Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Detectie van homologe recombinatietussenproducten via nabijheidsligatie en kwantitatieve PCR in saccharomyces cerevisiae

2.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64240

⸱

11 september 2022

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology & Molecular Genetics, University of California, Davis, 2Laboratory of Biology & Modeling of the Cell, École Normale Supérieure de Lyon, 3Department of Molecular & Cellular Biology, University of California, Davis

In dit artikel

Samenvatting

De D-loop capture (DLC) en D-loop extension (DLE) assays maken gebruik van het principe van proximity ligatie samen met kwantitatieve PCR om D-loopvorming, D-loop extensie en productvorming te kwantificeren op de plaats van een induceerbare dubbelstrengs breuk in Saccharomyces cerevisiae.

Samenvatting

DNA-schade, waaronder DNA-dubbelstrengsbreuken en dwarsverbanden tussen strengen, opgelopen tijdens de S- en G2-fasen van de celcyclus, kan worden hersteld door homologe recombinatie (HR). Daarnaast vertegenwoordigt HR een belangrijk mechanisme voor replicatievorkredding na stilstand of instorting. De regulering van de vele omkeerbare en onomkeerbare stappen van dit complexe pad bevordert de trouw ervan. De fysische analyse van de recombinatie-intermediairs gevormd tijdens HR maakt de karakterisering van deze controles door verschillende nucleoproteïnefactoren en hun interactoren mogelijk. Hoewel er gevestigde methoden zijn om specifieke gebeurtenissen en tussenproducten in het recombinatiepad te testen, is de detectie van D-lusvorming en -uitbreiding, twee kritieke stappen in dit pad, tot voor kort een uitdaging gebleken. Hier worden efficiënte methoden beschreven voor het detecteren van belangrijke gebeurtenissen in de HR-route, namelijk DNA-dubbelstrengs breukvorming, D-lusvorming, D-lusuitbreiding en de vorming van producten via break-induced replication (BIR) in Saccharomyces cerevisiae . Deze testen detecteren hun relevante recombinatietussenproducten en producten met een hoge gevoeligheid en zijn onafhankelijk van cellulaire levensvatbaarheid. De detectie van D-loops, D-loop extensie en het BIR-product is gebaseerd op nabijheidsligatie. Samen maken deze testen de studie van de kinetiek van HR op populatieniveau mogelijk om de functies van HR-eiwitten en regulatoren nauwkeurig aan te pakken bij belangrijke stappen in het traject.

Inleiding

Homologe recombinatie (HR) is een high-fidelity mechanisme voor reparatie van DNA dubbelstrengsbreuken (DSB's), interstrengs dwarsverbindingen en ssDNA-hiaten, evenals een route voor DNA-schadetolerantie. HR verschilt van foutgevoelige routes voor DNA-schadeherstel / -tolerantie, zoals niet-homologe eindverbinding (NHEJ) en translesiesynthese, omdat het een intact, homoloog duplex-DNA als donor gebruikt om de reparatiegebeurtenis te templaten. Bovendien zijn veel van de belangrijkste tussenpersonen in het HR-traject omkeerbaar, waardoor de individuele trajectstappen uitstekend kunnen worden gereguleerd. Tijdens de S-, G2- en M-fasen van de celcyclus concurreert HR met NHEJ voor de reparatie van de tweezijdige DSB's1. Bovendien is HR essentieel voor DNA-replicatie voor het herstel van replicatie-geassocieerde DNA-schade, inclusief ssDNA-hiaten en eenzijdige DSB's, en als een mechanisme van DNA-laesie bypass2.

Een kritisch tussenproduct in de HR-route is de verplaatsingslus of D-lus (figuur 1). Na eindresectie laadt het centrale recombinase in de reactie, Rad51, op het nieuw gereseceerde ssDNA van het gebroken molecuul en vormt een spiraalvormig filament2. Rad51 voert vervolgens een homologieonderzoek uit om een geschikte homologe donor te identificeren, meestal de zusterchromatide in somatische cellen. De D-lus wordt gevormd wanneer het Rad51-ssDNA-filament een homoloog duplex-DNA binnendringt, wat leidt tot de Watson-Crick-basisparing van de gebroken streng met de complementaire streng van de donor, waardoor de tegenovergestelde donorstreng wordt verplaatst. Verlenging van het 3'-uiteinde van de gebroken streng door een DNA-polymerase vervangt de basen die verloren zijn gegaan tijdens de DNA-schadegebeurtenis en bevordert de resolutie van het uitgebreide D-lustussenproduct in een dsDNA-product via de synthese-afhankelijke strenggloeiing (SDSA), de dubbele Holliday-junctie (dHJ) of de break-induced replication (BIR) HR-subroutes.

Assays die de tussenproducten in de HR-route fysiek monitoren, maken de analyse van de genetische vereisten voor elke stap mogelijk (d.w.z. pathway-analyse). DSB-vorming, eindresectie, dHJ's, BIR-replicatiebubbels en HR-producten worden gemakkelijk waargenomen door Southern blotting 3,4,5,6,7. Toch rapporteert Southern blotting niet over ontluikende en uitgebreide D-lussen, en dus is een alternatieve methode nodig om deze gewrichtsmoleculen betrouwbaar te meten 4,8,9. Een veelgebruikte strategie om ontluikende D-lusvorming te analyseren is chromatine-immunoprecipitatie (ChIP) van Rad51 in combinatie met kwantitatieve PCR (qPCR)10,11. Rad51 associatie met dsDNA zoals gemeten door ChIP-qPCR is echter onafhankelijk van sequentie homologie en de Rad51 accessoirefactor Rad5410,11. Daarentegen is een merkbaar signaal met behulp van de hier gepresenteerde methode van D-loop-analyse, de D-loop capture (DLC) -test genoemd, afhankelijk van DSB-vorming, sequentie homologie, Rad51 en de Rad51-accessoire-eiwitten Rad52 en Rad548. De bevinding dat Saccharomyces cerevisiae Rad51-bevorderde D-lusvorming afhankelijk is van Rad54 in vivo, komt overeen met talrijke in vitro reconstitutie-experimenten die aangeven dat Rad54 nodig is voor homologieonderzoek en D-lusvorming door ontluikende gist Rad51 8,12,13,14,15.

De huidige benaderingen voor het meten van D-loop-uitbreiding, voornamelijk via semi-kwantitatieve PCR, zijn eveneens problematisch. Een typische PCR-gebaseerde test om D-loop extensie te detecteren versterkt een unieke sequentie, resulterend uit recombinatie tussen een breukplaats en een ectopische donor en de daaropvolgende recombinatie-geassocieerde DNA-synthese, via een primer stroomopwaarts van het gebied van homologie op de gebroken streng en een andere primer stroomafwaarts van het gebied van homologie op de donorstreng. Met behulp van deze methode vereist de detectie van recombinatie-geassocieerde DNA-synthese de niet-essentiële Pol δ processiviteitsfactor Pol3216. Deze bevinding is in strijd met de constatering dat POL32-deletie slechts een mild effect heeft op de genconversie in vivo17. Bovendien slagen deze PCR-gebaseerde assays er niet in om D-loop-uitbreiding en BIR-productvorming tijdelijk op te lossen, wat suggereert dat het signaal het resultaat is van dsDNA-producten in plaats van ssDNA-tussenproducten 17,18,19. De D-loop extension (DLE) assay is onlangs ontwikkeld om deze discrepanties aan te pakken. De DLE-test kwantificeert recombinatie-geassocieerde DNA-synthese op een plaats ~ 400 basenparen (bp) stroomafwaarts van de initiële 3 'binnendringende eind9. Volgens deze methode is D-loop-extensie onafhankelijk van Pol32 en detecteerbaar binnen 4 uur na DSB-inductie, terwijl BIR-producten voor het eerst worden waargenomen na 6 uur. Inderdaad, een recente publicatie van de Haber en Malkova laboratoria merkte op dat het gebruik van deze methode van bereiding van genomisch DNA enkelvoud resulteert in ssDNA-conservering 9,20.

Hier worden de DLC- en DLE-assays in detail beschreven. Deze testen zijn gebaseerd op nabijheidsligatie om ontluikende en verlengde D-lussen in S. cerevisiae te detecteren (figuur 2)8,9. BIR-producten kunnen worden gekwantificeerd met behulp van hetzelfde testsysteem. Voor beide testen wordt DSB-vorming op een HO-endonuclease-cutplaats op de URA3-locus op chromosoom (Chr.) V geïnduceerd door de expressie van het HO-endonuclease onder controle van een galactose-induceerbare promotor. Rad51-gemedieerde DNA-strenginvasie leidt tot ontluikende D-lusvorming op de plaats van een ectopische donor op de LYS2-locus op Chr. II. Omdat de rechterkant van de DSB homologie aan de donor mist, is reparatie via SDSA en dHJ-vorming niet haalbaar. Initiële reparatie van de DSB door BIR is mogelijk, maar de vorming van levensvatbare producten wordt geremd door de aanwezigheid van het centromeer21. Dit opzettelijke ontwerp voorkomt productieve DSB-reparatie, waardoor de hervatting van de groei door cellen met gerepareerde DBS'en wordt vermeden, die anders de cultuur zouden kunnen inhalen tijdens de analyse van de tijdskoers.

In de DLC-test behoudt psoralen crosslinking van de twee strengen van het heteroduplex DNA binnen de D-loop het recombinatiemiddel. Na herstel van de restrictie-enzymplaats op de gebroken (gereseceerde) streng en de spijsvertering, maakt de crosslinking het mogelijk om de unieke sequenties stroomopwaarts van de homologe gebroken en donor-DNA's te binden. Met behulp van qPCR wordt het niveau van chimere DNA-molecuul in elk monster gekwantificeerd. In de DLE-test is crosslinking niet vereist, en restrictie-enzymplaatsherstel en -vertering gevolgd door intramoleculaire ligatie verbinden in plaats daarvan het 5'-uiteinde van het gebroken molecuul met het nieuw verlengde 3'-uiteinde. Nogmaals, qPCR wordt gebruikt om de relatieve hoeveelheden van dit chimere product in elk monster te kwantificeren. Bij afwezigheid van herstel van de restrictie-enzymplaats rapporteert de DLE-test over de relatieve niveaus van het BIR (dsDNA) -product dat wordt gevormd na D-loop-uitbreiding.

Representatieve resultaten voor elke test met behulp van een wildtype stam worden getoond, en lezers worden verwezen naar Piazza et al.8 en Piazza et al.9 voor het gebruik van deze assays voor de analyse van recombinatiemutanten 8,9. De bedoeling van deze bijdrage is om andere laboratoria in staat te stellen de DLC- en DLE-assays te adopteren, en ondersteuning hiervoor is op aanvraag beschikbaar.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Pre-groei, DSB-inductie en monsterverzameling

OPMERKING: Suppletie van alle media met 0,01% adenine wordt aanbevolen voor Ade-stammen.

  1. Strooi de juiste haploïde stammen (zie tabel 1) uit op gist pepton dextrose adenine (YPDA) (1% gistextract, 2% pepton, 2% glucose, 2% agar, 0,001% adenine) en groei gedurende 2 dagen bij 30 °C.
  2. Gebruik een enkele kolonie om 5 ml YPDA in een glazen kweekbuis van 15 ml te enten. Kweek culturen tot verzadiging bij 30 °C met schudden of rotatie voor beluchting.
  3. DLC-test: Bereid de 5x psoralen stockoplossing (0,5 mg / ml trioxsalen in 200-proof ethanol) in een zuurkast door psoralen op te lossen in een conische buis van 50 ml gewikkeld in aluminiumfolie 's nachts bij kamertemperatuur met continu schudden of inversie. Sluit de schroefdop af met een transparante film om verdamping te voorkomen. Bereid niet meer dan 7 ml 5x psoralen stockoplossing per 50 ml conische buis om een goede oplossing van de psoralen te garanderen.
  4. Gebruik de volgende dag 5 ml van de YPDA-kweek om 50-100 ml YEP-lactaat (1% gistextract, 2% pepton, 2% w / w lactaat, 0,001% adenine) in een fles van de juiste grootte te enten (ontluikende gist groeit optimaal in een kolf die ten minste 5x het volume van de cultuur is) tot een OD600 van ~ 0,03.
  5. Laat de cultuur groeien gedurende ~16 uur bij 30 °C met schudden bij 220 tpm. Meet na ~ 16 uur de OD600 van de cultuur en deze moet ~ 0,5-0,8 zijn. Gebruik geen onder- of overwoekerde culturen.
  6. Verzamel voor elk tijdstip het juiste volume cellen in een conische buis en plaats het op ijs. Meestal is dit 1 x 108 cellen (ongeveer 7,5 ml cultuur bij OD600 1,0 voor een haploïde wildtype stam) voor de DLC-test en 5 x 107 cellen (ongeveer 2,5 ml cultuur bij OD600 1,0) voor de DLE-test.
  7. Om de nauwkeurigheid van de OD600-waarden te garanderen, bereidt u 1:5-verdunningen voor culturen met een OD600≥0.2 om de OD-waarde op 0,2 of lager te houden. Voor wilde stammen liggen de optimale tijdspunten voor DLC-analyse tussen 2 uur en 6 uur en de optimale tijdspunten voor DLE-analyse tussen 4 uur en 8 uur (zie figuur 3 en figuur 4).
  8. DLC-test
    1. Bereid vóór elk tijdstip voldoende 1x psoralenoplossing (0,1 mg/ml trioxsalen, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM EDTA pH 8,0, 20% ethanol) in een zuurkast voor alle monsters in een conische buis van 50 ml gewikkeld in folie. Vertrek bij RT.
    2. Centrifugeer de monsters bij 2.500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Resuspendeer de pellet in 2,5 ml 1x psoralenoplossing in een zuurkast en breng over in een petrischaal van 60 mm x 15 mm. U kunt de pellet ook resuspenteren in 2,5 ml TE1-oplossing (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM EDTA pH 8,0) voor een controle zonder verknoping.
    3. Kruis de monsters. Voor een UV-crosslinker die geschikt is voor langgolvige (365 nm) lampen, plaatst u de petrischalen 1-2 cm onder de UV-lichtbron met het deksel verwijderd bovenop een plastic of plexiglas plaat die is voorgekoeld op −20 ° C. Voor een UV-lichtbak plaatst u de petrischalen direct bovenop de UV-lichtbron. Stel de monsters gedurende 10 minuten bloot met zacht schudden.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de UV-lichtbron bovenop een orbitale schudder in te stellen op ~ 50 rpm.
    4. Breng het monster in een zuurkast over in een nieuwe buis van 15 ml. Spoel de petrischaal af met 2,5 ml TE1-oplossing en voeg dit toe aan het buisje. Centrifugeer de monsters bij 2.500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C, gooi het supernatant op de juiste manier weg en bewaar de pellet bij −20° C. Monsters kunnen maximaal 1 week worden bewaard voordat u naar de volgende stap gaat.
  9. DLE-test
    1. Centrifugeer de monsters bij 2.500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Was de celpellet in 2,5 ml koude TE1-oplossing voordat u de spin herhaalt en bewaar de pellets bij −20 °C. Monsters kunnen maximaal 1 week worden bewaard voordat ze naar de volgende stap gaan.
  10. Verzamel voor monstername op 0 uur de monsters voorafgaand aan de toevoeging van 20% galactose. Induceer voor volgende tijdspunten DSB-vorming door 20% galactose aan de culturen toe te voegen tot een uiteindelijke concentratie van 2%. Verzamel de resterende monsters zoals hierboven beschreven, pellet en vries in ten opzichte van de tijd na de inductie van DSB (d.w.z. het monster van 4 uur wordt 4 uur na de toevoeging van 20% galactose verzameld).

2. Cel sferoplasting, lysis en herstel van de beperkingsplaats

  1. Ontdooi de monsters op ijs. Verwarm een droog bad voor op 30 °C.
  2. Resuspensie van de monsters in 1 ml sferoplastingbuffer (0,4 M sorbitol, 0,4 M KCl, 40 mM natriumfosfaatbuffer pH 7,2, 0,5 mM MgCl2) en breng over naar een microcentrifugebuis van 1,5 ml.
  3. Voeg 3,5 μL zymolyase-oplossing toe (2% glucose, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mg/ml zymolyase 100T; 17,5 μg/ml zymolyase eindconcentratie). Meng zachtjes door te tikken of in te keren. Incubeer bij 30 °C gedurende 15 minuten en plaats het vervolgens op ijs. Verkrijg tijdens de incubatie van 15 minuten vloeibare stikstof of droogijs.
  4. Centrifugeer gedurende 3 minuten bij 2.500 x g bij 4 °C en plaats de monsters op ijs. Was de monsters 3x in 1 ml sferoplastingbuffer. Centrifugeer de monsters gedurende 3 minuten bij 2.500 x g bij 4 °C.
  5. Resuspendeer de monsters in 1 ml koude 1x restrictie-enzymbuffer (50 mM kaliumacetaat, 20 mM tris-acetaat, 10 mM magnesiumacetaat, 100 μg / ml BSA pH ~ 8,0 bij RT) en centrifugeer gedurende 3 minuten bij 16.000 x g bij 4 °C. Leg de monsters op ijs. Herhaal de was 1x.
  6. Resuspendeer de monsters in 1 ml koude 1x restrictie enzymbuffer. Splits het monster (elk 0,5 ml) in twee microcentrifugebuizen van 1,5 ml. Centrifugeer de monsters gedurende 3 minuten bij 16.000 x g bij 4 °C.
  7. Resuspender één buis van elk monster in 180 μL 1,4x restrictie-enzymbuffer met hybridiserende oligo's (zie tabel 2) en één buis in 180 μL 1,4x restrictie-enzymbuffer zonder oligo's te hybridiseren. Elk hybridiserend oligo wordt geresuspendeerd in 1x TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA pH 8,0) en gebruikt bij een eindconcentratie van 7 nM. De 1x TE vervangt de hybridiserende oligo's in de 1,4x restrictie-enzymbuffer zonder oligo's te hybridiseren.
    OPMERKING: De hybridiserende oligo's moeten bij −20 °C in kleine aliquots bij de werkende verdunning worden bewaard. De concentratie van de hybridiserende oligo's kan optimalisatie vereisen; zie Discussie.
  8. Vries de monsters in vloeibare stikstof of droogijs/ethanol en bewaar bij −80 °C. Monsters kunnen in dit stadium enkele maanden worden bewaard.

3. Restrictie-enzym digestie en intramoleculaire ligatie

  1. Ontdooi de monsters op ijs. Verwarm één droog bad voor op 65 °C en een ander op 37 °C.
  2. Pipetteer 36 μL van het monster in een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis op ijs. Breng het resterende monster onmiddellijk terug naar −80 °C voor opslag.
  3. Voeg 4 μL 1% SDS (0,1% eindconcentratie) toe en meng door zachtjes op de zijkant van de buis te tikken. Incubeer bij 65 °C gedurende 15 minuten met zachtjes tikken om de 5 minuten. Plaats monsters op ijs onmiddellijk na de incubatie.
    OPMERKING: Deze SDS-behandeling bevordert de denaturatie van DNA-geassocieerde eiwitten, oplosbaarheid van de nucleaire envelop en chromatinetoegankelijkheid voorafgaand aan de restrictie-enzymvertering en intramoleculaire ligatiestappen.
  4. Voeg 4,5 μL van 10% Triton X-100 (1% eindconcentratie) toe en meng door te pipetteren. Voeg 20-50 U restrictie-enzym (EcoRI-HF of HindIII-HF) toe aan elk monster en incubeer bij 37 °C gedurende 1 uur met zachte agitatie om de 20-30 min. Verwarm gedurende deze tijd een droog bad voor op 55 °C en stel een waterbad in op 16 °C.
  5. Voeg 8,6 μL 10% SDS (1,5% eindconcentratie) toe aan elk monster en meng door te pipetteren en te tappen. Incubeer bij 55 °C gedurende 10 min. Voeg 80 μL 10% Triton X-100 (6% eindconcentratie) toe aan elk monster en meng door te pipetteren.
  6. Voeg 660 μL 1x ligatiebuffer zonder ATP (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 2,5 μg/ml BSA) + 1 mM ATP pH 8,0 + T4 DNA ligase (8 U/monster) toe aan elk monster en meng door zachte inversie. Incubeer bij 16 °C gedurende 1,5 uur met inversie om de 30 minuten. Plaats de monsters direct na de incubatie op ijs.

4. DNA-zuivering

  1. Verwarm één droog bad voor op 65 °C en een ander op 37 °C. Voeg 1 μL 10 mg/ml proteïnase K (bereid in 1x TE pH 8,0) toe aan elk monster (12,5 μg/ml eindconcentratie). Incubeer bij 65 °C gedurende 30 minuten en plaats de monsters onmiddellijk na de incubatie op ijs totdat ze zijn afgekoeld.
  2. Breng de monsters over in buizen van 2 ml. Werk in een zuurkast en voeg een gelijk volume (~ 800 μL) fenol / chloroform / isoamylalcohol (P / C / IA; pH 8,0) toe aan elk monster. Vortex de monsters voor ~ 30 s en centrifugeer de monsters gedurende 5-10 minuten bij 16.000 x g in een microcentrifuge.
  3. Verwijder voorzichtig 600 μL van de bovenste fase van elk monster in een nieuwe buis van 1,5 ml. Gooi de onderste fase en 2 ml buizen op de juiste manier weg.
  4. Precipiteer het DNA door een 1/10 volume van 3 M natriumacetaat pH 5,2 (~ 60 μL) aan elk monster toe te voegen, gevolgd door 1 volume isopropanol (~ 660 μL). Keer de monsters 5x-10x om en incubeer bij RT gedurende 30 minuten.
  5. Plaats de monsters gedurende 2 minuten op ijs en centrifugeer de monsters vervolgens bij 16.500 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C in een microcentrifuge. Breng de monsters terug naar ijs, giet het supernatant af en giet de buis af op een papieren handdoek.
  6. Was de DNA-pellet met 200 μL 70% ethanol. Centrifugeer bij 16.500 x g gedurende 3 minuten bij 4 °C, plaats de monsters terug op ijs, giet het supernatant af en verwijder de resterende alcohol met een pipet. Droog de monsters met de doppen van de buizen open bij 37 °C gedurende 15-20 minuten.
  7. Resuspendeer de DNA-pellets in 50 μL van 1x TE door vortexing. Incubeer bij RT gedurende 30 minuten, vortex en incubeer vervolgens bij 37 °C in een droog bad gedurende 30 minuten. Vortex de monsters opnieuw en plaats ze vervolgens op ijs. Monsters kunnen in dit stadium enkele maanden bij −20 °C worden bewaard, maar het is raadzaam om onmiddellijk over te gaan tot de decrosslinking (alleen DLC) en qPCR-stappen.

5. Psoralen crosslink reversal (alleen voor DLC-assay)

  1. Pipetteer 9 μL gezuiverd DNA in een PCR-buis op ijs. Voeg 1 μL van 1 M KOH (0,1 M eindconcentratie) toe. Incubeer de monsters bij 90 °C gedurende 30 minuten in een thermocycler.
  2. Voeg 19,73 μL natriumacetaatoplossing (0,1 M natriumacetaat, 9,6 mM Tris-HCl pH 8,0, 1,0 mM EDTA pH 8,0) toe. Monsters kunnen in dit stadium enkele maanden bij −20 °C worden bewaard, maar het is raadzaam om onmiddellijk over te gaan tot de qPCR-stap.

6. Kwantitatieve PCR, controles en analyse

  1. Stel met behulp van 2 μL gezuiverd DNA, met of zonder crosslinking, een 20 μL qPCR-reactie in volgens de instructies van de fabrikant. Stel elke reactie in tweevoud in. Voor zowel de DLC- als de DLE-assays zijn er vijf controlereacties en één DLC/DLE-kwantificeringsreactie, of in totaal zes reacties per monster, in tweevoud uitgevoerd. Aanvullende tabel S1 en aanvullende tabel S2 bieden een sjabloon voor het opzetten van deze reacties en analyses, en de sequenties van de qPCR-primers zijn vermeld in tabel 3.
  2. qPCR-fietsomstandigheden moeten worden geoptimaliseerd voor elke qPCR-kit.
    1. Gebruik de volgende DLC qPCR-condities, afhankelijk van de gebruikte qPCR-kits: initiële denaturatie (95 °C gedurende 3 min); 50 versterkingsronden (95 °C gedurende 15 s, 61 °C gedurende 25 s, 72 °C gedurende 15 s met een enkele verwerving); smeltcurveanalyse (95 °C gedurende 5 s, 65 °C gedurende 1 min, 97 °C met continue acquisitie); en koeling (37 °C gedurende 30 s).
    2. Gebruik de volgende qPCR-voorwaarden voor de DLE-test: initiële denaturatie (95 °C gedurende 5 min); 50 versterkingsronden (95 °C gedurende 15 s, 60 °C gedurende 30 s, 72 °C gedurende 15 s met een enkele verwerving); smeltcurveanalyse (95 °C gedurende 5 s, 65 °C gedurende 1 min, 97 °C met continue acquisitie); en koeling (37 °C gedurende 30 s). Houd er rekening mee dat optimalisatie voor verschillende qPCR-machines/-kits nodig kan zijn.
  3. DLC-test
    1. Besturingselementen: Zie de lijst met qPCR-primers in tabel 3. Een kaart van de primerbindingsplaatsen is weergegeven in figuur S1. Voor aanvullende sequentiebestanden voor de relevante genomische kenmerken en amplicons, raadpleegt u de A plasmid Editor (ApE) -bestanden; Aanvullende reeksbestanden 1-5.
      1. Genomisch DNA bij ARG4: Gebruik olWDH1760/olWDH1761 om dsDNA op ARG4 te versterken. Gebruik deze reactie als een belastingscontrole en normaliseer alle andere reacties behalve de DLC-signaalreactie op deze controle.
      2. Intramoleculaire ligatie-efficiëntie bij DAP2: Gebruik het 1.904 bp-fragment gecreëerd door EcoRI-vertering voor intramoleculaire ligatie parallel aan de DLC-ligatie. Versterking over deze ligatie junction rapporteert over de intramoleculaire ligatie-efficiëntie en dient als een controle waarnaar het DLC-signaal wordt genormaliseerd.
      3. DSB-inductie: gebruik olWDH1766/olWDH1767 om een gebied te versterken dat de geïnduceerde DSB overspant.
      4. Psoralen crosslinking en resectie: Gebruik olWDH2019/olWDH2020 om het unieke PhiX-gebied stroomafwaarts van de EcoRI-herkenningssite te versterken. Gebruik zonder crosslink reversal de verhouding van de ssDNA (geen crosslinking) over ARG4 (crosslinked dsDNA) om de crosslinking efficiëntie te bepalen. Bij crosslink-omkering zal resectie leiden tot een progressieve afname van 1 tot 0,5 van het signaal ten opzichte van ARG4.
      5. EcoR I herkenningsplaatsherstel en -snijden: Gebruik olWDH1768/olWDH1764 om een gebied te versterken dat de gerestaureerde EcoRI-herkenningssite stroomopwaarts van de DSB op de gereseceerde streng omspant. olWDH1769/olWDH1763 versterken een gebied dat de EcoRI-restrictie-enzymlocatie bij DAP2 omspant. Voer EcoRI-splitsing uit op deze locatie om te gebruiken als intramoleculaire ligatiecontrole.
    2. DLC-signaal: Gebruik olWDH1764/olWDH1765 om het chimere DNA-molecuul te versterken dat is ontstaan door intramoleculaire ligatie van de gereseceerde (binnendringende) streng en de donor.
    3. Analyse: Bereken de gemiddelde en standaarddeviatie van de Cp-waarden voor elk van de dubbele reacties. Gebruik de ARG4 genomische DNA qPCR Cp-waarden als referentie om alle andere controle-qPCRs te normaliseren. Normaliseer het DLC-signaal naar de intramoleculaire ligatiecontrole bij DAP2. Zie figuur 3 voor typische DLC-signaalwaarden bij 2 uur.
  4. DLE-test
    1. Besturingselementen: Zie de lijst met qPCR-primers in tabel 3. Een kaart van de primerbindingsplaatsen is weergegeven in figuur S1. Voor aanvullende sequentiebestanden voor de relevante genomische kenmerken en ampliconen, raadpleegt u de A plasmid Editor (ApE) -bestanden (Supplementary Sequence Files 1-5).
      1. Genomisch DNA bij ARG4: Zie rubriek 6.3.1.1.
      2. Intramoleculaire ligatie-efficiëntie bij YLR050C: Gebruik de Hind III-verteringom een fragment van 765 bp te creëren dat intramoleculaire ligatie parallel aan de DLE-ligatie zal ondergaan. Versterking over deze ligatie junction rapporteert over de intramoleculaire ligatie-efficiëntie en dient als een controle waarnaar het DLE-signaal wordt genormaliseerd.
      3. DSB-inductie: Zie punt 6.3.1.3.
      4. Hinde III-herstel en -snijden van de herkenningsplaats: gebruik olWDH2010 /olWDH2012 en olWDH2009/2011 om een gebied te versterken dat de Hind III-restrictie-enzymsites overspant op de gebroken streng waar het respectievelijk is gereseceerd en uitgebreid.
    2. DLE-signaal: Gebruik olWDH2009/olWDH2010 om het chimere DNA-molecuul te versterken dat is ontstaan door intramoleculaire ligatie van het gereseceerde uiteinde van de binnendringende streng stroomopwaarts van de DSB naar het nieuw verlengde uiteinde stroomafwaarts van de DSB.
    3. Analyse: Bereken de gemiddelde en standaarddeviatie van de Cp-waarden voor elk van de dubbele reacties. Gebruik de ARG4 genomische DNA qPCR Cp-waarden als referentie om alle andere controle-qPCRs te normaliseren. Normaliseer het DLE-signaal naar de intramoleculaire ligatiecontrole bij YLR050C. Typische DLE-signaalwaarden na 6 uur worden gerapporteerd in figuur 4 en eerdere publicaties9.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

DLC-test
De DLC-test detecteert zowel ontluikende als uitgebreide D-loops gevormd door de invasie van een site-specifieke DSB in een enkele donor (figuur 2). Psoralen crosslinking verbindt fysiek de gebroken streng en de donor via het heteroduplex DNA binnen de D-lus. Herstel van de restrictie-enzymplaats met een lang, hybridiserend oligo op de gereseceerde streng van de breuk maakt restrictie-enzymsplitsing mogelijk, gevolgd door ligatie van de gebroken streng n...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De gepresenteerde assays maken de detectie mogelijk van ontluikende en uitgebreide D-loops (DLC assay), D-loop extension (DLE assay) en BIR productvorming (DLE assay zonder hybridiserende oligonucleotiden) met behulp van proximity ligatie en qPCR. ChIP-qPCR van Rad51 naar locaties ver van de DSB is eerder gebruikt als een proxy voor Rad51-gemedieerde homologie zoeken en D-loop vorming. Dit ChIP-qPCR-signaal is echter onafhankelijk van de sequentie homologie tussen de breukplaats en een potentiële donor, evenals de Rad51-...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Het werk in het Heyer laboratorium wordt ondersteund door subsidies GM58015 en GM137751 aan W.-D.H. Onderzoek in het Piazza laboratorium wordt ondersteund door de European Research Council (ERC-StG 3D-loop, grand agreement 851006). D.R. wordt ondersteund door T32CA108459 en de A.P. Giannini Foundation. We bedanken Shih-Hsun Hung (Heyer Lab) voor het delen van zijn DLC / DLE-testresultaten en voor het aanvullend valideren van de wijzigingen in de assays die in dit protocol worden beschreven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1. Pre-growth, DSB-inductie en monsterverzameling
Apparatuur
15 en 50 mL conische buizen
15 mL glazen kweekbuizen
250 mL, 500 mL of 1 L kolven
60 mm x 15 mm optisch heldere petrischalen met platte bodemAanbevolen: Corning, Catalogusnummer 430166; of Genesee Scientific, Catalogusnummer 32-150G
Centrifuge op tafel met 15 en 50 mL conische buisadapters
Orbitaal schudden op tafel of buisrotator/revolver
Rotator
UV-crosslinker of lichtbox met 365 nm UV-lampen bovenop een orbitaal shakerAanbevolen: Spectrolinker XL-1500 UV Crosslinker (Spectronics Corporation) of Vilbert Lourmat BLX-365 BIO-LINK, Catalogusnummer 611110831
Materialen
60% w/w natrium DL-lactaat siroopSigma-AldrichL1375Voor mediabereiding
AgarFisherBP1423500Voor mediabereiding
Bacto peptonBD Difco211840Voor mediabereiding
Bacto gistextractBD Difco212750Voor mediabereiding
D-(+)-glucoseBD Difco0155-17-4Voor mediabereiding
TrioxsalenSigma-AldrichT6137Voor psoralen cross-linking
2. Sferoplastering, lysering en herstel van restrictie-enzymplaatsen
Benodigdheden
1,5 mL microcentrifugebuizen
Droogbad
Vloeibare stikstof of droog ijs/ethanol
Gekoelde microcentrifuge of microcentrifuge
Materialen
10X restrictie-enzym (CutSmart) buffer (500 mM kaliumacetaat, 200 mM Tris-acetaat, 100 mM magnesiumacetaat, 1 mg/mL BSA, pH 7,8-8,0)
Zymolyase 100TUS BiologicalZ1004Voor sfeeroplastering
3. restrictie-enzymdigest en intramoleculaire ligatie
Benodigdheden
Waterbad
Materialen
EcoRI-HFNew England BiolabsR3101Restrictie-enzymdigest voor DLC-assay
HindIII-HFNew England BiolabsR3104Restrictie-enzymdigest voor DLE-assay
T4 DNA ligaseNew England BiolabsM0202Intramoleculaire ligatie
4. DNA-zuivering
Benodigdheden
1,5 en 2 mL microcentrifugebuizen
Materialen
Fenoel/chloroform/isoamylalcohol (P/C/IA) in 25:24:1Sigma-AldrichP2069DNA-zuivering
5. Psoralene cross-link omkering
Benodigdheden
Thermocycler/PCR-machine
6. qPCR
Benodigdheden
Lightcycler 480Roche5015278001qPCR-machine gebruikt door de auteurs
Lightcycler 96Roche5815916001qPCR-machine gebruikt door de auteurs
Materialen
LightCycler 480 96-Well Plate, witRoche472969200196-wells platen voor qPCR
SsoAdvanced Universal SYBR Green Super MixBioRad1725271qPCR-kit gebruikt door de auteurs
SYBR Green I Master MixRoche4707516001qPCR-kit gebruikt door de auteurs

Referenties

  1. Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual Review of Genetics. 45 (1), 247-271 (2011).
  2. Heyer, W. -D. Regulation of recombination and genomic maintenance. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), 016501(2015).
  3. Mimitou, E. P., Symington, L. S. Sae2, Exo1 and Sgs1 collaborate in DNA double-strand break processing. Nature. 455 (7214), 770-774 (2008).
  4. Bzymek, M., Thayer, N. H., Oh, S. D., Kleckner, N., Hunter, N. Double Holliday junctions are intermediates of DNA break repair. Nature. 464 (7290), 937-941 (2010).
  5. Chen, H., Lisby, M., Symington, L. S. RPA coordinates DNA end resection and prevents formation of DNA hairpins. Molecular Cell. 50 (4), 589-600 (2013).
  6. Mazón, G., Symington, L. S. Mph1 and Mus81-Mms4 prevent aberrant processing of mitotic recombination intermediates. Molecular Cell. 52 (1), 63-74 (2013).
  7. Saini, N., et al. Migrating bubble during break-induced replication drives conservative DNA synthesis. Nature. 502 (7471), 389-392 (2013).
  8. Piazza, A., et al. Dynamic processing of displacement loops during recombinational DNA repair. Molecular Cell. 73 (6), 1255-1266 (2019).
  9. Piazza, A., Koszul, R., Heyer, W. -D. A proximity ligation-based method for quantitative measurement of D-loop extension in S. cerevisiae. Methods in Enzymology. 601, 27-44 (2018).
  10. Sugawara, N., Wang, X., Haber, J. E. In vivo roles of Rad52, Rad54, and Rad55 proteins in Rad51-mediated recombination. Molecular Cell. 12 (1), 209-219 (2003).
  11. Renkawitz, J., Lademann, C. A., Kalocsay, M., Jentsch, S. Monitoring homology search during DNA double-strand break repair in vivo. Molecular Cell. 50 (2), 261-272 (2013).
  12. Petukhova, G., Stratton, S., Sung, P. Catalysis of homologous DNA pairing by yeast Rad51 and Rad54 proteins. Nature. 393 (6680), 91-94 (1998).
  13. Wright, W. D., Heyer, W. -D. Rad54 functions as a heteroduplex DNA pump modulated by its DNA substrates and Rad51 during D-loop formation. Molecular Cell. 53 (3), 420-432 (2014).
  14. Tavares, E. M., Wright, W. D., Heyer, W. -D., Cam, E. L., Dupaigne, P. In vitro role of Rad54 in Rad51-ssDNA filament-dependent homology search and synaptic complexes formation. Nature Communications. 10 (1), 4058(2019).
  15. Crickard, J. B., Moevus, C. J., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. Rad54 drives ATP hydrolysis-dependent DNA sequence alignment during homologous recombination. Cell. 181 (6), 1380-1394 (2020).
  16. Lydeard, J. R., Jain, S., Yamaguchi, M., Haber, J. E. Break-induced replication and telomerase-independent telomere maintenance require Pol32. Nature. 448 (7155), 820-823 (2007).
  17. Jain, S., et al. A recombination execution checkpoint regulates the choice of homologous recombination pathway during DNA double-strand break repair. Genes & Development. 23 (3), 291-303 (2009).
  18. Donnianni, R. A., Symington, L. S. Break-induced replication occurs by conservative DNA synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13475-13480 (2013).
  19. Liu, L., et al. Tracking break-induced replication shows that it stalls at roadblocks. Nature. 590 (7847), 655-659 (2021).
  20. Liu, L., Sugawara, N., Malkova, A., Haber, J. E. Determining the kinetics of break-induced replication (BIR) by the assay for monitoring BIR elongation rate (AMBER). Methods in Enzymology. 661, 139-154 (2021).
  21. Pham, N., et al. Mechanisms restraining break-induced replication at two-ended DNA double-strand breaks. The EMBO Journal. 40 (10), 104847(2021).
  22. Cimino, G. D., Gamper, H. B., Isaacs, S. T., Hearst, J. E. Psoralens as photoactive probes of nucleic acid structure and function: Organic chemistry, photochemistry, and biochemistry. Annual Review of Biochemistry. 54 (1), 1151-1193 (1985).
  23. Yeung, A. T., Dinehart, W. J., Jones, B. K. Alkali reversal of psoralen cross-link for the targeted delivery of psoralen monoadduct lesion. Biochemistry. 27 (17), 6332-6338 (1988).
  24. Shi, Y. B., Spielmann, H. P., Hearst, J. E. Base-catalyzed reversal of a psoralen-DNA cross-link. Biochemistry. 27 (14), 5174-5178 (1988).
  25. Prakash, R., et al. Yeast Mph1 helicase dissociates Rad51-made D-loops: Implications for crossover control in mitotic recombination. Genes & Development. 23 (1), 67-79 (2009).
  26. Liu, J., et al. Srs2 promotes synthesis-dependent strand annealing by disrupting DNA polymerase δ-extending D-loops. eLife. 6, 22195(2017).
  27. Fasching, C. L., Cejka, P., Kowalczykowski, S. C., Heyer, W. -D. Top3-Rmi1 dissolve Rad51-mediated D loops by a topoisomerase-based mechanism. Molecular Cell. 57 (4), 595-606 (2015).
  28. Shah, S. S., Hartono, S. R., Chédin, F., Heyer, W. -D. Bisulfite treatment and single-molecule real-time sequencing reveal D-loop length, position, and distribution. eLife. 9, 59111(2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

D loop vormingdubbelstrengs DNA breukD loop extensiebreuk ge nduceerde replicatiechromatine immunoprecipitatieSouthern blotting
Detectie van homologe recombinatietussenproducten via nabijheidsligatie en kwantitatieve PCR in saccharomyces cerevisiae
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.