Celvrije eiwitsynthese uit exonuclease-deficiënte cellulaire extracten met behulp van lineaire DNA-sjablonen

Samenvatting

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de bereiding en bufferkalibratie van celextracten uit exonuclease V knock-out stammen van Escherichia coli BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD en ΔrecB). Dit is een snelle, eenvoudige en directe benadering voor expressie in celvrije eiwitsynthesesystemen met behulp van lineaire DNA-sjablonen.

Samenvatting

Celvrije eiwitsynthese (CFPS) is onlangs erg populair geworden op het gebied van synthetische biologie vanwege de vele voordelen. Het gebruik van lineaire DNA-sjablonen voor CFPS zal de technologie verder in staat stellen zijn volledige potentieel te bereiken, waardoor de experimentele tijd wordt verkort door de stappen van klonen, transformatie en plasmide-extractie te elimineren. Lineair DNA kan snel en gemakkelijk worden versterkt door PCR om hoge concentraties van de sjabloon te verkrijgen, waardoor potentiële in vivo expressietoxiciteit wordt vermeden. Lineaire DNA-sjablonen worden echter snel afgebroken door exonucleasen die van nature aanwezig zijn in de celextracten. Er zijn verschillende strategieën voorgesteld om dit probleem aan te pakken, zoals het toevoegen van nucleaseremmers of chemische modificatie van lineaire DNA-uiteinden voor bescherming. Al deze strategieën kosten extra tijd en middelen en moeten nog bijna-plasmide niveaus van eiwitexpressie verkrijgen. Een gedetailleerd protocol voor een alternatieve strategie wordt hier gepresenteerd voor het gebruik van lineaire DNA-sjablonen voor CFPS. Door celextracten uit exonuclease-deficiënte knock-outcellen te gebruiken, blijven lineaire DNA-sjablonen intact zonder dat er eindaanpassingen nodig zijn. We presenteren de bereidingsstappen van cellysaat uit Escherichia coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD-stam door ultrasoonapparaatlyse en bufferkalibratie voor Mg-glutamaat (Mg-glu) en K-glutamaat (K-glu) specifiek voor lineair DNA. Deze methode is in staat om eiwitexpressieniveaus te bereiken die vergelijkbaar zijn met die van plasmide-DNA in E. coli CFPS.

Inleiding

Celvrije eiwitsynthese (CFPS) -systemen worden steeds vaker gebruikt als een snelle, eenvoudige en efficiënte methode voor biosensortechnologie, gedecentraliseerde productie en prototyping van genetische circuits¹. Vanwege hun grote potentieel worden CFPS-systemen regelmatig gebruikt op het gebied van synthetische biologie. Tot nu toe vertrouwen CFPS-systemen echter op circulaire plasmiden die kunnen voorkomen dat de technologie zijn volledige potentieel bereikt. Het voorbereiden van plasmide-DNA is afhankelijk van vele tijdrovende stappen tijdens het klonen en grote hoeveelheden DNA-isolatie. Aan de andere kant kan PCR-amplificatie van een pla....

Protocol

1. Media- en buffervoorbereiding

1. Bereiding van 2xYT+P medium (vast en vloeibaar)
   1. Bereid vloeibare en vaste media zoals beschreven in tabel 1 en steriliseer vervolgens door autoclaveren.
      OPMERKING: Dit protocol vereist één 2xYT + P agar-plaat met chlooramfenicol (10 μg / ml). Het volume van vloeibare media is evenredig met het volume van het vereiste lysaat. Hier wordt een startvolume van 5 L vloeibare 2xYT+P media gebruikt. Het volume kan echter naar behoefte worden aangepast, wetende dat 1 L van de celcultuur resulteert in 2 tot 3 ml van het uiteindelijke cellysaat.
2. Bereiding van chlooramfeni....

Resultaten

Representatieve resultaten worden hier getoond na kalibratie van het lysaat voor optimale Mg-glutamaat- en K-glutamaatspiegels afzonderlijk voor lineair en plasmide-DNA (figuur 1). De mg-glutamaat optimale concentratie is vergelijkbaar voor ΔrecB en ΔrecBCD extracten bij 8 mM (figuur 1B). De optimale K-glutamaatconcentratie voor plasmide-DNA is echter 140 mM, terwijl de optimale K-glutamaatconcentratie voor lineair DNA voor hetzelfde extract 20.......

Discussie

Hier laten we zien dat cellysaat bereid uit E. coli BL21 Rosetta2 met een genomische knock-out voor recB - of recBCD-operon een hoge eiwitexpressie ondersteunt van lineaire DNA-sjablonen. Dit protocol werkt een stapsgewijze lysaatkalibratieprocedure uit die specifiek is voor lineaire DNA-sjablonen (figuur 2), wat een kritieke stap is die leidt tot de hoge expressie van σ70-promotors in lineair DNA, die bijna-plasmideniveaus bereiken voor equimolaire DNA-concentrati.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
2-YT Broth	Invitrogen	22712020
1.5 mL Safe-Lock tubes	Eppendorf	30120086	1.5 mL microtube
384-well square-bottom microplate	Thermo Scientific Nunc	142761
3PGA (D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium)	Sigma-Aldrich	P8877
adhesive plate seal	Thermo Scientific Nunc	232701
Agar	Invitrogen	30391023
ATP (Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate)	Sigma-Aldrich	A8937
BL21 Rosetta2	Merck Millipore	71402
BL21 Rosetta2 ΔrecB	Addgene	176582
BL21 Rosetta2 ΔrecBCD	Addgene	176583
cAMP (Adenosine 3' 5'-cyclic monophosphate)	Sigma-Aldrich	A9501
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378
CoA (Coenzyme A hydrate)	Sigma-Aldrich	C4282
Corning 15 mL PP Centrifuge Tubes, Rack Packed with CentriStar Cap, Sterile	Corning	430790	15 mL tube
Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes, Conical Bottom with CentriStar Cap, Sterile	Corning	430828	50 mL tube
CTP (Cytidine 5'-triphosphate, disodium salt hydrate)	Alfa Aesar	J62238
DpnI	NEB	R0176S
DTT (DL-Dithiothreitol)	Sigma-Aldrich	D0632
Folinic acid (solid folinic acid calcium salt)	Sigma-Aldrich	F7878
GTP (Guanosine 5?-Triphosphate,  Disodium Salt)	Sigma-Aldrich	371701
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
K phosphate dibasic (K2HPO4)	Carl Roth	231-834-5
K phosphate monobasic (H2KO4P)	Sigma-Aldrich	P5655
K-glutamate	Alfa Aesar	A17232
Mg-glutamate	Sigma-Aldrich	49605
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone	Merck Millipore	SLGP033RB	membrane filter 0.22 µm
Monarch PCR & DNA Cleanup Kit	NEB	T1030S	PCR & DNA cleanup Kit
Monarch Plasmid Miniprep Kit	NEB	T1010S	Plasmid Miniprep Kit
NAD (B-nicotinamide adenine dinucleotide hydrate)	Sigma-Aldrich	N6522
NIST-traceable FITC standard	Invitrogen	F36915	NIST-FITC
NucleoBond Xtra Maxi kit	Macherey-Nagel	740414.1	Plasmid Maxiprep Kit
PEG 8000	Sigma-Aldrich	89510
plate reader	Biotek	Synergy HTX
Purified Recombinant EGFP Protein	Chromotek	egfp-250	recombinant eGFP
Q5 High-Fidelity 2X Master Mix	NEB	M0492S	DNA polymerase
Q5 High-Fidelity 2X Master Mix	New England Biolabs	M0492L	DNA polymerase
Qubit dsDNA BR Assay Kit	Thermo	Q32850	fluorometric assay with DNA-binding dye
RTS Amino Acid Sampler	biotechrabbit	BR1401801
Spermidine	Sigma-Aldrich	85558
Sterile water			Gezuiverd water van het Millipore RiOs 8-systeem, gesteriliseerd door autoclaving.
Tris base	Life Science products Cytiva	17-1321-01
tRNA	Roche	10109550001
Ultrasonic processor Vibra cell VC-505	SONICS	VC505	sonicator
UTP Na3 (Uridine 5'- triphosphate, trisodium salt hydrate)	Acros Organics	226310010
Water, nuclease-free	Thermo	R0581	nuclease-free water