 7), maar het vereist pixel-binning (lagere ruimtelijke resolutie) en grotere vertragingstijdstappen (lagere temporele resolutie) dan SIA en DDM om foutieve vectoren te elimineren die voortkomen uit ruis in de dichte beelden met een laag signaal. Niettemin wordt PIV aanbevolen voor kwalitatief onderzoek van stroomvelden en bevestiging van DDM-resultaten (figuur 4 en figuur 8)^26,50.

Voorbeeldkarakterisering van de beschreven netwerken met behulp van deze analyses (d.w.z. DDM, SIA, PIV) wordt verstrekt om onderzoekers te helpen bij het aannemen van vergelijkbare analyses om hun monsters te benchmarken en te karakteriseren. Gedetailleerde beschrijvingen van deze technieken vallen echter buiten het bestek van dit werk. Voor gedetailleerde beschrijvingen van hoe DDM uit te voeren op deze en andere soortgelijke systemen, inclusief gebruiksvriendelijke Python-code, verwijzen we naar eerdere werken 17,26,49,50 en de verwijzingen daarbinnen. Voor details over het uitvoeren van SIA en PIV op de hier beschreven systemen, wordt de lezer verwezen naar eerdere werken ^17,50.

Verschillende controles, zoals hieronder beschreven, moeten worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat de composieten functioneren zoals verwacht. Een composiet zonder myosine of kinesine moet in wezen statisch lijken met minimale thermische fluctuaties of drift. Actinefilamenten en microtubuli moeten verstrengeld en homogeen verdeeld lijken, met minimale bundeling, aggregatie of fasescheiding van actine en microtubuli in een gezichtsveld van ~200 μm x 200 μm (figuur 2, uiterst links)¹⁷. Men zou een vergelijkbaar resultaat moeten verwachten voor composieten die myosine bevatten maar niet worden blootgesteld aan 488 nm licht (om de blebbistatine te deactiveren).

Na opname van myosine en blootstelling aan 488 nm licht ondergaan de composieten een contractie die grotendeels isotroop is en vergelijkbaar is voor actine en microtubuli, zoals te zien is op microscoopbeelden die vóór en na myosineactiviteit zijn gemaakt (figuur 2), evenals overeenkomstige PIV-stroomvelden voor verschillende tijden tijdens activiteit (figuur 3). Om te bepalen of de beweging ballistisch, diffusief, subdiffusief, enz. is, wordt de karakteristieke decorrelatietijd τ(q) bepaald uit DDM geëvalueerd als een functie van de golfvector (d.w.z. de wederkerige ruimte). Zie zoals eerder in detail beschreven 17,26,49. Figuur 4 laat ook zien hoe U DDM kunt gebruiken om deze composieten te karakteriseren. Power-law scaling τ(q)~1/vq^β, met β = 1, geeft ballistische beweging aan met snelheid v. Ter referentie, β = 2 vertegenwoordigt diffusieve dynamica met v als de diffusiecoëfficiënt. Alle actieve composieten vertonen ballistische schaling (figuur 4A) met snelheden die worden afgestemd op de concentraties van actine en myosine (figuur 4B), en die tijdens de activiteit in de tijd kunnen variëren, versnellend of vertragend (figuur 4C, D).

Netwerkherstructurering en clustering, zichtbaar in figuur 2 en duidelijker voor hogere actine- en myosineconcentraties, kunnen worden gekarakteriseerd met behulp van SIA, zoals weergegeven in figuur 5, en eerder beschreven 17,48,50. In het kort kan een correlatielengte ξ, een maat voor de karakteristieke grootte van objecten in een afbeelding, worden bepaald door elke ruimtelijke intensiteit autocorrelatiecurve g(r) toe te passen op een exponentiële functie van afstand r tussen pixels. Grotere g(r)-pieken die langere afstanden aanhouden, duiden op grotere structurele kenmerken (d.w.z. bundeling, clustering van de afzonderlijke filamenten). Zoals te zien is in figuur 5, wordt voor hogere actinefracties en myosineconcentraties een significante herstructurering en aggregatie weerspiegeld in de toename van ξ in de loop van de tijd.

De visco-elastische eigenschappen en niet-lineaire mechanische respons van de actieve composieten kunnen ook worden gemeten met behulp van optische pincetmicrorheologie (OTM). Protocollen en representatieve resultaten voor deze experimenten vallen echter buiten het bestek van dit werk. Geïnteresseerde lezers worden verwezen naar eerdere werken^48,56 die grondig beschrijven hoe OTM-metingen en de verwachte resultaten moeten worden uitgevoerd.

Met behulp van hetzelfde programma van experimentele en analysetools zoals hierboven beschreven, beschrijft de volgende sectie hoe de dynamiek en structuur veranderen wanneer kinesinemotoren en biotine-NA-crosslinkers in de composieten worden opgenomen (figuur 6, figuur 7 en figuur 8). Figuur 6 toont representatieve confocale beelden van composieten aangedreven door kinesine-only (K) of kinesine en myosine (K+M), met en zonder passieve crosslinking (XL) van actinefilamenten of microtubuli.

Het opnemen van kinesine in composieten resulteert in eerste instantie in een vergelijkbare dynamiek en herstructurering als myosine-aangedreven composieten zoals te zien in de bovenste rij van figuur 7 (klasse 1). De dynamiek gaat echter meestal over op grootschalige anisotrope stroming (figuur 7 middelste rij, klasse 2), versnelling en vertraging (figuur 7 onderste rij, klasse 3). Deze kenmerken paren met mesoschaal clustering en aggregatie na 5-30 min (figuur 6 en figuur 8B). Piv-gegenereerde stroomvelden en temporele kleurenkaarten in figuur 7 tonen voorbeelden van isotrope herstructurering (klasse 1, bovenpaneel), gerichte stroom (klasse 2, middelste panelen) en bidirectionele versnelling (klasse 3, onderste panelen).

Snelheden van actine en microtubuli op verschillende tijdstippen tijdens activiteit, bepaald via fits naar τ(q)-curven, illustreren versnelling gevolgd door vertraging (figuur 8), die afhankelijk is van crosslinking. Zoals ook te zien is in figuur 8, wanneer beide motoreiwitten worden opgenomen, is de dynamiek eigenlijk langzamer dan alleen kinesinecomposieten en is er een vertraagd begin van de mesoschaalstroom. Myosine ondersteunt ook een meer homogene vervlechting van actine- en microtubulinetwerken gedurende de hele duur van de activiteit, evenals minder aggregatie en herstructurering. Deze effecten zijn te zien in de afbeeldingen in figuur 6 en worden gekwantificeerd door de tijdsafhankelijke correlatielengtes berekend via SIA, die over het algemeen kleiner zijn in de aanwezigheid van myosine (figuur 8B).

Figuur 1. Ontwerp en karakterisering van actieve actine-microtubule composieten met meerdere krachtgenererende motoren en passieve crosslinkers. (A) Actinemonomeren en tubulinedimmeren worden gecopolymeriseerd bij molaire concentraties c_Aen c_Tvan 0,73-11,6 μM en molaire fracties van actine Φ_A = c_A / (c_A + c_T) = 0, 0,25, 0,5, 0,75 en 1, om co-verstrengelde netwerken van actinefilamenten (groen) en microtubules (rood) te vormen. Passieve crosslinking wordt bereikt met behulp van NA om biotinylated actinefilamenten (Actin XL) of microtubules (MT XL) te koppelen aan crosslinker:eiwitkiesverhoudingen van respectievelijk R_A = 0,01-0,08 en R_MT = 0,001-0,01 voor actine en microtubuli. Myosine-II minifilamenten (paars) en kinesineclusters (oranje), bij concentraties van c_M= 0,12 - 0,48 μM en c_K= 0,2 - 0,7 μM, duwen en trekken op de filamenten om de composieten uit steady-state te drijven. (B) Schematische formuleringsruimte. Myosine II minifilamenten (M), kinesineclusters (K) of beide motoren (K +M) worden verwerkt in composieten zonder passieve crosslinkers (geen XL), actine-actine-crosslinks (Actin XL) en microtubule-microtubule crosslinks (MT XL). Alle cartoons zijn niet op schaal getekend. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. Tweekleurige confocale beeldvorming van myosine-gedreven cytoskeletcomposieten met variërende myosineconcentraties c_M en molaire actinefracties Φ_A. (A) 256 x 128 vierkante pixel (212 x 106 μm²) tweekleurige confocale microscopiebeelden laten zien hoe composieten van actinefilamenten (groen) en microtubuli (rood) worden herschikt via myosinemotorische activiteit. Er zijn geen kinesinemotoren of passieve crosslinkers aanwezig. In elk paneel worden beelden getoond die aan het begin (links, voor) en einde (rechts, na) zijn genomen van de 45 minuten myosineactivering (via verlichting met 488 nm licht om blebbistatine te deactiveren). Panelen worden geordend door de molaire concentratie van myosine (c_M) te verhogen, van links naar rechts te gaan en de molaire fractie van actine (Φ_A) te verhogen, van boven naar beneden. De kleuren die elk paneel schetsen, komen overeen met de kleurcodering die wordt gebruikt in figuur 4 en figuur 5. Schaalstaven zijn 50 μM. Om de dynamiek en structuur voor analyse zo goed mogelijk vast te leggen, gebruiken we framesnelheden van 1-5 fps, ROIs met 50-250 μm-zijden en tijdreeksduur van 5-45 minuten, afhankelijk van de snelheid van contractie en herschikking. Panelen waarin de voor- en nabeelden op elkaar lijken, duiden op een minimale herstructurering, zoals te zien is in de roze, magenta en cyaan panelen. Kleinschalige clustering, wat blijkt uit verhoogde heterogeniteit en de aanwezigheid van heldere punctate kenmerken, is te zien in de oranje, groene en rode panelen. Grootschalige krimp, gezien als een uniform krimpend netwerk, is zichtbaar in de blauwe en paarse panelen. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van referentie¹⁷. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3. Deeltjesbeeld velocimetrie (PIV) laat zien dat actomyosineactiviteit gecoördineerde contractiele dynamiek van actine en microtubuli in co-verstrengelde composieten veroorzaakt. PIV-stroomvelden voor actine (bovenste rij) en microtubuli (onderste rij) in een myosine-aangedreven composiet met (Φ_A, c_M) = (0,5, 0,24) op toenemende tijdstippen gedurende een tijdreeks van 6 minuten. Flow velden werden gegenereerd met behulp van de Fiji / ImageJ PIV plugin met een vertragingstijd van 20 s en 2 pixel x 2 pixel binning. Zowel actine als microtubuli vertonen consistente beweging gericht op het middengebied van het gezichtsveld gedurende de filmduur. Schaalbalken in alle afbeeldingen zijn 50 μm. Verschillende pijlkleuren komen overeen met verschillende snelheden zoals aangegeven in de kleurenschaal rechts van vectorvelden. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van referentie²⁶. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4. Time-resolved differential dynamic microscopy (DDM) meet de snelheid en het type beweging van actine en microtubuli in actieve composieten. (A) DDM wordt uitgevoerd op microtubule (bovenste, open symbolen) en actine (onderste, gevulde symbolen) kanalen van tijdreeksen om karakteristieke vervaltijden τ vs golfnummer q te bepalen voor zowel actine (gevulde symbolen) als microtubuli (open symbolen) zoals eerder beschreven^17,26. Alle curven volgen τ ~ ^q-1 schaling, wat ballistische beweging aangeeft, met snelheden v die worden bepaald via fits naar τ(q) = (vq)^-1. Hogere snelheden komen overeen met kleinere τ(q)-waarden voor een bepaalde q. Symboolkleuren en -vormen komen overeen met (Φ_A, c_M) combinaties weergegeven in B. (B) Contractiesnelheden v worden bepaald via fits naar τ(q) curven weergegeven in A, die gemiddeld zijn over alle vertragingstijden voor de duur van elke tijdreeks van 45 minuten. (C) Time-resolved DDM (trDDM) kwantificeert hoe de dynamiek in de loop van de tijd varieert door τ(q) voor actine (gevulde symbolen, links) en microtubuli (open symbolen, rechts) te evalueren gedurende opeenvolgende intervallen van 6 minuten (aangegeven door verschillende tinten van dezelfde kleur) gedurende de activeringstijd van 45 minuten. trDDM wordt uitgevoerd voor elke (Φ_A, c_M) combinatie (aangeduid met verschillende symbolen en kleuren) zoals beschreven in de legenda rechtsonder. τ(q) curven in C volgen vergelijkbare schaalgroottes en trends als die in A, maar vertonen ook tijdsafhankelijkheid voor bepaalde (Φ_A, c_M) composities, met name voor Φ_A = 0,75. (D) Contractiesnelheden voor actinefilamenten (gesloten symbolen) en microtubuli (open symbolen) worden bepaald aan de hand van de overeenkomstige τ(q)-curven. Foutbalken in alle plots vertegenwoordigen de standaardfout van waarden in drie tot vijf replicaties. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van referentie¹⁷. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5. Spatial image autocorrelation (SIA) analyse kwantificeert de motorisch aangedreven herstructurering van actieve cytoskeletale composieten. (A) Autocorrelatie g(r) voor de microtubuli aan het begin (links, t = 0 min, donkere tinten) en het einde (rechts, t = 42 min, lichte tinten) van het experiment voor (Φ_A, c_M) formuleringen die in de legenda worden vermeld. Inzet: voorbeeld past gegevens toe op de begin- en eindtijd voor (Φ_A, c_M) = (0,75, 0,12). (B) Gemiddelde correlatielengtes ξ voor actine (gesloten symbolen) en microtubuli (open symbolen) voor elk (Φ_A, c_M) bepaald via exponentiële slagen van elke g(r)-curve, zoals weergegeven in de inzet in A. Gegevens zijn onderverdeeld in die welke een minimale (linkse) versus substantiële (rechts) herstructurering vertonen. Foutbalken in A en B vertegenwoordigen de standaardfout in drie tot vijf replicaties. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van referentie¹⁷. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6. Het integreren van kinesinemotoren en passieve crosslinkers in actieve composieten om de programmeerbaarheid te vergroten en de faseruimte van dynamiek en structuur uit te breiden. (A) Tweekleurige confocale beelden van actine (groen) en microtubuli (rood) in actieve composieten tonen complexe formuleringsafhankelijke herstructurering in de loop van de tijd (vermeld in min). De vijf afbeeldingen in elke rij komen overeen met vijf frames van een 2000 frame tijdreeks verkregen voor een composiet aangedreven door kinesine (K, rijen 1, 3, 5) of kinesine en myosine (K + M, rijen 2, 4, 6), en inclusief ofwel geen passieve crosslinkers (geen XL, rijen 1, 2), actine-actine crosslinks (Actin XL, rijen 3, 4), of microtubule-microtubule crosslinks (MT XL, rijen 5, 6). Schaalbalken zijn allemaal 50 μm. Contourkleuren komen overeen met het kleurenschema in figuur 8. (B) Afzonderlijke actine- en microtubulefluorescentiekanalen voor de kinesine-only composieten vertonen gevarieerde structuren met zowel actine-MT co-lokalisatie als microfasescheiding. De getoonde beelden zijn voor composieten met c_A= 2,32 μM, c_T= 3,48 μM, c_K = 0,35 μM, c_M= 0,47 μM (rijen 2, 4, 6), R_A= 0,02 (rijen 3, 4) en R_MT = 0,005 (rijen 5, 6). Alle composieten beginnen met gelijkmatig verdeelde interpenetratienetwerken van actine en microtubuli (kolom 1). Kinesine-aangedreven composieten zonder crosslinkers (rij 1) vormen losjes verbonden amorfe clusters die MT-rijk zijn. Actine co-lokaliseert in eerste instantie in de centra van deze aggregaten, maar wordt vervolgens uit de MT-rijke regio's geperst die blijven samentrekken en van elkaar loskoppelen. Actine-actine crosslinking (rij 3) belemmert deze microschaal actine-MT scheiding, en in plaats daarvan worden MT-rijke aggregaten verbonden via lange strengen actine. Actine crosslinking maakt ook een langzame opname van actine in de MT-rijke regio's mogelijk, zodat de composiet een verbonden netwerk van co-gelokaliseerde actine- en MT-clusters wordt. Microtubule crosslinking (rij 5) leidt tot amorfe clustering van MT's die in de loop van de tijd samensmelten, wat resulteert in grootschalige fasescheiding van actine en MT's. Het toevoegen van myosine (rijen 2, 4, 6) vermindert kinesine-gedreven de-mengen en herstructurering. Zonder crosslinkers (rij 2) vertonen composieten in de loop van uren weinig herschikking. Crosslinking verhoogt de herstructurering en colokalisatie van actine en microtubuli (rijen 4, 6). In het bijzonder, wanneer microtubuli crosslinked zijn (rij 6), is er een aanzienlijke vervlechting en reorganisatie in webachtige netwerken van vezels. Dit cijfer is gewijzigd van referentie⁵⁰. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7. PIV laat zien dat actieve composieten drie klassen van spatiotemporaal verschillende stromingsvelden vertonen. (A) PIV-stroomvelden voor de eerste (t_i) en laatste (t_f) frames van drie representatieve tijdreeksen, die de verschillende dynamische klassen weergeven die samengestelden in figuur 6 vertonen. PIV-stroomvelden voor microtubuli (boven) en actine (onder) voor voorbeeldvideo's van klasse 1 (boven, paars), klasse 2 (midden, oranje) en klasse 3 (onder, magenta), met pijlkleuren die overeenkomen met de universele snelheidsschaal onderaan, en de grijswaardenkleurenkaart met de ruimtelijke snelheidsverdeling, afzonderlijk genormaliseerd voor elk stroomveld volgens de schaal die onderaan wordt weergegeven. Schaalstaven zijn allemaal 50 μM. (B) Hoekverdelingen van snelheidsvectoren van A (in eenheden van radialen) met de vermelde initiële en definitieve standaardafwijkingen σ_i en σ_f. (C) Temporele kleurenkaarten voor de video's die in A en B worden geanalyseerd, tonen de frame-to-frame positie van elke pixel ten opzichte van het startpunt. Klasse 1 kaarten tonen kleinschalige willekeurige beweging; klasse 2 kaarten tonen snelle unidirectionele beweging met minimale ruimtelijke of temporele variatie; klasse 3 kaarten vertonen kenmerken van zowel klasse 1 als 2. Dit cijfer is gewijzigd van referentie⁵⁰. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8. DDM en SIA meten de tijdsafhankelijke dynamiek en structuur van tweemotorige actine-microtubulicomposieten. (A) Snelheden voor composieten beschreven in figuur 6 en figuur 7, gemeten via DDM, tonen versnelling en vertraging van composieten, geprogrammeerd door crosslinking en myosineactiviteit. Snelheden van microtubuli (MT, gesloten cirkels) en actine (A, open cirkels) worden uitgezet als functie van de activiteitstijd in composieten zonder crosslinking (boven, blauw), actine crosslinking (midden, groen), microtubule crosslinking (onder, rood), zonder myosine (K, donkerdere tinten) en met myosine (K +M, lichtere tinten). Voor gevallen van klasse 3, die twee snelheden hebben, wordt de lagere snelheid aangegeven door een ster. Gegevenspunten omsloten door onderbroken zwarte cirkels komen overeen met de maximale snelheid v_maxvoor elke formulering. Foutbalken (de meeste te klein om te zien) zijn de standaardfout over de machtswet past van de overeenkomstige τ(q). (B) Structurele correlatielengtes ξ, bepaald via SIA, versus activiteitstijd, voor dezelfde set tijdreeksen geëvalueerd in A. Elk gegevenspunt is een gemiddelde van de correlatielengten die zijn bepaald voor het eerste en laatste frame van de overeenkomstige tijdreeks. Over het algemeen neemt ξ toe in de tijd voor zowel actine als microtubuli in alle composietsystemen, en composieten die uitsluitend door kinesine worden aangedreven, hebben grotere correlatielengtes dan die waarin myosine ook aanwezig is. Gegevenspunten in A en B die overeenkomen met de drie in figuur 7 geanalyseerde tijdreeksen worden omcirkeld in de overeenkomstige klassekleur (1 = paars, 2 = oranje, 3 = magenta). Dit cijfer is gewijzigd van referentie⁵⁰. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Een belangrijke vooruitgang van het hierboven beschreven gereconstitueerde systeem is de modulariteit en tonijnbaarheid, dus gebruikers worden aangemoedigd om de concentraties van eiwitten, motoren, crosslinkers, enz. aan te passen aan hun gewenste resultaten, of het nu gaat om het emuleren van een bepaald cellulair proces of het engineeren van een materiaal met specifieke functionaliteit of mechanische eigenschappen. Beperkingen op het concentratiebereik van actine en tubuline worden vastgesteld op de ondergrens door de kritische concentratie die nodig is om actine te polymeriseren (~ 0,2 μM)57,58,59 en tubuline (~ 3 - 4 μM)⁶⁰, en op de bovengrens door de overgang naar nematische uitlijning van actinefilamenten (~ 90 μM)^61,62 of microtubuli (~ 35 μM)⁶³ . Actinemonomeren en tubulinedimmeren moeten samen worden gepolymeriseerd tot filamenten, in plaats van samen te worden gemengd na polymerisatie, om ervoor te zorgen dat ze homogeen in elkaar grijpende gepercsoleerde netwerken vormen die elkaar synergetisch ondersteunen. De nieuwe dynamiek die de composieten vertonen, is afhankelijk van deze interactie. Hoewel het over het algemeen belangrijk is om alle stappen te volgen zoals beschreven in het protocol om de getoonde resultaten met succes te reproduceren, zijn sommige stappen veeleisender, terwijl andere de ruimte hebben om aan te passen en aan te passen aan specifieke behoeften en beschikbare middelen.

Een belangrijke stap om reproduceerbare resultaten te garanderen, is bijvoorbeeld het correct voorbereiden en opslaan van de reagentia volgens de richtlijnen in de materiaaltabel. Cytoskeletale eiwitten (actine, tubuline, myosine, kinesine) zijn labiel en moeten worden gealiquoteerd, flash-bevroren met vloeibare stikstof en bewaard bij -80 °C in aliquots voor eenmalig gebruik. Eenmaal verwijderd van -80 °C, moeten aliquots op ijs worden bewaard. Cytoskeletale eiwitten behouden hun functie niet betrouwbaar na extra vries-dooicycli.

Microtubuli zijn gevoeliger voor depolymerisatie en denaturering dan actine. Eenmaal verwijderd vanaf -80 °C, moet tubuline vóór polymerisatie op ijs worden gehouden en binnen 12 uur worden gebruikt. Eenmaal gepolymeriseerd, moeten microtubuli op kamertemperatuur worden gehouden. Het is ook van cruciaal belang om microtubuli te stabiliseren met taxol om depolymerisatie te voorkomen. Falloidine-stabilisatie van actinefilamenten is ook belangrijk om de ATP-consumerende actine-loopband te onderdrukken die concurreert met myosine- en kinesineactiviteit.

Ultracentrifugatie van myosinemotoren is een andere kritieke stap, omdat het inactieve myosine dode hoofden verwijdert. Het niet verwijderen van de enzymatisch inactieve monomeren resulteert in passieve crosslinking van het actinenetwerk en verlies van activiteit. Om de ATPase-activiteit van motoren te verlengen, kan een ATP-regeneratiesysteem zoals creatinefosfaat en creatinefosfokinase⁶⁴ worden opgenomen.

Ten slotte vereist het handhaven van composietactiviteit het remmen van adsorptie van filamenten en motoren aan de wanden van de monsterkamer, wat kan worden bereikt door passivering van de microscoop coverslips en dia's. Motoreiwitten zijn bijzonder gevoelig voor adsorptie, wat ertoe leidt dat het composiet naar het oppervlak van de monsterkamer wordt getrokken, uit het gezichtsveld beweegt, instort naar 2D en niet langer activiteit ondergaat. Het verzanden van de coverslips en dia's is een effectieve manier om de oppervlakken te passiveren en adsorptie te voorkomen (zie stap 1). Een alternatieve passiveringsmethode die effectief wordt gebruikt in in vitro cytoskeletexperimenten is het bedekken van het oppervlak met een lipide bilayer, vergelijkbaar met het celmembraan¹⁸. Deze methode is voordelig als men eiwitten aan de oppervlakte wil binden of andere specifieke eiwit-oppervlakte interacties wil introduceren, omdat de bilayer kan worden gefunctionaliseerd. Voor experimenten met optische pincetten is passivering van de microsferen ook van cruciaal belang en kan worden bereikt door carboxylated microsferen te coaten met BSA of PEG via carbodiimide crosslinkerchemie⁴⁸.

Er zijn een paar aspecten van de gepresenteerde protocollen die onderzoekers kunnen overwegen aan te passen aan hun behoeften. Ten eerste kunnen onderzoekers ervoor kiezen om niet-inheemse biotine-NA-crosslinkers te vervangen door biologische crosslinkers, zoals alfa-actinine of MAP65 die actine en microtubuli kruislinken, respectievelijk 28,65,66. Het gebruik van niet-inheemse crosslinkers in de hier beschreven composieten wordt gemotiveerd door hun verbeterde reproduceerbaarheid, stabiliteit en tonijnbaarheid in vergelijking met inheemse crosslinkers. Vanwege de sterke biotine-NA-binding kunnen crosslinkers worden verondersteld permanent te zijn, in plaats van de meeste inheemse crosslinkers die tijdelijk binden met uiteenlopende omloopsnelheden. De dynamiek van transiënte crosslinking bemoeilijkt het ontleden van de bijdragen van crosslinkers en motoren aan de dynamiek. Bovendien kunnen biotine-NA-linkers veelzijdig worden gebruikt om zowel actine als microtubuli te crosslinken, evenals crosslink-actine naar microtubuli. Op deze manier kan een eenduidige vergelijking tussen crosslinking motieven worden gemaakt, waardoor alle andere variabelen (bijv. crosslinker grootte, binding affiniteit, stoichiometrie, etc.) vast blijven liggen. Ten slotte zijn de reagentia die nodig zijn om biotine-NA-linkers op te nemen op grote schaal commercieel verkrijgbaar, goed gekarakteriseerd en vaak gebruikt in veel biofysische laboratoria. Een van de belangrijkste sterke punten van het hier beschreven in vitro platform is echter de modulariteit, dus onderzoekers zouden in staat moeten zijn om biotine-NA-linkers naadloos te vervangen door native linkers als ze dat willen.

Ten tweede worden in het huidige protocol actinemonomeren en tubulinedimmeren samen in een centrifugebuis gepolymeriseerd tot filamenten voordat ze aan de monsterkamer worden toegevoegd. Het laten stromen van de oplossing van verstrengelde filamenteuze eiwitten in de monsterkamer kan stroomuitlijning veroorzaken, vooral van de microtubuli, waardoor de gewenste isotropie en homogeniteit van de composieten wordt verbroken. Inderdaad, een belangrijke vooruitgang in eerder werk aan steady-state actine-microtubule composieten was het vermogen om actine en microtubuli in situ (in de monsterkamer) te co-polymeriseren om de vorming van isotrope interpettende netwerken van actine en microtubuli te garanderen 15,16,27. Uitbreiding van deze aanpak tot actieve composieten vereist echter dat de motoren aan het monster worden toegevoegd voorafgaand aan actine- en tubulinepolymerisatie en dat het hele monster voorafgaand aan experimenten bij 37 °C samen incubeert. Tests van deze variatie op het protocol hebben geresulteerd in verminderde actinepolymerisatie en geen waarneembare motorische activiteit, waarschijnlijk als gevolg van concurrerende ATPase-activiteit en de langdurige 37 °C incubatie van de motoren. Gelukkig is er geen waarneembare stroomuitlijning van composieten bij het volgen van de huidige protocollen, zoals te zien is in figuur 2, figuur 3 en figuur 6. Niettemin worden onderzoekers aangemoedigd om protocollen te ontwerpen die in situ vorming van actieve composieten mogelijk maken.

Een ander punt van overweging is het fluorescentie-etiketteringsschema, dat inhoudt dat alle actinefilamenten en microtubuli in het netwerk spaarzaam worden geëtiketteerd. Deze labelingbenadering werd geoptimaliseerd om de structuur van het netwerk direct te visualiseren in plaats van structuur en dynamiek af te leiden via tracerfilamenten of microsferen. De afweging is echter dat individuele filamenten niet helder gelabeld en oplosbaar zijn. Een benadering die onderzoekers zouden kunnen volgen om zowel afzonderlijke filamenten op te lossen als de netwerkstructuur te visualiseren, is om te dopen in voorgevormde filamenten gelabeld met een andere fluorofoor, zodat zowel het omliggende netwerk als individuele filamenten tegelijkertijd in beeld kunnen worden gebracht. Bij het gebruik van meer dan twee fluoroforen en excitatie- / emissiekanalen is doorbloeding tussen kanalen echter vaak moeilijk te elimineren, dus voorzichtigheid is geboden bij het kiezen van de fluoroforen, filters en laserintensiteiten.

Een gerelateerde beperking is het onvermogen om de myosine- of kinesinemotoren in de composieten te visualiseren. De fluorescerende actinemonomeren en tubulinedimmeren die worden gebruikt, zijn in de handel verkrijgbaar, terwijl visualisatie van myosine of kinesine in composieten interne etikettering vereist. Onderzoekers worden aangemoedigd om de volgende stap te zetten om motoren te labelen, zoals eerder gedaan^18,67, om motorische activiteit en binding ondubbelzinnig te kunnen koppelen aan de dynamiek en structuren die onze composieten vertonen.

Ten slotte is het belangrijk op te merken dat in het huidige protocol het begin en de duur van kinesineactiviteit niet wordt gecontroleerd. Omdat de myosineactiviteit wordt gecontroleerd met behulp van foto-deactivering van blebbistatine, zoals hierboven beschreven, om vergelijkbare lichtactivering van kinesine in te bouwen, kan men lichtgeactiveerde ATP opnemen.

Om de complexiteit van de hier beschreven ontwerpen op te bouwen, om cellulaire omstandigheden beter na te bootsen en de dynamische-structuur-functie parameterruimte te verbreden, zal toekomstig werk zich richten op het opnemen van intermediaire filamenten, zoals vimentin ^68,69, evenals andere motoren zoals dynein ^13,70. Gelsolin zal ook in verschillende concentraties worden opgenomen om actinelengte¹⁴ te beheersen, evenals tau-eiwit om de stijfheid van microtubuli te beheersen.

Samenvattend beschrijven de gepresenteerde protocollen hoe de dynamiek, structuur en mechanica van cytoskelet-geïnspireerde actieve materiesystemen kunnen worden ontworpen, gecreëerd en gekarakteriseerd, die twee afzonderlijke actieve krachtgenererende componenten bevatten die op verschillende substraten in een enkel systeem werken. Dit instelbare en modulaire platform brengt reconstitutie-inspanningen een belangrijke stap dichter bij het nabootsen van het cellulaire cytoskelet en biedt de unieke mogelijkheid om de eigenschappen ervan in een brede faseruimte te programmeren door de verschillende componenten onafhankelijk op te nemen, te verwijderen en af te stemmen. Bovendien zijn alle componenten van dit veelzijdige systeem in de handel verkrijgbaar (zie materiaaltabel), met uitzondering van de kinesinedimeerpjes die worden gezuiverd in het Ross Lab, zoals eerder beschreven⁵⁰, en op aanvraag beschikbaar zijn. Ten slotte is alle analysecode gratis beschikbaar via GitHub⁴⁹ en is gebaseerd op gratis programmeertalen en software (Python en Fiji). De transparante verspreiding van protocollen om deze systemen te ontwerpen zal dit platform hopelijk toegankelijker maken voor een diverse groep gebruikers met verschillende expertises, achtergronden, institutionele voorkeuren en onderzoeksdoelen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
(-)-Blebbistatin  Afkorting gebruikt in papier: blebbistatin	Sigma Aldrich	B0560	Voorraadconcentratie: 200 μM in DMSO Opslag: gedessiceerde, in DMSO, -20ºC Voorraad en Experimentrecepten: los 1 mg poeder op tot 200 μM in DMSO Opslag, Omgaan, Probleemoplossingsnotities: beperkte houdbaarheid, stopt meestal na 3-4 maanden betrouwbaar met functioneren. koop en bereid elke 3 maanden nieuwe oplossing voor.
1:20 488-tubuline:tubuline mengsel  Afkorting gebruikt in papier: 5-488-tubuline	NA	NA	Voorraadconcentratie: 5 mg/ml in PEM Opslag: single use aliquots, -80ºC, vermijd vries-dooi cycli Voorraad en Experimentrecepten: meng tubuline en 488-tubuline in een 20:1 verhouding, flash freeze met LN2 Opslag, Omgaan, Probleemoplossingsnotities: elke aliquot kan worden gebruikt voor maximaal 12 uur opgeslagen op ijs bij 4ºC, bescherm tegen licht
1:20 R-tubuline:tubuline mengsel  Afkorting gebruikt in papier: 5-R-tubuline	NA	NA	Voorraadconcentratie: 5 mg/ml in PEM Opslag: single use aliquots, -80ºC, vermijd vries-dooi cycli Voorraad en Experimentrecepten: meng tubuline en rhodamine tubuline in een 20:1 verhouding, flash freeze met LN2 Opslag, Omgaan, Probleemoplossingsnotities: elke aliquot kan worden gebruikt voor maximaal 12 uur opgeslagen op ijs bij 4ºC, bescherm tegen licht
actine (biotine): skeletspier  Afkorting gebruikt in papier: biotine-actine	Cytoskeleton	AB07	Voorraadconcentratie: 1 mg/ml in G-buffer Opslag: single use aliquots, -80ºC, vermijd vries-dooi cycli Voorraad en Experimentrecepten: reconstitueer tot 1 mg/ml in G-buffer, flash freeze met LN2 Opslag, Omgaan, Probleemoplossingsnotities: (1) verdun direct voor gebruik tot 0.5 mg/ml in PEM, (2) eenmaal verwijderd uit -80ºC, bewaar  aliquot op ijs bij 4ºC tot 1 week
actine (rhodamine): konijnskeletspier  Afkorting gebruikt in papier: R-actine	Cytoskeleton	AR05	Voorraadconcentratie: 1.5 mg/ml in G-buffer Opslag: single use aliquots, -80ºC, vermijd vries-dooi cycli Voorraad en Experimentrecepten: reconstitueer tot 1.5 mg/ml in G-buffer, flash freeze met LN2 Opslag, Omgaan, Probleemoplossingsnotities: eenmaal verwijderd uit -80ºC, bewaar  aliquot op ijs bij 4ºC, kan worden gebruikt voor maximaal 1 week
adenosinetrifosfaat  Afkorting gebruikt in papier: ATP	Thermo Fisher Scientific	A1048	Voorraadconcentratie: 100 mM Opslag: in oplossing (pH 7), -20ºC Voorraad en Experimentrecepten: reconstrueer in DI H20, breng pH naar 7 met NaOH Opslag, Omgaan, Probleemoplossingsnotities: controleer regelmatig pH en pas indien nodig aan, hydrolyseert na verloop van tijd, vervang elke ~6-12 maanden
AlexaFluor488 Phalloidin  Afkorting gebruikt in papier: 488-phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379	Voorraadconcentratie: 100 μM DMSO Opslag: beschermd tegen licht, gedessiceerde, -20ºC Voorraad en Experimentrecepten: reconstitueer tot 100 μM met DMSO Opslag, Omgaan, Probleemoplossingsnotities: direct voor gebruik verdun tot 20 μM in PEM (1 μL in 4 μL PEM)
AlexaFluor488–gelabelde actine  Afkorting gebruikt in papier: 488-actine	Thermo Fisher Scientific	A12373	Voorraadconcentratie: 1.5 mg/ml in G-buffer Opslag: single use aliquots, -80ºC, vermijd vries-dooi cycli Voorraad en Experimentrecepten: reconstitueer tot 1.5 mg/ml in G-buffer, flash freeze met LN2 Opslag, Omgaan, Probleemoplossingsnotities: dit item is stopgezet
Basic Plasma Cleaner  Afkorting gebruikt in papier: plasmareiniger	Harrick Plasma	PDC-32G
Bemis Parafilm M Laboratoriumwikkelfolie  Afkorting gebruikt in papier: transparante film	Thermo Fisher Scientific	13-374-5
D-(+)-Glucose  Afkorting gebruikt in papier:	Thermo Fisher Scientific	A16