Methodenartikel

Intravitale microscopie om bloedplaatjes-leukocyten-endotheliale interacties in de lever van muizen te bestuderen

930 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64239

⸱

6 oktober 2022

 ,  , 
1Center for Translational Research on Inflammatory Diseases, Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center, 2Department of Medicine, Baylor College of Medicine, 3Department of Pediatrics, Baylor College of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Intravitale microscopie is een krachtig hulpmiddel dat inzicht geeft in zowel de temporele als ruimtelijke relaties van snelle en/of sequentiële processen. Hierin beschrijven we een protocol om zowel eiwit-eiwitinteracties als bloedplaatjes-neutrofielen-endotheliale interacties in leversinusoïden te beoordelen in een muizenmodel van experimentele sepsis (endotoxemie).

Samenvatting

Ontsteking en trombose zijn complexe processen die vooral in de microcirculatie plaatsvinden. Hoewel standaard histologie inzicht kan geven in de eindroute voor zowel ontsteking als trombose, is het niet in staat om de temporele veranderingen aan te tonen die optreden gedurende het tijdsverloop van deze processen. Intravitale microscopie (IVM) is het gebruik van beeldvorming van levende dieren om tijdelijk inzicht te krijgen in fysiologische processen in vivo. Deze methode is bijzonder krachtig bij het beoordelen van cellulaire en eiwitinteracties in de bloedsomloop vanwege de snelle en opeenvolgende gebeurtenissen die vaak nodig zijn om deze interacties te laten plaatsvinden. Hoewel IVM een uiterst krachtige beeldvormingsmethodologie is die in staat is om complexe processen in vivo te bekijken, zijn er een aantal methodologische factoren waarmee rekening moet worden gehouden bij het plannen van een IVM-onderzoek. Dit artikel schetst het proces van het uitvoeren van intravitale beeldvorming van de lever, waarbij belangrijke overwegingen en mogelijke valkuilen worden geïdentificeerd die zich kunnen voordoen. Dit artikel beschrijft dus het gebruik van IVM om bloedplaatjes-leukocyten-endotheliale interacties in leversinusoïden te bestuderen om de relatieve bijdragen van elk in verschillende modellen van acute leverbeschadiging te bestuderen.

Inleiding

Ontsteking en trombose zijn complexe processen die vooral in de microcirculatie plaatsvinden. Dit protocol schetst de chirurgische voorbereiding die beeldvorming van de microvasculatuur van de lever in vivo mogelijk maakt. Hoewel standaard histologie inzicht kan geven in de eindroutes voor zowel ontsteking als trombose, kan het de temporele veranderingen die tijdens het proces optreden niet laten zien. Bovendien is deze methode bijzonder krachtig bij het beoordelen van de voorbijgaande cellulaire en eiwitinteracties die plaatsvinden in de microvasculaire circulatie vanwege het vermogen om via videomicroscopie de vaak snelle en sequentiële interacties vast te leggen die plaatsvinden binnen biologische systemen. Dit artikel beschrijft het gebruik van intravitale microscopie om bloedplaatjes-leukocyten-endotheliale interacties in leversinusoïden te bestuderen om de relatieve bijdrage van elk in verschillende modellen van acute leverbeschadiging te bestuderen.

Hoewel deze chirurgische voorbereiding en beeldvormingsmodaliteit het potentieel hebben om te worden aangepast aan een groot aantal inflammatoire en pathologische modellen, worden hier twee modellen van vasculaire ontsteking geschetst: een endotoxemiemodel van muizensepsis en door paracetamol (APAP) geïnduceerde leverbeschadiging. De injectie van endotoxine (lipopolysaccharide; LPS) om een experimenteel model van muizensepsis te induceren, begon al in de jaren 1930 met de isolatie en daaropvolgende exploratie als een sleutelmolecuul in de progressie van sepsis1. Hoewel dit model beperkt is in die zin dat LPS slechts een enkel bestanddeel is van Gram-negatieve bacteriën, is dit een algemeen aanvaarde en gebruikte methode die relatief eenvoudig en snel uit te voeren is. Bovendien repliceert het snel en nauwkeurig de fysiologische manifestaties van sepsis1. Gezien de rol die de intestinale absorptie van endotoxinen speelt bij de ontwikkeling van leverziekte en ontsteking2, is dit een uitstekend model voor het bestuderen van bloedplaatjes-leukocyten-endotheelinteracties in de lever van muizen.

Naast een LPS-model van sepsis biedt APAP-overdosering een uitstekend model voor de studie van pathologische cel-celinteracties in de lever. Een overdosis APAP kan leiden tot acuut leverfalen, gekenmerkt door trombocytopenie en accumulatie van bloedplaatjes in de lever, waardoor leukocytengemedieerd leverherstel wordt geblokkeerd3. Hoewel de chirurgische voorbereiding en beeldvormingsmethodologie voor dit model kunnen worden aangepast voor een aantal biologische vragen en om verschillende pathologische processen te bestuderen, zijn zowel het LPS-model van sepsis als APAP-geïnduceerde leverbeschadiging uitstekende modellen voor de studie van bloedplaatjes-leukocyten-endotheliale interacties in vivo.

IVM heeft enkele inherente voordelen ten opzichte van standaard histologische technieken. Hoewel standaard histologische methoden de studie van hele of doorsneden weefselmonsters en de waardering van eiwitten en weefselarchitectuur mogelijk maken, hebben deze methodologieën beperkingen. Door het ontwerp vereisen deze processen weefselverwerking, die het potentieel heeft om te vervormen of te maskeren wat in het levende systeem wordt aangetroffen. Weefsel moet tijdens de histologische preparatie worden gefixeerd, waardoor de kans op fixatieartefacten of verbeterde autofluorescentie ontstaat. Fixatie kan ook leiden tot intracellulaire veranderingen in weefsel, en de mogelijkheid van onjuiste fixatie kan leiden tot weefseldegradatie. Bovendien missen histologische methoden het potentieel om de temporele aspecten van eiwit- of cellulaire interacties direct te bestuderen en hebben ze het potentieel om kortstondige of onregelmatige interacties te missen.

Omgekeerd stelt intravitale fluorescentiemicroscopie het mogelijk om veel van de complicaties en beperkingen die inherent zijn aan standaard histologie te vermijden. IVM vermijdt fixatie en daardoor de artefacten of weefseldegradatie die kunnen optreden tijdens de histologische preparatie. Door het ontwerp maakt het ook de beeldvorming van weefsels binnen het levende biologische systeem mogelijk, en als zodanig zijn weefselisolatie en -sectie niet vereist. Bovendien maakt het de beeldvorming en studie mogelijk van voorbijgaande of zeldzame processen, die moeilijk of onmogelijk vast te leggen zijn met behulp van histologie. Deze IVM-methode kan ook worden gebruikt om sequentiële processen vast te leggen en te identificeren (bijv. door bloedplaatjes of leukocyten geïnitieerde interacties die resulteren in bloedplaatjes-leukocytenaggregaten gebonden aan vasculair endotheel). Ten slotte kan deze methode worden aangepast aan een groot aantal beeldvormingssystemen. Afhankelijk van de behoeften van het onderzoek en de gewenste dataset, kan de geëxternaliseerde lever na chirurgische voorbereiding op bijna elk gewenst beeldvormingssysteem worden geplaatst. We hebben dit protocol met succes toegepast op beeldvorming met behulp van breedveldfluorescentiemicroscopie, spinningschijfmicroscopie, confocale laserscanmicroscopie met behulp van een resonantiekopscanner en tweefotonmicroscopie. Er is echter geen reden om aan te nemen dat deze methode beperkt zou moeten blijven tot de eerder genoemde microscopiesystemen.

Dit document over methoden schetst een protocol voor IVM, dat eerder werd gebruikt om bloedplaatjes-leukocyten-endotheliale interacties in de lever van muizen te bestuderen. Dit protocol is gebruikt om temporale bloedplaatjes-endotheliale adhesie van bloedplaatjes te vergelijken, ofwel gelabeld met fluorescerend geconjugeerde antilichamen of genetisch gemodificeerd voor endogene fluorescentie4. Dit protocol is gebruikt om voorbijgaande bloedplaatjes-leukocyten-endotheliale interacties in de sinusoïden van de lever te evalueren in een endotoxemisch model van leverontsteking en om P-selectine en recombinant eiwit te co-lokaliseren. Bovendien maakte dit protocol het mogelijk om te bepalen of de verschillen in neutrofielendichtheid met behulp van standaardhistologie het gevolg waren van verschillen in snelheden van rode bloedcellen (als surrogaat voor volumetrische stroomsnelheid)5. Ten slotte is deze methode gebruikt om de rekrutering van bloedplaatjes door Kupffer-cellen in de sinusoïden van de lever te evalueren in een acuut model van door APAP geïnduceerde leverbeschadiging6. Dit oeuvre zou niet mogelijk zijn geweest met behulp van standaard histologische methoden. Zoals gezegd kan dit protocol worden aangepast voor een verscheidenheid aan beeldvormingssystemen, en met de juiste chirurgische voorbereiding, keuze voor fluorescerende antilichamen en beeldvormingsinstellingen is dit protocol zeer betrouwbaar en reproduceerbaar voor de studie van leverpathologie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierprotocollen werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van het Baylor College of Medicine en het Research & Development Committee van het Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center. Alle experimenten zijn terminaal, waarbij euthanasie aan het einde wordt uitgevoerd onder een chirurgisch vlak van anesthesie. Zie de Materiaaltabel voor details met betrekking tot alle materialen, reagentia en apparatuur die in dit protocol worden gebruikt.

1. Bereiding van antilichamen en kleurstoffen

  1. Selectie van antilichamen en kleurstoffen
    OPMERKING: Het aantal gelijktijdige kleuren dat wordt waargenomen, is afhankelijk van de specifieke microscoopopstelling. In het systeem dat hier wordt gebruikt, kunnen vier verschillende golflengten tegelijkertijd worden gevisualiseerd.
    1. Visualiseren van vaten:
      1. Label op basis van het experimentele ontwerp het vaatstelsel met een endotheelspecifiek (bijv. CD31) antilichaam en/of een molecuul dat gelijkmatig in het plasma is verdeeld (bijv. dextran of albumine).
        OPMERKING: Dit artikel beschrijft het gebruik van Texas Red-labeled dextran (150 kDa; 250 μg/muis). Het voordeel van dit eiwit met een groot molecuulgewicht is het vermogen om tijdens acute ontsteking in het vaatstelsel te blijven. Voorzichtigheid is geboden bij het gebruik van antilichaametikettering om antilichamen te vermijden die de endotheelfunctie kunnen verstoren.
    2. Visualisatie van bloedplaatjes:
      1. Om bloedplaatjes te identificeren, gebruikt u genetisch gemodificeerde muizen (bijv. R26R-EYFPf/f/PF4-Cre) of bloedplaatjesspecifieke (bijv. anti-GPIbβ) antilichamen voor IVM. Voor diepgaande informatie over het gebruik van fluorescerende etikettering van bloedplaatjes, zie een eerdere publicatie4.
        OPMERKING: Hier worden DyLight488-gelabelde anti-GPIbβ-antilichamen (X488; 6 μg/muis) gebruikt. Voorzichtigheid is geboden bij het gebruik van antilichaametikettering om interferentie met de bloedplaatjesfunctie of hechting te voorkomen.
    3. Leukocyten visualiseren:
      1. Net als bij het afbeelden van bloedplaatjes, visualiseer de leukocyten die van belang zijn met genetisch gemodificeerde muizen (bijv. LysM-EGFP voor granulocyten) of leukocytspecifieke antilichamen (bijv. Ly6G voor muizenneutrofielen). Om dit protocol te volgen, gebruikt u Brilliant Violet 421 (BV421)-gelabelde anti-Ly6G-antilichamen (3 μg/muis). Label in acute experimenten (<6 uur) neutrofielen met 3 μg anti-Ly6G (kloon 1A8) per dier.
        OPMERKING: Bij gebruik van anti-Ly6G-antilichaam (kloon 1A8) moet worden opgemerkt dat dit antilichaam is gebruikt om neutrofielen (0,05-1 mg antilichaam/muis)7-9 na ten minste 24 uur en/of met herhaalde injecties uit te putten. Van anti-Ly6G (1A8)-antilichamen is ook gemeld dat ze de adhesie en transmigratie van neutrofielen beïnvloeden bij hoge (maar niet lage) schuifspanning in bepaalde, maar niet alle situaties 9,10. Daarom moet de dosering van antilichamen voor elk geval zorgvuldig worden gekozen.
    4. Extra eiwitten:
      1. Afhankelijk van het aantal lasers en filtersets/detectoren dat beschikbaar is op een bepaald beeldvormingssysteem, voegt u meer golflengten toe om meer objecten tegelijk te identificeren, terwijl u ervoor zorgt dat spectrale overlapping wordt vermeden.
        OPMERKING: Dit protocol beschrijft de beeldvorming van een 4e object, P-selectine (kloon Psel.KO2.3), met behulp van een PerCP-eFluor 710-gelabeld anti-P-selectine-antilichaam (4 μg/muis). Hoewel de meeste beschrijvingen en afbeeldingen in dit artikel betrekking hebben op LPS-geïnduceerde acute leverbeschadiging, kunnen andere letselmodellen interessant zijn en kunnen ze alternatieve labels vereisen. Zie de discussie voor een beschrijving van antilichamen die worden gebruikt voor door APAP geïnduceerd letsel6.
  2. Verwijdering van conserveringsmiddelen en sterilisatie
    OPMERKING: Hoewel er in de handel verkrijgbare antilichamen en kleurstoffen klaar zijn voor injectie bij dieren, zullen de meeste van hen dragers of conserveermiddelen (bijv. natriumazide) bevatten die schadelijk kunnen zijn voor dieren of verstorende variabelen kunnen toevoegen. Antilichamen en kleurstoffen die dragers of conserveermiddelen bevatten, moeten worden gedialyseerd tegen de met fosfaat gebufferde zoutoplossing van Dulbecco zonder calcium of magnesium (DPBS-/-; of andere fysiologische buffers).
    1. Giet 500 ml DPBS-/- (~1.000-voudig volume van het te dialyseren antilichaam/kleurstof) in een bekerglas met een magnetische roerstaaf. Bevestig een cassette van 7.000 MWCO aan een drijfboei en plaats deze minimaal 5 minuten in de dialysebuffer om het membraan voor te conditioneren. Verwijder de cassette en dep de plastic randen droog met pluisvrije tissues. Raak het dialysemembraan niet aan.
    2. Injecteer het antilichaam/de kleurstof in de cassette via een van de vier poorten met behulp van een naald van 18-20 G. Plaats de cassette met het antilichaam/de kleurstof in de dialysebuffer. Plaats het bekerglas op een magnetische roerder en dialyseer gedurende ten minste 1 uur bij 4 °C. Verander de dialysebuffer.
    3. Herhaal de dialyse en het wisselen van de dialysebuffer in stap 1.2.2 nog minimaal twee keer (minimaal drie keer omwisselen).
    4. Verwijder de cassette en dep de plastic randen droog met pluisvrije tissues. Raak het dialysemembraan niet aan. Zuig het antilichaam/de kleurstof uit de cassette via een ongebruikte poort met behulp van een naald van 18-20 G.
    5. Steriliseer de preparaten in een weefselkweekkap met behulp van een filter van 0,2 μm voordat u ze bij dieren gebruikt. Bewaar ongebruikte porties in steriele buisjes bij 4 °C.
  3. Besturingselementen
    1. Hoewel de exacte controles die nodig zijn voor elk experiment zullen variëren, afhankelijk van het ontwerp van het onderzoek, moet u ervoor zorgen dat de juiste schijncohorten, met en niet met voertuigen behandelde groepen worden opgenomen, evenals isotypecontroles om niet-specifieke etikettering en biologische effecten uit te sluiten bij het analyseren van de onderzoeksresultaten.

2. Intraperitoneale endotoxine-injectie

OPMERKING: Om bloedplaatjes-neutrofielen-endotheliale interacties in de sinusoïden van de lever te evalueren in een experimenteel model van muizensepsis, kan endotoxine-injectie worden gebruikt.

  1. Weeg de muizen om de hoeveelheid endotoxine te bepalen die moet worden geïnjecteerd (5 mg/kg; Escherichia coli serotype O111:B4; endotoxinegehalte 1 x 106 EU/mg).
    OPMERKING: De werkzaamheid en het effect van endotoxinen zijn soort- en stamafhankelijk en kunnen variëren van partij tot partij11. Om de consistentie van de resultaten te maximaliseren, moeten daarom experimenten worden uitgevoerd met dezelfde partij endotoxine12.
  2. Zuig endotoxine verdund met een normale zoutoplossing (0,9% natriumchloride) op in een spuit met een naald van 27 G eraan. Houd in de niet-dominante hand de muis bij het nekvel vast met duim en wijsvinger. Gebruik de andere hand om tractie op de staart uit te oefenen om de buik bloot te leggen en plaats de staart tussen het vijfde cijfer en de palm van de niet-dominante hand.
  3. Reinig de buik met 70% ethanol. Steek de naald in de linker (of rechteronderbuik) en injecteer het endotoxine.
    OPMERKING: Er moet voor worden gezorgd dat de naald niet te diep wordt ingebracht, omdat er een risico bestaat op orgaanletsel dat de experimenten kan verstoren (bijv. letsel aan de darmen, darmen, nieren, enz.).
  4. Voer de stappen 2.1-2.3 uit bij controledieren met behulp van normale zoutoplossing (of medium).
    OPMERKING: APAP-geïnduceerde leverbeschadiging kan worden bereikt met behulp van een vergelijkbare methodologie als hierboven, met behulp van APAP in plaats van endotoxine6. Zie de discussie voor details met betrekking tot het APAP-geïnduceerde leverbeschadigingsmodel.

3. Inductie en onderhoud van de anesthesie van de dieren en euthanasie

  1. Plaats de dieren onder een chirurgisch vlak van anesthesie. Houd de anesthesie in stand met behulp van ingeademd isofluraan via een neuskegel of een tracheacanule. Beoordeel en pas het anesthesieniveau aan door te controleren op beweging na een teenknijp.
  2. Voer euthanasie uit aan het einde van alle experimenten door verbloeding onder een chirurgisch vlak van anesthesie, gevolgd door bilaterale pneumothoraces.

4. Katheterisatie van de halsader en de luchtpijp

  1. Voer een tracheotomie uit om de ademhaling te vergemakkelijken en de plaatsing van vasculaire katheters voor de injectie van gelabelde antilichamen/kleurstoffen.
    OPMERKING: Een chirurgische dissectiemicroscoop of loepen zijn nuttig bij katheterisatie.
  2. Scheer de vacht vanaf de nek en buik; Verwijder overtollig haar. Plaats het dier op een warmhoudkussen om de lichaamstemperatuur op 37 °C te houden en gebruik een rectale sonde om de kerntemperatuur te controleren. Scrub de nek met betadine gevolgd door 70% ethanol.
  3. Maak een verticale incisie in de middellijn in de nek en leg de luchtpijp bloot met behulp van stompe dissectie.
    1. Tracheostomie
      1. Bereid een tracheacanule PE90 voor met een ingebrachte stompe naald van 21 G (Figuur 1A).
        OPMERKING: Het toevoegen van een afschuining van ~45° aan het uiteinde van de tracheacanule kan het inbrengen in de luchtpijp vergemakkelijken. Als alternatief kan een perifere intraveneuze katheter van 18-20 G ook worden vervangen door PE90-slang.
      2. Zodra de huid en fascia zijn ingesneden, reflecteert u de speekselklieren weg van het midden.
      3. Gebruik een stompe dissectie om de sternothyroïdspier te scheiden om een betere toegang tot de luchtpijp te krijgen.
        OPMERKING: Zorg ervoor dat u de toevoerende bloedvaten en de halsslagaders die zich naast de luchtpijp bevinden, vermijdt.
      4. Maak een kleine (~1-2 mm) horizontale incisie tussen de tracheale ringen aan de ventrale/anterieure zijde van de luchtpijp (Figuur 1B).
        OPMERKING: Het gebruik van een Vannas-schaar zorgt voor een goede dissectie. Zorg ervoor dat alleen het voorste vlak van de luchtpijp wordt ingesneden; Volledige doorsnijding van de luchtpijp maakt het moeilijk om de luchtpijp te cannuleren en riskeert beschadiging van nabijgelegen vasculaire structuren.
      5. Steek een tracheocanule in het gat. Zorg ervoor dat de punt van de buis niet voorbij de carina wordt ingebracht.
      6. Zet de tracheostomiebuis vast in de luchtpijp door een #4-0 zijden hechtdraad rond de luchtpijp en de buis te binden, waarbij de tracheale ringen als ondersteuning worden gebruikt (Figuur 1C).
    2. Uitwendige halscanulatie
      1. Bereid een halskatheter voor (Figuur 2) met behulp van PE50-slang (OD 0.97 mm, ID 0.58 mm) met PE10-slang (OD 0.61 mm, ID 0.28 mm) ingebracht in het ene uiteinde (inzet Figuur 2) en een stompe naald van 22 G of 23 G ingebracht in het andere. Gebruik lijm om ervoor te zorgen dat de slang niet wegglijdt of lekt. Bevestig een spuit gevuld met steriele normale zoutoplossing om de katheter door te spoelen.
      2. Leg de uitwendige halsader (EJV) bloot na reflectie van de speekselklier. Maak met behulp van stompe dissectie de EJV vrij van het omliggende bindweefsel (Figuur 3A).
      3. Gebruik #4-0 zijden hechtingen om het schedeluiteinde van de gevisualiseerde EJV te ligate en plaats een losse lus rond het caudale uiteinde van de EJV (Figuur 3B). Klem de uiteinden van elke hechting samen met hemostaten en trek de twee hemostaten voorzichtig van elkaar terug om de EJV bloot te leggen.
        OPMERKING: Het optimale gebied om te cannuleren is tussen de takken van de voorste halsader craniaal en de interne halsader caudaal. Om het plaatsen van de hechtingen te vergemakkelijken, vouwt u een stuk (~15 cm) hechtdraad dubbel en haalt u het gebogen uiteinde onder de EJV door met een tang terwijl u de EJV met een aparte tang optilt om te voorkomen dat het schip wegrolt. Knip vervolgens de hechtdraad af om twee afzonderlijke lengtes te maken.
      4. Maak met een Vannas-schaar een kleine (~1 mm) incisie in het voorste oppervlak van de EJV. Steek een gebogen stompe naald van 30 G (aangevuld met een minutienpen van 0,15 mm die stomp is gevijld en in de naaldpunt is ingebracht) in de EJV via de incisie en til deze voorzichtig op om de doorgang van de katheter met normale zoutoplossing in de EJV te vergemakkelijken.
        NOTITIE: Zorg ervoor dat de katheter en naaf geen luchtbellen hebben voordat u ze inbrengt en in de muis spoelt. Een luchtembolie kan dodelijk zijn voor het dier.
      5. Zodra de katheter zich in het EJV bevindt, maakt u de caudale lus net genoeg los om de katheter dieper in de ader te laten passeren. Controleer of de katheter is geplaatst door bloed op te zuigen en de katheter door te spoelen om te controleren op lekken (Figuur 3C).
      6. Zet de katheter met behulp van de caudale lus vast in het EJV. Bevestig de katheter met behulp van de schedelhechting aan het craniale uiteinde van het EJV om onbedoelde decannulatie te minimaliseren (Figuur 3D).
      7. Sluit de incisie in de nekhuid met #4-0 zijden hechtdraad.

5. Exteriorisatie van de lever

  1. Reinig de buik met een betadine scrub gevolgd door 70% ethanol.
  2. Maak een verticale incisie van ~1 cm in de huid van de bovenbuik, beginnend bij de basis van het borstbeen. Gebruik een stompe dissectie om de huid van de buikspieren te scheiden. Schroei de grote voedingsvaten van de huid en spieren dicht om bloedingen tijdens de volgende stappen tot een minimum te beperken (Figuur 4A).
  3. Maak een horizontale incisie van ~1-2 cm in de huid, gevolgd door de buikspier, waarbij de verticale incisie in stap 5.2 ongeveer aan de bovenkant van de zichtbare lever wordt doorgesneden; gebruik een cauterisatiehulpmiddel om te helpen bij hemostase van de huid (Figuur 4B).
    OPMERKING: De grootte van de incisie in de buik is van cruciaal belang voor een optimale beeldvorming van de lever. Als de opening te klein is, bestaat het risico op leverischemie als gevolg van overrekking of impingement van de leverslagader en/of poortader. Als de opening te groot is, kunnen ook andere organen, zoals de darmen, naar buiten worden geëxterioriseerd en de beeldvorming verstoren.
  4. Snijd een cirkel van ongeveer 1 cm in het midden van een gaasje van 2 x 2 inch en bevochtig het met warme normale zoutoplossing. Plaats het gaas zo dat de opening gecentreerd is over de incisie. Trek de randen van de incisie voorzichtig uit elkaar en oefen lichte, opwaartse druk uit op de buik om de lever te exterioriseren, zodat de lever gemakkelijk op het bevochtigde gaasje rust (Figuur 4C).
  5. Plaats de muis in buikligging op de beeldvormingslade, met de lever gecentreerd over het dekglaasje (Figuur 4D).
    OPMERKING: Bij een controledier moet de lever er kastanjebruin uitzien. In dit protocol wordt voor IVM een omgekeerde, confocale laserscanmicroscoop met een tweewegresonantiekopscanner gebruikt. Daarom werd een 3D-printer gebruikt om een IVM-lade op maat te maken (Afbeelding 5). De .stl-bestanden die zijn gemaakt voor 3D-printen worden meegeleverd (aanvullend bestand 1); Aanpassingen kunnen nodig zijn om aan de behoeften van individuen te voldoen.
  6. Breng het dier over naar de omgekeerde microscoop.

6. Beeldvorming met intravitale microscopie van de lever

OPMERKING: Dit protocol maakt gebruik van een confocale laserscanmicroscoop met een tweerichtingsresonantiekopscanner voor intravitale microscopie. Om de frequentie van de resonantiekop te stabiliseren, schakelt u het systeem ten minste 30 minuten in voordat u beeldvorming uitvoert. Verschillende systemen kunnen verschillende mogelijkheden hebben. Bespreking hiervan valt buiten het bestek van dit artikel. Neem contact op met de vertegenwoordigers van de apparatuur voor de technische details van specifieke systemen.

  1. Om een chirurgisch vlak van anesthesie te behouden, sluit u het dier aan op het isofluraantoedieningssysteem.
    OPMERKING: Afhankelijk van het experimentele protocol kan mechanische beademing nodig zijn (vs. spontane beademing).
  2. Plaats een stralingsverwarmingskussen over het dier en houd met behulp van de rectale sonde een kerntemperatuur van 37 °C.
    OPMERKING: In dit protocol fungeert een rechthoekig stuk schuim dat rond de IVM-lade past als een isolator en een afstandhouder waarop het stralende verwarmingskussen moet worden geplaatst (Afbeelding 4D).
  3. Stel de objectieftoren in op de gewenste vergroting en breng indien nodig onderdompelingsolie aan. Om dit protocol te volgen, gebruikt u het 60x/NA1.30 siliconenolieobjectief met 1x optische zoom.
  4. Zodra het brandvlak is geïdentificeerd, identificeert u ≥10 willekeurige gezichtsvelden, waarbij u de gebieden nabij de randen van de lever vermijdt.
    OPMERKING: Aangezien de lever autofluorescentie vertoont in het fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-kanaal, moet epifluorescentie worden gebruikt om snel het algemene brandpuntsvlak te identificeren.
    1. Identificeer, afhankelijk van het systeem, de randen van de zichtbare lever met behulp van epifluorescentie in het FITC-kanaal en noteer de (x,y) stadiumcoördinaten.
    2. Gebruik de (x,y) grenzen van de lever en een generator voor willekeurige getallen om willekeurige (x,y) coördinaten te identificeren. Zoek voor een acceptabel gezichtsveld naar (a) de aanwezigheid van schepen verspreid over het gezichtsveld; b) ≥80% van de vaartuigen in hetzelfde brandpuntsvlak; en (c) ≥1 gezichtsveld verwijderd van de leverranden (voorbeeld in figuur 6). Als de focus van de beeldanalyse ligt op bloedplaatjes-leukocyten-endotheliale interacties in de sinusoïden van de lever, sluit dan velden uit met vaten met een diameter van ≥15 μm (sinusoïden van muizen hebben doorgaans een diameter van ≤10 μm).

7. Analyse van het beeld

OPMERKING: ImageJ/FIJI is gebruikt om alle afbeeldingen in dit document te verwerken. FIJI (fiji.sc) is een open-source versie van Image J (imagej.nih.gov) die meer functionaliteit heeft door het gebruik van extra plugins en macro's13.

  1. Open de multichannel, time-lapsed bestanden in ImageJ/FIJI.
    OPMERKING: Afhankelijk van het platform kunnen extra programma's/plug-ins nodig zijn. ImageJ/FIJI heeft een Bio-Formats Importer die meerdere verschillende soorten bestanden kan openen, zoals de .oir-bestanden van Olympus. Hier zijn de bestanden geconverteerd naar .tif omdat het een meer gebruikt formaat is.
  2. Zorg ervoor dat de juiste schaal is ingesteld; Zoek naar de pixel/μm-verhouding en het tijdsinterval in de metadata/eigenschappen.
  3. Gebruik verschillende filters om achtergrondruis te verwijderen (bijvoorbeeld een mediaanfilter met een straal van 2 pixels die in dit protocol wordt gebruikt). Zorg ervoor dat de verwerking van alle afbeeldingen vergelijkbaar is om variatie in de nabewerking te minimaliseren. Aangezien tellingen en lengtes in deze experimenten worden vergeleken, in plaats van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit, filter om de helderheid en de identificatie en meting van cel-celinteracties te verbeteren.
    OPMERKING: Het gebruik en de grootte van filters zijn afhankelijk van de grootte van het (de) gewenste doel(en) en de signaal-ruisverhouding in de afbeeldingen.
  4. Aangezien er heterogeniteit is tussen de gezichtsvelden in vasculaire dichtheid, meet u het totale vasculaire gebied in elk veld met behulp van het selectiepenseel (Figuur 7).
    1. Klik met de rechtermuisknop op het ovale selectiegereedschap en kies het selectiepenseel .
    2. Pas de grootte van het penseel aan door te dubbelklikken op het pictogram van het selectiepenseel .
    3. Traceer de schepen om ze te markeren/selecteren. Als u delen van de selectie wilt verwijderen, gebruikt u [alt]-linksklik en voegt u onderdelen toe met [shift]-linksklik.
    4. Druk op [M] om het geselecteerde gebied te meten.
      OPMERKING: Als de beeldschaal correct is ingesteld, moet de uitvoer in μm2 zijn, die wordt geconverteerd naar mm2.
  5. Tel het aantal bloedplaatjes en leukocyten in het veld. Beschouw cellen als aangehechte cellen als ze gedurende 30 s <1 cellichaam hebben bewogen. Bereken het aantal cellen (bloedplaatjes en/of leukocyten) per mm2.
  6. Om de relatieve bloedstroom in elk vat te schatten, meet u de gemiddelde snelheid van rode bloedcellen (RBC) als surrogaat met behulp van de MTrackJ-plug-in in ImageJ/FIJI (imagescience.org/meijering/ software/mtrackj)14, zoals eerder beschreven5. Identificeer rode bloedcellen als ronde of schijfvormige vuldefecten in het dexdexkanaal. Sla de nummers op voor het bijhouden van gegevens, asynchrone analyse en verificatie.
    OPMERKING: Een voorbeeld hiervan wordt getoond in Afbeelding 8 en Aanvullende Video S1.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Beoordeling van het effect van het vimentinstaafdomein op de hechting van leukocyten aan ontstoken endotheel
Leukocyten P-selectine glycoproteïne ligand-1 (PSGL-1) binden aan endotheel- en bloedplaatjes P-selectine vindt plaats tijdens de acute fase van door sepsis geïnduceerde leverbeschadiging ontsteking. Er is echter aangetoond dat het recombinante humane staafdomein van vimentine (rhRod) bindt aan P-selectine en de hechting van leukocyten aan zowel endotheel als b...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het doel van dit methodedocument is om de noodzakelijke stappen te schetsen die nodig zijn om op betrouwbare wijze intravitale beelden en video's met hoge resolutie van de muizenlever vast te leggen onder homeostatische omstandigheden en na toediening van endotoxine of APAP. Hoewel dit protocol de consistente productie van gegevens over bloedplaatjes-leukocyten-endotheliale interacties in de lever mogelijk heeft gemaakt, zijn er een aantal cruciale stappen nodig voor succes, evenals moge...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen. De financiers hadden geen rol in de opzet van het onderzoek, het verzamelen en analyseren van gegevens, de beslissing om te publiceren of de voorbereiding van het manuscript. De inhoud vertegenwoordigt niet de standpunten van het Amerikaanse ministerie van Veteranenzaken of de regering van de Verenigde Staten.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door NIH/NIGMS GM-123261 (FWL) en NIH/NHLBI HL139425 (JC). Onderzoeksondersteuning werd ook gefinancierd door NIH/NHLBI HL116524.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Chirurgische benodigdheden
2" x 2" niet-geweven sponzenMcKesson Med. Surg92242000Voor leverisolatie
#4-0 zijden gevlochten hechtdraad met naaldSOFSILKN/A4-0 Softsilk gecoat gevlochten zwart, niet-oplosbaar: C-1 snijdende naald
#4-0 zijden gevlochten hechtdraad zonder naaldEthiconN/A4-0 Zwart gevlochten zijde, niet-oplosbaar
21 G stompe naald (0,5 inch)SAI Infusion TechnologiesB21-50Dit wordt gebruikt om aan te sluiten op het uiteinde van de tracheostomiebuis om verbinding te maken met de ventilator. Een alternatieve bron is Instech
23 G stompe naald (0,5 inch)SAI Infusion TechnologiesB23-50Dit wordt gebruikt voor de vasculaire katheter om verbinding te maken met een spuit. Een alternatieve bron is Instech
Dissectie schaar (puntige punt)Kent ScientificINS600393-GMicro dissectieschaar; Carbide Blades; Recht; Scherpe punten; 24 mm Bladlengte; 4 1/2" Totale lengte
McPherson-Vannas Micro Scissors (Vannas)Kent ScientificINS600124Deze zijn nuttig voor het maken van de openingen in de luchtpijp en bloedvaten
Polyethyleen buis 10InstechBTPE-10Dit wordt gebruikt om het intravasculaire deel van de katheter te maken. Een alternatieve bron is BD Intramedic
Polyethyleen buis 50InstechBTPE-50Dit wordt gebruikt om het extravasculaire deel van de katheter te maken.  Een alternatieve bron is BD Intramedic
Polyethyleen buis 90InstechBTPE-90Dit wordt gebruikt om de tracheostomiebuis te maken.  Een alternatieve bron is BD Intramedic
USP-graad steriele normale zoutoplossingCoviden8881570121Hospira 0,0% natriumchloride-injectie, USP
Microscopie benodigdheden
Isofluraandleveringssysteem en ventilatorKent ScientificSomnosuiteCombinatie knaagdierventilator en vluchtige anesthesieleveringssysteem
Schuim spacer voor verwarmingspad tijdens microscopieN/AN/ADeze spacer moet worden gesneden uit hoogwaardig schuim, moet passen rond de levermicroscooplade en specifieke hoogteafmetingen zijn afhankelijk van het microscoopsysteem
Laser scanning confocal microscoopsysteem met resonantiehoofdscannerOlympusFV3000Hoewel we het gebruik van een Olympus FV3000 beschrijven met behulp van een resonantiehoofdscanner, zal dit protocol met de meeste beeldvormingssystemen werken
Lever MicroscoopladeN/AN/ADe levermicroscooplade is ontworpen voor een omgekeerde microscoop
Antilichamen & Gerelateerde reagentia
Brilliant Violet 421/anti-muis Ly6G antilichaamBioLegend1276283 µg/muis. Om neutrofielen te labelen
BV421/F4/80 antilichaamBioLegend1231320,75 mg/kg. Om Kupffer-cellen te labelen
Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing zonder calcium of magnesiumGibco/ThermoFisher Scientific14190144Gebaten als dialysaat om natriumaziet uit antilichamen te verwijderen
DyLight649/anti-GPIbβ antilichaamemfret AnalyticsX6493 µg/muis. Om bloedplaatjes te labelen
DyLight488/anti-muis GPIbβ antilichaamemfret AnalyticsX4886 µg/muis. Om bloedplaatjes te labelen
Endotoxine van Escherichia coli serotype O111:B4Sigma-AldrichL30245 mg/kg; De potentie van endotoxine kan variëren van batch tot batch. Daarom moet dezelfde batch worden gebruikt voor een reeks experimenten om variatie door endotoxine-batch te minimaliseren
PerCP-eFluor 710/anti-muis P-selectin antilichaamInvitrogen46-0626-824 µg/muis. Om P-selectine te labelen
Slide-a-Lyzer 7.000 MWCO cassetteThermo Scientific66370Gebaten om antilichamen te dialyseren om natriumaziet te verwijderen
Texas Red-gelabeld dextranSigma-AldrichT1287~150 kDa; 250 µg/muis
TRITC/runderserumalbumineSigma-AldrichA2289500 µg/muis. Verdun tot een stockconcentratie van 50 mg/mL (5%) in fysiologische zoutoplossing. Gebruikt om het vaatstelsel te labelen. Het kan gemakkelijker in het interstitiële ruimte lekken dan hoog moleculair gewichtsdextran tijdens ontsteking

Referenties

  1. Deitch, E. A. Rodent models of intra-abdominal infection. Shock. 24, Suppl 1 19-23 (2005).
  2. Nolan, J. P. The role of intestinal endotoxin in liver injury: A long and evolving history. Hepatology. 52 (5), 1829-1835 (2010).
  3. Miyakawa, K., et al. Platelets and protease-activated receptor-4 contribute to acetaminophen-induced liver injury in mice. Blood. 126 (15), 1835-1843 (2015).
  4. Da, Q., Derry, P. J., Lam, F. W., Rumbaut, R. E. Fluorescent labeling of endogenous platelets for intravital microscopy: Effects on platelet function. Microcirculation. 25 (6), 12457(2018).
  5. Lam, F. W., et al. The vimentin rod domain blocks P-selectin-P-selectin glycoprotein ligand 1 interactions to attenuate leukocyte adhesion to inflamed endothelium. PLoS One. 15 (10), 0240164(2020).
  6. Shan, Z., et al. Chitinase 3-like-1 contributes to acetaminophen-induced liver injury by promoting hepatic platelet recruitment. eLife. 10, 68571(2021).
  7. Daley, J. M., Thomay, A. A., Connolly, M. D., Reichner, J. S., Albina, J. E. Use of Ly6G-specific monoclonal antibody to deplete neutrophils in mice. Journal of Leukocyte Biology. 83 (1), 64-70 (2008).
  8. Pollenus, E., et al. Limitations of neutrophil depletion by anti-Ly6G antibodies in two heterogenic immunological models. Immunology Letters. 212, 30-36 (2019).
  9. Wang, J. X., et al. Ly6G ligation blocks recruitment of neutrophils via a β2-integrin-dependent mechanism. Blood. 120 (7), 1489-1498 (2012).
  10. Cunin, P., et al. Differential attenuation of β2 integrin-dependent and -independent neutrophil migration by Ly6G ligation. Blood Advances. 3 (3), 256-267 (2019).
  11. Weary, M. E., Donohue, G., Pearson, F. C., Story, K. Relative potencies of four reference endotoxin standards as measured by the Limulus amoebocyte lysate and USP rabbit pyrogen tests. Applied and Environmental Microbiology. 40 (6), 1148-1151 (1980).
  12. Kiers, D., et al. Comparison of different lots of endotoxin and evaluation of in vivo potency over time in the experimental human endotoxemia model. Innate Immunity. 25 (1), 34-45 (2019).
  13. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  14. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
  15. Sierro, F., et al. A liver capsular network of monocyte-derived macrophages restricts hepatic dissemination of intraperitoneal bacteria by neutrophil recruitment. Immunity. 47 (2), 374-388 (2017).
  16. Guidotti, L. G., et al. Immunosurveillance of the liver by intravascular effector CD8+ T cells. Cell. 161 (3), 486-500 (2015).
  17. Davis, R. P., et al. Optimization of in vivo imaging provides a first look at mouse model of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) using intravital microscopy. Frontiers in Immunology. 10, 2988(2020).
  18. Reif, R., et al. In vivo imaging of systemic transport and elimination of xenobiotics and endogenous molecules in mice. Archives of Toxicology. 91 (3), 1335-1352 (2017).
  19. Sloboda, D. D., Brooks, S. V. Treatment with selectin blocking antibodies after lengthening contractions of mouse muscle blunts neutrophil accumulation but does not reduce damage. Physiological Reports. 4 (1), 12667(2016).
  20. Lam, F. W., Da, Q., Guillory, B., Cruz, M. A. Recombinant human vimentin binds to P-selectin and blocks neutrophil capture and rolling on platelets and endothelium. Journal of Immunology. 200 (5), 1718-1726 (2018).
  21. Mossanen, J. C., Tacke, F. Acetaminophen-induced acute liver injury in mice. Laboratory Animals. 49, 30-36 (2015).
  22. Guerrero Munoz, F., Fearon, Z. Sex related differences in acetaminophen toxicity in the mouse. Journal of Toxicology. Clinical Toxicology. 22 (2), 149-156 (1984).
  23. Larsen, A. K., et al. Autofluorescence in freshly isolated adult human liver sinusoidal cells. European Journal of Histochemistry. 65 (4), 3337(2021).
  24. Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4 (158), (2012).
  25. Jost, A. P., Waters, J. C. Designing a rigorous microscopy experiment: Validating methods and avoiding bias. Journal of Cell Biology. 218 (5), 1452-1466 (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Interacties tussen bloedplaatjes en leukocytenleversinusoidenacute leverschadelive animal imagingmicrocirculatie ontstekingtrombosemodellenin vivo imaging
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen