Het visualiseren van de conformatiedynamiek van membraanreceptoren met behulp van single-molecule FRET

Summary

Deze studie presenteert een gedetailleerde procedure voor het uitvoeren van single-molecule fluorescentie resonantie energie transfer (smFRET) experimenten op G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR's) met behulp van site-specifieke etikettering via onnatuurlijke aminozuur (OCG) incorporatie. Het protocol biedt een stapsgewijze handleiding voor smFRET-monstervoorbereiding, experimenten en gegevensanalyse.

Abstract

Het vermogen van cellen om te reageren op externe signalen is essentieel voor cellulaire ontwikkeling, groei en overleving. Om te reageren op een signaal uit de omgeving moet een cel het kunnen herkennen en verwerken. Deze taak is voornamelijk afhankelijk van de functie van membraanreceptoren, waarvan de rol is om signalen om te zetten in de biochemische taal van de cel. G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR's) vormen de grootste familie van membraanreceptorgeiwitten bij de mens. Onder GPCR's zijn metabotrope glutamaatreceptoren (mGluRs) een unieke subklasse die functioneren als obligate dimeren en een groot extracellulair domein bezitten dat de ligandbindingsplaats bevat. Recente ontwikkelingen in structurele studies van mGluRs hebben het begrip van hun activeringsproces verbeterd. De verspreiding van grootschalige conformatieveranderingen door mGluRs tijdens activering en modulatie is echter slecht begrepen. Single-molecule fluorescentie resonantie energieoverdracht (smFRET) is een krachtige techniek om de structurele dynamiek van biomoleculen op het niveau van één eiwit te visualiseren en te kwantificeren. Om het dynamische proces van mGluR2-activering te visualiseren, werden fluorescerende conformatiesensoren op basis van onnatuurlijke aminozuur (OCG) -opname ontwikkeld die sitespecifieke eiwitetikettering mogelijk maakten zonder verstoring van de oorspronkelijke structuur van receptoren. Het hier beschreven protocol legt uit hoe deze experimenten moeten worden uitgevoerd, inclusief de nieuwe UAA-etiketteringsbenadering, monstervoorbereiding en smFRET-gegevensverzameling en -analyse. Deze strategieën zijn generaliseerbaar en kunnen worden uitgebreid om de conformatiedynamiek van een verscheidenheid aan membraaneiwitten te onderzoeken.

Introduction

De overdracht van informatie over het plasmamembraan is sterk afhankelijk van de functie van membraanreceptoren¹. Ligandbinding aan een receptor leidt tot een conformatieverandering en receptoractivering. Dit proces is vaak allosterisch van aard². Met meer dan 800 leden zijn G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR's) de grootste familie van membraanreceptoren bij mensen³. Vanwege hun rol in bijna alle cellulaire processen zijn GPCR's belangrijke doelen geworden voor therapeutische ontwikkeling. In het canonieke model van GPCR-signalering resulteert agonistactivering in conformatieveranderingen van de receptor die vervolgens het heterotrimeer G-eiwitcomplex activeren via uitwisseling van GDP voor GTP in de nucleotidebindingszak van G_α. De geactiveerde_G-α-GTP en G_βγ subeenheden regelen vervolgens de activiteit van downstream effectoreiwitten en verspreiden de signaalcascade ^4,5. Dit signaleringsproces hangt in wezen af van het vermogen van liganden om de driedimensionale vorm van de receptor te veranderen. Een mechanistisch begrip van hoe liganden dit bereiken, is van cruciaal belang voor het ontwikkelen van nieuwe therapieën en het ontwerpen van synthetische receptoren en sensoren.

Metabotrope glutamaatreceptoren (mGluRs) zijn leden van de klasse C GPCR-familie en zijn belangrijk voor de langzame neuromodulerende effecten van glutamaat en het afstemmen van neuronale prikkelbaarheid ^6,7. Van alle GPCR's zijn klasse C GPCR's structureel uniek omdat ze functioneren als obligate dimeren. mGluRs bevatten drie structurele domeinen: het Venus flytrap (VFT) domein, cysteïne-rijk domein (CRD) en transmembraandomein (TMD)⁸. De conformatieveranderingen tijdens het activeringsproces zijn complex en omvatten lokale en globale conformatiekoppelingen die zich over een afstand van 12 nm voortplanten, evenals dimer cooperativiteit. De tussenliggende conformaties, temporele ordening van toestanden en de snelheid van overgang tussen toestanden zijn onbekend. Door de conformatie van individuele receptoren in realtime te volgen, is het mogelijk om de voorbijgaande tussentoestanden en de volgorde van conformatieveranderingen tijdens activering te identificeren. Dit kan worden bereikt door het toepassen van single-molecule fluorescentieresonantie-energieoverdracht ^9,10 (smFRET), zoals onlangs werd toegepast om de voortplanting van conformatieveranderingen tijdens de activering van mGluR2¹¹ te visualiseren. Een belangrijke stap in FRET-experimenten is het genereren van FRET-sensoren door locatiespecifieke inbrenging van de donor- en acceptorfluorforen in het eiwit van belang. Een onnatuurlijke aminozuur (OCG) opnamestrategie werd aangenomen 12,13,14,15 om de beperkingen van typische site-specifieke fluorescerende etiketteringstechnologieën te overwinnen die de creatie van cysteïne-loze mutanten of het invoegen van een grote genetisch gecodeerde tag vereisen. Hierdoor kon de conformatieherschikking van de essentiële compacte allosterische linker, die zich bij de ligandbindende en signaleringsdomeinen van mGluR2 voegde, worden waargenomen. In dit protocol wordt een stapsgewijze handleiding gepresenteerd voor het uitvoeren van smFRET-experimenten op mGluR2, inclusief de aanpak voor locatiespecifieke etikettering van mGluR2 met OCG om fluoroforen te bevestigen met behulp van de kopergekatalyseerde azidecyclisatiereactie. Bovendien beschrijft dit protocol de methodologie voor het direct vastleggen van membraaneiwitten en data-analyse. Het hier geschetste protocol is ook van toepassing op het bestuderen van de conformatiedynamiek van andere membraaneiwitten.

Protocol

De algemene workflow van het protocol wordt beschreven in figuur 1.

1. Voorbereiding van de monsterkamer

1. Glij- en afdekplaatreiniging
   OPMERKING: Deze stappen zijn gericht op het reinigen van de oppervlakken van de dia's en de coverslips en deze voor te bereiden op aminosilanisatie. Een kritische vereiste voor het uitvoeren van fluorescentie-experimenten met één molecuul op aan het oppervlak gebonden moleculen is een gepassiveerd oppervlak. De meest betrouwbare en reproduceerbare passiveringstechniek omvat het covalent bevestigen van inerte polymeerketens aan het glasoppervlak als een dichte laag. Polyethyleenglycol (PEG) is het meest efficiënte polymeer dat wordt gebruikt voor oppervlaktepassivering¹⁶. De details van de passiveringsprocedure met PEG (PEGylation) worden hieronder beschreven:
   1. Markeer gaten die op de dia's moeten worden geboord met een marker (~ 6 mm uit elkaar en weg van de rand). Gebruik een Dremel om kleine gaatjes (1 mm diameter) op de glasplaat te boren. Dompel de glijbanen onder in water tijdens het boorproces.
   2. Was de dia's met aceton om resterende inkt van de marker te verwijderen.
   3. Haal uit aceton en spoel de dia's af met water en zet ze vervolgens 5 minuten in de magnetron in water op hoog vermogen (700 W).
   4. Reinig de dia's met water voordat u ze in een glazen pot plaatst om te worden gesoniseerd. Plaats de coverslips in een andere beitspot.
   5. Soniceer de dia's en coverslips in aceton gedurende 30 minuten in een bad sonicator bij 23 °C.
   6. Reinig ondertussen een glazen kolf voor het bereiden van de aminosilanisatie-oplossing die tijdens de volgende stap wordt gebruikt. Vul de kolf met 1 M KOH, soniceer de kolf gedurende 30 minuten, spoel de KOH grondig uit met water en soniceer vervolgens nog eens 30 minuten in methanol. Laat de kolf in methanol tot het moment van de aminosinlanisatiestap.
   7. Verwijder ondertussen de aminosilaan, mPEG en biotine-PEG uit de vriezer (−20 °C) en laat ze in het donker op kamertemperatuur komen (RT).
   8. Gooi aceton uit de glijbaan en dekpotten in de juiste chemische afvalcontainer, spoel grondig met water en soniceer de dia's vervolgens in 5 M KOH gedurende 30 minuten.
   9. Spoel de dia's en coverslips af met water en soniceer vervolgens gedurende 2 minuten in methanol (herhaal tweemaal). Laat de potten gevuld met methanol tot de aminosilanisatiestap.
      OPMERKING: In deze studie wordt gedeïoniseerd water gebruikt, tenzij anders vermeld. Er wordt een badsonator gebruikt die werkt bij 23 °C.
2. Aminosilanisatie
   OPMERKING: Deze stap is bedoeld om aminosilaan covalent te koppelen aan het schone glij- en afdekvlakoppervlak. Gefunctionaliseerde mPEG en biotine-PEG zullen in de volgende stap covalent aan dit oppervlak binden.
   1. Bereid een aminosilanisatiemengsel in een schone kolf (stap 1.6). Bereid de oplossing door methanol (150 ml), azijnzuur (7,5 ml, gebruik een glazen pipet) en aminosilaan (2,5 ml) te mengen.
   2. Meng de oplossing voorzichtig in de chemische zuurkast en giet deze vervolgens in de schuif en dekselpotten. Gebruik 50 ml voor de coverslips en 100 ml voor de dia's. Zorg ervoor dat dia's en coverslips volledig in de oplossing worden ondergedompeld.
   3. Incubeer gedurende 10 minuten, soniceer de potten gedurende 1 minuut (ultrasoonapparaat verwijdert de onzuiverheden van het oppervlak) en incubeer nog eens 10 minuten.
   4. Gooi de aminosilanisatieoplossing weg in de afvalcontainer. Voeg methanol toe aan de potten, sluit de potten met deksels en schud voorzichtig met de hand. Gooi de methanol weg en vul potten met water.
   5. Breng de aminosilaanfles terug naar de vriezer (−20 °C).
3. PEGylation
   OPMERKING: Deze stappen beschrijven de PEGylation-procedure.
   1. Bereid tijdens aminosilanisatie de pegyleringsbuffer voor. Weeg 84 mg natriumbicarbonaat (NaHCO₃) en voeg dit toe aan 10 ml water (10 mM). Weeg bovendien mPEG en biotine-PEG en zet ze opzij. Gebruik voor zes dia's en coverslips 96 mg mPEG en 1,2-2,4 mg biotine-PEG.
      OPMERKING: Het is belangrijk om niet te veel biotine-PEG toe te voegen, omdat dit het aantal achtergrondvlekken kan verhogen. Los het PEG-mengsel niet op tot vlak voordat u het op dia's aanbrengt.
   2. Spoel de dia's af met water, droog ze met een zachte luchtslag en plaats ze vervolgens in de bevochtigde montagedozen.
      OPMERKING: Het is essentieel om een schone luchtvaartmaatschappij te gebruiken. Vermijd het gebruik van perslucht in blik, die resten op het glas kan achterlaten.
   3. Voeg pegylatiebuffer toe aan het PEG-poedermengsel en pipetteer meerdere keren voorzichtig op en neer om op te lossen. Voeg 55 μL pegylatiebuffer per dia toe (voeg voor zes dia's 330 μL pegylatiebuffer toe).
   4. Centrifugeer bij 9.600 x g gedurende 1 minuut bij 23 °C om onopgeloste deeltjes neer te slaan. Verzamel het supernatant om te gebruiken in de volgende stap.
      OPMERKING: Biotine-PEG hydrolyseert snel door de aanwezigheid van de NHS-groep. Het is belangrijk om de meng- en centrifugatiestappen snel uit te voeren.
   5. Breng 60 μL PEGylation-oplossing aan op elke dia en plaats vervolgens de coverslip erop zodat de PEGylation-oplossing tussen de dia en de coverslip wordt ingeklemd.
      OPMERKING: Vermijd het introduceren van bellen tussen de dia en de coverslip, omdat dit de passiveringsefficiëntie zal verminderen. Verwijder eventuele bubbels door de coverslip en de dia aan te passen met een pipetpunt.
   6. Plaats de dia's in een lade die plat en donker is. Dia's kunnen 's nachts worden opgeslagen; incubatie gedurende 4-6 uur resulteert echter in optimale passivering.
      OPMERKING: Het is essentieel om te onthouden welke kant gepegyleerd is.
   7. Markeer de niet-gepegyleerde zijde voordat u deze bewaart. Demonteer na incubatie voorzichtig en spoel de dia's en coverslips grondig af met water
   8. Droog de dia's en coverslips door lucht te blazen. Bewaar de dia's en deklips in een steriele buis (50 ml), met het PEGylated oppervlak van elkaar af gericht. Bewaren bij −20 °C tot de dag van het experiment.
      OPMERKING: Het is het beste om dia's en coverslips binnen 4 weken na voorbereiding te gebruiken. De PEGylated oppervlakken moeten van elkaar af staan. Het opslaan van de PEGylated slides en coverslips in vacuüm verzegelde zakken kan de houdbaarheid verlengen.

2. mGluR2-expressie met ingebouwd onnatuurlijk aminozuur, fluorescerende etikettering en extractie

OPMERKING: Dit protocol schetst de bereiding, reagentia en behandeling van cellen voor het tot expressie brengen van mGluR2 dat de UAA 4-azido-L-fenylalanine (AZP) bevat. De procedure is voor HEK293T-cellen gekweekt op 18 mm glazen afdekplaten. De procedure kan indien nodig worden opgeschaald.

1. Zaaien
   OPMERKING: Onderhoud de HEK293T-cellen in DMEM aangevuld met 10% (v/v) foetaal runderserum, 100 eenheid·ml⁻¹ penicilline-streptomycine en 15 mM HEPES-buffer (aanvullend bestand 1) (pH 7,4) bij 37 °C onder 5% CO₂.
   1. Passeer de cellen met 0,05% trypsine-EDTA. Zaad HEK293T cellen op poly-L/D-lysine (PLL/PDL) glazen coverslips zodat ze ≥80% confluency bereiken tijdens de tijd van transfectie.
2. Transfectie
   1. Bereid een 40 mM stockoplossing van AZP in 0,1 M NaOH.
   2. Bereid AZP-aangevulde media voor groeicellen en mGluR2-expressie. Vul standaardmedia (+ FBS, pen/strep, 15 mM HEPES) aan met behulp van 40 mM AZP stockoplossing. Breng de uiteindelijke AZP-concentratie op 0,6 mM. Voeg 1 M HEPES-oplossing toe (de helft van het volume van 40 mM AZP-voorraadoplossing toegevoegd). Om bijvoorbeeld 10 ml azp-aangevulde media te bereiden, combineert u 9,775 ml standaardmedia, 150 μl 40 mM AZP-stamoplossing en 75 μl 1 M HEPES-oplossing.
   3. Filtreer (steriliseer) de media met behulp van een spuitfilter (0,2 μm, PES).
   4. Vervang de standaardmedia door media die AZP-aangevulde media bevatten voorafgaand aan transfectie.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat u de cellen niet droogt tijdens het vervangen van de media.
   5. Transfecteer de cellen met transfectiereagens (materiaaltabel) volgens de handleiding van de fabrikant. Transfecte HEK293T cellen op een 18 mm coverslip met in totaal 2 μg DNA (1000 ng tRNA/synthetase + 1000 ng amber codon-bevattend eiwitplasmide). Zie tabel 1 voor de concentratie en het volume van de gebruikte componenten.
   6. Verander de media 24 uur na transfectie in verse AZP-aangevulde media en laat de cellen nog eens 24 uur groeien.
3. Etikettering met alkyncyaankleurstoffen
   1. Was de coverslips 20 min voor het etiketteren tweemaal met warme (37 °C) opnamebuffer (RB) (aanvullend bestand 1) en verplaats ze naar warme (37 °C) standaardmedia zonder AZP (+ FBS, Pen/Strep, 15 mM HEPES).
   2. Bereid de etiketteringsoplossing die Cy3-alkyn, Cy5-alkyn, BTTES, koper (II) sulfaat (CuSO4), (+) natrium L-ascorbaat en aminoguanidine bevat.
   3. Volg de volgorde van het maken en toevoegen van oplossingen (tabel 2):
      1. Bereid 50 mM BTTES voor.
      2. Bereid 100 mM aminoguanidine.
      3. Bereid 100 mM Na-ascorbaat.
      4. Bereid 655,5 μL RB.
      5. Voeg Cy3/Cy5 alkynkleurstof (10 mM in DMSO-voorraad) toe aan de RB.
         OPMERKING: Voeg aminoguanidine toe aan de RB.
      6. Bereid 20 mM CuSO_{4 voor.}
      7. Meng CuSO4 en BTTES in een nieuwe buis (de oplossing wordt blauw).
      8. Voeg het CuSO4- en BTTES-mengsel toe aan RB (2.3.3.6).
      9. Voeg de Na-Ascorbate toe.
      10. Volg het volume in tabel 2 hieronder voor een afdekplaat van 18 mm.
   4. Meng de oplossing grondig en incubeer op ijs en in het donker gedurende 10 minuten voordat de cellen worden geëtiketteerd.
   5. Voordat u de etiketteeroplossing aan de coverslips toevoegt, verwijdert u de media en wast u ze met RB. Voeg de etiketteringsoplossing toe en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C in donkere omstandigheden.
   6. OPMERKING: Om de etikettering te verbeteren, voegt u glutamaat (eindconcentratie ~ 0,5 mM) toe na 10 minuten en incubeert u nog eens 5 minuten. Koper is zeer giftig voor de cellen en de etiketteringsreactie mag niet langer dan 15 minuten in vivo aanhouden. Bereid alle componenten vers voor. Voeg Na-Ascorbate als laatste toe. Houd de reactie tijdens de bereiding op 4°C. Na toevoeging van een etiketteringsoplossing moeten de cellen echter bij 37 °C in de incubator worden bewaard.
4. Het oogsten van de cellen en het extraheren van de eiwitten (cellyse)
   1. Verwijder de etiketteeroplossing en was de coverslip (18 mm) met de mGluR2 getransfecteerde cellen tweemaal met de RB.
   2. Was met behulp van een pipet de cellen van de coverslip en resuspendeer in RB (1 ml).
      OPMERKING: Minimaliseer de blootstelling van het monster aan licht zoveel mogelijk na dit punt.
   3. Pellet de cellen door gedurende 5 minuten te draaien bij 1.000 x g bij 4 °C en verwijder het supernatant. Resuspendeer de celpellet in 80-130 μL van de lysisoplossing.
      OPMERKING: De celpellet moet zichtbaar zijn met het oog. Het lysisvolume is afhankelijk van de hoeveelheid monster die verloren gaat tijdens het etiketteer- en wasproces.
   4. Meng voorzichtig door te pipetteren om de pellet te breken. Wikkel in folie en plaats op de rocker bij 4 °C gedurende 0,5-1 uur om de cellen te lyseren.
   5. Pelleteer de onoplosbare fractie door centrifugering bij 20.000 x g en 4 °C gedurende 20 min. Breng het supernatant over in een verse koude buis (het gelyseerde eiwit dat het fluorescerend gelabelde eiwit van belang bevat) en bewaar het op ijs voor experimenten.

3. Assemblage en functionalisatie van de stromingskamer met één molecuul

1. Haal de schuif en de coverslip uit de vriezer en laat ze op RT opwarmen in het donker (~30 min).
2. Monteer de kamer met dubbelzijdige tape door stroken dubbelzijdige tape tussen de schuif en de coverslip te plaatsen. Zorg ervoor dat de PEGylated oppervlakken de binnenkant van de stroomkamer vormen.
3. Druk met behulp van een pipetpunt op de coverslip om ervoor te zorgen dat de tape volledig contact maakt met zowel coverslip als slide; zorg ervoor dat u de coverslip niet breekt. Breng epoxy aan op de randen van de dia's.
   LET OP: Voeg niet zoveel toe dat epoxy de geboorde gaten opvult.
4. Plaats de stromingskamer met de coverlipzijde naar beneden gericht in een bevochtigde donkere doos om de epoxy te laten drogen (~ 30 min).
   OPMERKING: Voeg T50-buffer (aanvullend bestand 1) toe door de geboorde gaten om te voorkomen dat de epoxy de gaten (10-15 μL) bedekt tijdens de droogperiode.
5. Incubeer elke kamerbaan met 500 nM Neutravidine (verdund in T50) door langzaam ~ 40 μL op elke baan aan te brengen.
6. Incubeer bij RT gedurende 2 minuten in een bevochtigde donkere doos. Wassen met ~100 μL T50 buffer per baan.
7. Incubeer elke kamerbaan met 20 nM gebiotinyleerd antilichaam¹¹. De keuze van het antilichaam hangt af van de tag op het eiwit.
   OPMERKING: Als het primaire antilichaam niet gebiotinyleerd is, incubeer dan eerst met het gebiotinyleerde secundaire antilichaam gedurende 30 minuten en incubeer vervolgens met het primaire antilichaam.
8. Incubeer bij RT gedurende 30 minuten in een bevochtigde donkere doos. Wassen met ~200 μL T50 per baan.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat de rijstroken nooit uitdrogen tijdens het voorbereidingsproces.

4. Buffers met één molecuul

1. Trolox buffer
   OPMERKING: Trolox buffer is de startbuffer voor het maken van imaging buffer. Componenten van de buffer zijn afhankelijk van het experiment en kunnen variëren afhankelijk van het eiwit van belang. De buffer die in het hier beschreven protocol wordt gebruikt, omvat zouten (NaCl, KCl, CaCl₂, MgCl₂), buffermiddel (HEPES) en Trolox (pH ~ 7,35).
   1. Los 9-10 mg Trolox op in 10 ml single-molecule opnamebuffer (SRB, aanvullend bestand 1)
      OPMERKING: Trolox maakt de buffer licht zuur. Pas de pH in dit stadium aan met natriumhydroxide (NaOH) oplossing, 10 M (pH 7,35). De fijne pH-aanpassing zal worden gemaakt nadat Trolox volledig is opgelost; het verhogen van de pH op dit punt verhoogt echter de oplosbaarheid van de Trolox.
   2. Meng de oplossing bij RT met behulp van een benchtop rocker gedurende 4-8 uur (gewikkeld in aluminiumfolie) om de Trolox volledig op te lossen.
   3. Controleer de pH en pas deze indien nodig aan.
   4. Zorg ervoor dat de Trolox volledig is opgelost. Steriliseer de oplossing met een spuitfilter en bewaar bij 4 °C.
      OPMERKING: De buffer moet worden gebruikt na 2-10 dagen veroudering. Trolox helpt het knipperen te onderdrukken en wordt vaak gebruikt in studies met één molecuul¹⁷. De anti-knipperende eigenschappen zijn afkomstig van een geoxideerd derivaat van Trolox¹⁸; daarom wordt aanbevolen om het minstens een paar uur op RT te houden om te rijpen. Bovendien versnelt UV-straling van verse Trolox-oplossing het oxidatieproces en kan het worden gebruikt om de "veroudering" van Trolox-buffer¹⁸ te versnellen.
2. Recept voor beeldvormingsbuffer: Meng Trolox-buffer + wasmiddel (~ 2 keer de CMC-waarde van het wasmiddel) + 4 mM protocatechuïnezuur (PCA).
   OPMERKING: De wasmiddelconcentratie wordt in de buurt van CMC gehouden, omdat hoge wasmiddelconcentraties kunnen leiden tot verhoogde eiwitdenaturatie. Het volgende mengsel kan bijvoorbeeld worden gebruikt 955 μL Trolox + 5 μL 10% DDM + cholesterol (W%, 10:1) + 40 μL van 100 mM PCA-stamoplossing. Hier werkt PCA als een antioxidant en werd het eerder gebruikt in smFRET-studies¹⁹. DDM is niet-ionisch, wordt vaak gebruikt om membraaneiwitten^20,21 op te lossen en is gebruikt in studies met één molecuul. DDM is een goed eerste keus wasmiddel; We raden echter aan om meerdere wasmiddelen te testen en ervoor te zorgen dat de resultaten consistent zijn.

5. Microscoopopopstelling en smFRET-gegevensverzameling

1. Zet de computer en microscoop aan. Zet de lasers aan om op te warmen (532 nm voor Cy3 excitatie en 640 nm voor Cy5 excitatie).
   OPMERKING: Hier werd een omgekeerde microscoop gebruikt die was uitgerust met een 100x TIRF-objectief (N.A. 1.49), een beeldsplitter en een EMCCD-camera. De opstelling is uitgerust met een vierregelige laser combiner, een dichroïsche spiegel, een long pass emissiefilter, een emissie dichroïsch filter en een notch filter.
2. Schakel de EMCCD-camera in en open de camerasoftware. Wacht 20 minuten totdat de camera −69 °C bereikt en stabiliseert.
3. Monteer de monsterkamer op het microscoopstadium. Voeg het eiwitmonster geleidelijk toe om ~400 moleculen per gezichtsveld te bereiken (stap 2.4.5). Was de kamer met 100 μL van de beeldvormende buffer.
4. Pas de versterking, acquisitiesnelheid en laservermogens zodanig aan dat fluorescentiesignalen met één molecuul worden gedetecteerd in zowel het donor- als het acceptorkanaal. Pas indien nodig de concentratie van de eiwitten in de monsterkamer aan.
   OPMERKING: Met meer dan 400 moleculen in het gezichtsveld wordt het onderscheiden van individuele moleculen moeilijker en zal de achtergrondruis hoger zijn.
5. Prikkel de donor en verkrijg tijdsporen totdat ten minste 80% van de donormoleculen in het gezichtsveld fotobleached zijn.
6. Aan het einde van de film schakelt u de 640 nm-laser in om de acceptor direct te prikkelen totdat sommige acceptormoleculen fotobleken, waardoor single-molecule van multimeerdiscriminatie wordt vergemakkelijkt.
7. Ga naar een ander gezichtsveld en herhaal de bovenstaande stappen om ten minste drie films (technische replicaties) per voorwaarde te verzamelen.
   OPMERKING: Gebruik het laagst mogelijke laservermogen bij het selecteren van een nieuw interessegebied (ROI) en scherpstellen om fotobleaching te minimaliseren. Let op de stage drift tijdens de acquisitie. Als er een merkbare afwijking wordt waargenomen na het verplaatsen naar een nieuwe ROI, wacht dan 3 minuten voordat u begint met acquisitie.

6. Data-analyse

1. Zenderuitlijning donor- en acceptorkanaal (filmtoewijzing)
   1. Neem de fluorescerende kraalbeelden op in de donor- en acceptorkanalen.
   2. Genereer het kaartbestand met behulp van de kraalgegevens om de donor- en acceptorfluorescentie van elk molecuul^22,23 te correleren.
      OPMERKING: Het emissiesignaal van een enkel molecuul wordt gesplitst in donor- en acceptorsignalen door het emissiedichroïsche filter in de beeldsplitser. De beelden van donor en acceptant worden naast elkaar op de camera geprojecteerd. Om de donor- en acceptorintensiteiten van een enkel molecuul nauwkeurig te associëren tussen de twee gebieden, wordt vaak een mappingbestand gegenereerd met behulp van fluorescerende kraalmonsters. Met behulp van dit mappingbestand worden alle moleculen die in de donor- en acceptorkanalen worden gedetecteerd, op elkaar in kaart gebracht. De analyse genereert vervolgens de tijdsporen, die de donor- en acceptorintensiteiten in de loop van de tijd zijn, voor elk molecuul.
2. Selectie van fretsporen met één molecuul (deeltjespluk)
   OPMERKING: Individuele deeltjessporen worden onderzocht en geselecteerd voor downstream-analyse met behulp van MATLAB. De exacte selectiecriteria zijn afhankelijk van het systeem. Algemene richtlijnen over wat een kwaliteitsdeeltje is, worden hier beschreven. Alle aangepaste gewijzigde codes zijn beschikbaar op GitHub (https://github.com/vafabakhsh-lab).
   1. Selecteer de sporen waarbij de totale intensiteit van de sporen (donor + acceptor) stabiel is in de tijd. Selecteer de sporen met anticorrele veranderingen in donor- en acceptorintensiteiten.
   2. Selecteer de donor- en acceptormoleculen die eenstapsfotobleaching vertonen. Selecteer de sporen die >5 s lang zijn.
      OPMERKING: De achtergrond in elk kanaal na het bleken moet naar nul gaan. De sporen mogen niet veel knipperende gebeurtenissen hebben; dit zal de moeilijkheidsgraad van de analyse vergroten.
   3. Bereken de FRET-efficiëntie met behulp van de vergelijking E = (I_A− 0,088 × I_D)/(I_D + [I_A− 0,088 × I_D])24,25,26, waarbij I _D en I_A respectievelijk ruwe donor- en acceptorintensiteiten zijn.
      OPMERKING: De lekkage van donoremissie in het acceptorkanaal wordt bepaald met behulp van donor-only gelabeld monster geëxciteerd met behulp van een 532 nm laser²⁶. De lekcorrectiefactor, 0,088, kan verschillen voor verschillende opstellingen, afhankelijk van de gebruikte filtersets. Het is belangrijk op te merken dat kwantitatieve en robuuste omzetting van FRET-efficiënties naar absolute afstanden de correctie van donor- en acceptorintensiteiten voor meerdere factoren vereist en vóór²⁷ uitgebreid is besproken.
3. Identificeer de conformatiestatus door Hidden Markov Modeling (HMM)
   1. Voer het vbFRET^28-programma uit in MATLAB en importeer de geselecteerde traceringen voor een bepaalde voorwaarde. Stel de beperkingen in voor het aantal potentiële statussen en iteraties dat moet worden uitgevoerd.
      OPMERKING: Op basis van de ruwe gegevens van de representatieve resultaten werd verondersteld dat er maximaal vier discrete FRET-toestanden bezet waren door de conformatiesensor; zo werd een bereik van één tot vier staten aangewezen. Eerder werd vastgesteld dat verbeteringen in de montage verwaarloosbaar toenamen met >25 iteraties; zo werden 25 iteraties gebruikt voor het aanpassen van de representatieve gegevens.
   2. Analyseer de smFRET-sporen en exporteer de geïdealiseerde sporen en analysesessie. Sla de geïdealiseerde traceringen op in een aparte map voor downstream-analyse.
      OPMERKING: De programma's die worden gebruikt om toestandsovergangs- en verblijftijdgegevens uit geïdealiseerde sporen te extraheren, zijn beschikbaar gesteld in eerder gepubliceerd werk²⁹.
   3. Gebruik MATLAB-programma's om statusovergangen te extraheren en ze te plotten als een heatmap waarbij de X-coördinaat de beginconformatie aangeeft en de Y-coördinaat de eindconformatie aangeeft.
      OPMERKING: Overgangen worden gedefinieerd als wijzigingen in de FRET-waarde >0.1 in de representatieve resultaten die hier worden besproken. De drempel voor overgangen is afhankelijk van de hypothetische conformatietoestanden die een eiwit van belang inneemt (stel de overgangsdrempel in om kleiner te zijn dan het verschil tussen de dichtstbijzijnde FRET-toestanden), evenals de resolutie die is toegestaan door de experimentele opstelling. Het onderzoek van heatmaps voor meerdere omstandigheden maakt het mogelijk om de meest voorkomende conformatietoestanden te identificeren waar een sensor doorheen gaat en dus inneemt. Vier FRET-staten werden geïdentificeerd voor de representatieve resultaten (FRET = 0,31, 0,51, 0,71 en 0,89).
   4. Gebruik MATLAB-programma's om de verblijftijden voor elke geïdentificeerde conformatietoestand te extraheren. Wijs een reeks FRET-waarden aan die elke toestand en tijdresolutie tijdens gegevensverzameling afbakenen. FRET-bereiken zijn gelijkmatig verdeeld door aangrenzende FRET-toestanden. Exporteer de verblijftijden voor bepaalde behandelingsomstandigheden.
      OPMERKING: In de meeste gevallen kunnen verblijftijdgegevens goed worden geschat door een enkele exponentiële vervalfunctie. Deze analyse kan worden uitgevoerd in een data-analyse- en grafische software.
4. Gaussische aanpassing van smFRET-populatiehistogrammen om de staatsbezetting te kwantificeren
   1. Importeer fret-histogrammen voor interessante omstandigheden in de data-analyse- en grafieksoftware voor analyse van meerdere piekaanpassingen.
   2. Geef het aantal aanwezige pieken aan (vier pieken of toestanden op basis van HMM-analyse). Aanpassing werd uitgevoerd met behulp van meerdere Gaussische verdelingen³⁰ gedefinieerd als , waarbij A het piekgebied is, xc het piekcentrum en w de piekbreedte voor elke piek.
   3. Beperk de aanpassingsparameters als A > 0, xc = FRET ± 0,02 en 0,1 ≤w≤ 0,24. Vier FRET-pieken voor individuele populatie FRET-histogrammen waren tegelijkertijd fit. Pas de gedefinieerde beperkingen toe voor de fittingen van alle omstandigheden.
   4. Bereken de staat van bezetting (percentage) als het gebied van de piek van de rente gedeeld door de totale oppervlakte, gedefinieerd als de som van alle pieken.

Results

Expressie en fluorescerende etikettering van fret-sensor op basis van OCG
Hierin worden voorbeeldige resultaten van de insertie en fluorescerende etikettering van een OCG (AZP) binnen de CRD van mGluR2 (548UAA) besproken¹¹. Zoals eerder vermeld, is het noodzakelijk om AZP in mGluR2 in te brengen, co-expressie van de gemanipuleerde translationele machinerie, die een gemodificeerd tRNA-synthetase en complementair tRNA (pIRE4-Azi) en mGluR2 bevat met een amberkleurig codon op posi...

Discussion

GPCR's zijn eiwitten die op het celmembraan werken om signaaltransductie te initiëren. Veel GPCR's bestaan uit meerdere domeinen, waarbij signalering afhankelijk is van de coöperatieve interactie tussen de domeinen. Om de eigenschappen van deze membraanreceptoren te moduleren, is het essentieel om het dynamische gedrag van de meerdere domeinen te begrijpen. Single-molecule fluorescentie resonantie energieoverdracht (smFRET) is een fluorescentietechniek die het mogelijk maakt om eiwitconformatie en -dynamica in realtime t...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
(+)-Sodium L-Ascorbate	Sigma Aldrich	Cat # 11140-250G
4-azido-L-phenylalanine	Chem-Impex International	Cat # 06162
548UAA	Liauw et al. 2021		Transfected construct
Acetic Acid	Fisher Chemical	64-19-7
Acetone	Fisher Chemical	67-64-1
Adobe Illustrator (2022)	https://www.adobe.com/	RRID:SCR_010279	Software, algorithm
Aminoguanidine (hydrochloride)	Cayman Chemical	81530
Aminosilane	Aldrich	919-30-2
Bath Sonicator 2.8 L	Fisher Scientific		Ultrasonic Bath 2.8 L
Biotin-PEG	Laysan Bio Inc	Item# Biotin-PEG-SVA-5000-100mg
BTTES	Click Chemistry Tools	1237-500
Copper (II) sulfate	Sigma Aldrich	Cat # 451657-10G
Cover slip	VWR	16004-306	Sample chamber
Cy3 Alkyne	Click Chemistry Tools	TA117-5
Cy5 Alkyne	Click Chemistry Tools	TA116-5
DDM	Anatrace	Part# D310 1 GM	Detergent
DDM-CHS (10:1)	Anatrace	Part# D310-CH210 1 ML	Detergent with cholecterol
Defined Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	SH30070.03
Di01-R405/488/561/635	Semrock		Notch filter
DMEM	Corning	10-013-CV
EMCCD	Andor	DU-897U	Camera
ET542lp	Chroma		Long pass emission filter
FF640-FDi01	Semrock		Emission dichroic filter
FLAG-tag antibody	Genscript	A01429
Fluorescent bead	Invitrogen T7279	TetraSpeck microspheres	Spherical bead
Glass slides	Fisherfinest	12-544-4	sample chamber
Glutamate	Sigma Aldrich	Cat # 6106-04-3
HEK 293T	Sigma Aldrich	Cat # 12022001	Cell line
HEPES	FisherBioReagents	7365-45-9
Image splitter	OptoSplit II
KOH	Fluka	1310-58-3
Laser	Oxxius		4-line laser combiner
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	L3000015	Transfection Reagent
Methanol	Fisher Chemical	67-56-1
Microscope	Olympus	Olympus IX83
Milli-Q water	Barnstead		Water Deionizer
m-PEG	Laysan Bio Inc	Item# MPEG-SIL-5000-1g
NF03-405/488/532/635	Semrock		Dichroic mirror
OptiMEM	Thermo Fisher Scientific	51985091	Reduced Serum Medium
OptiMEM/Reduced serum medium	Thermo Fisher Scientific
OriginPro (2020b)	https://www.originlab.com/	RRID:SCR_014212	Data analysis and graphing software
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
pIRE4-Azi	Addgene	Plasmid # 105829	Transfected construct
Poly-L-lysine hydrobromide	Sigma Aldrich	Cat # P2636
Protocatechuic acid (PCA)	HWI group	99-50-3
smCamera (Version 1.0)	http://ha.med.jhmi.edu/resources/		Camera software
Sodium bicarbonate	FisherBioReagents	144-55-8
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma	1310-73-2
Syringe filter	Whatman UNIFLO	Cat#9914-2502	Liquid filtration
Trolox	Sigma	53188-07