Method Article

Het ontwikkelen en testen van gemethyleerde nano-gestructureerde dipeptiden die Src-kinase-activiteit in vitro remmen voor toepassingen tegen kanker

DOI:

10.3791/64256

⸱

November 30th, 2022

 ,  , 
1Biochemistry Department, College of Science, King Abdulaziz University, 2Independent Scholar, 3School of Health Sciences and Biomedical Engineering, Hebei University of Technology, 4School of Engineering, Saveetha University, 5Programa de Pós-graduação em Ciência e Engenharia dos Materiais, UFPI

In This Article

Retraction Notice

The article Developing and Testing Methylated Nano-Structured Dipeptides that Inhibit Src Kinase Activity In Vitro for Anti-Cancer Applications has been retracted by the journal due to authorship and reproducibility concerns.

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het ontwerpen en testen van dipeptiden die de activiteit van Src-kinase-enzymen kunnen remmen met behulp van acellulaire en cellulaire assays voor toepassingen tegen kanker. De hier geformuleerde peptiden (W-RCH3, WCH3-R CH3 en W-R(CH3)2) remden Src-kinase met IC50-waarden van respectievelijk 510 nM, 916 nM en 1 μM.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met het oog op de ontwikkeling van een nieuwe behandeling tegen kanker werden hier zeven dipeptiden ontworpen die gemethyleerd tryptofaan en/of gemethyleerd arginine bevatten en werden geproduceerd met behulp van Fmoc-peptidesynthese in de vaste fase. Overexpressie van het enzym Src-tyrosinekinase is betrokken bij de ontwikkeling van verschillende vormen van kanker. Van dipeptiden die onnatuurlijke aminozuren bevatten, zoals gemethyleerd arginine (RCH3), gedimethyleerd arginine (R(CH3)2) en/of gemethyleerd tryptofaan (WCH3) residuen, is eerder aangetoond dat ze Src-kinase remmen. In deze studie werden drie van dergelijke dipeptiden, W-RCH3, WCH3-R CH3 en W-R(CH3)2, getest met behulp van acellulaire assays en bleken IC50-waarden te hebben (de concentratie waarbij 50% remming optreedt) van respectievelijk 510 nM, 916 nM en 1 μM. Deze waarden waren vergelijkbaar met die verkregen voor cyclische penta- tot nano-W-R-peptiden ([W-R]5-[W-R]9) die in eerdere studies werden gesynthetiseerd. De niet-gemethyleerde versies van de dipeptiden vertoonden echter geen remmende activiteit tegen Src-kinase. Al deze dipeptiden (50 μM) vertoonden geen cytotoxiciteit na incubatie tot 72 uur met drie verschillende kankercellijnen, waaronder leukemie (CCRF-CEM), borstadenocarcinoom (MDA-MB-231) en ovariumadenocarcinoom (SK-OV-3) cellijnen, wat wijst op de beperkte permeabiliteit van de peptiden door het celmembraan. Daarom is verder onderzoek nodig om de permeabiliteit van deze peptiden voor antikankertoepassingen te verbeteren, bijvoorbeeld door het gebruik van een peptidedrager of aanvullende peptidefunctionalisatie. Samenvattend biedt deze studie een protocol voor het synthetiseren en testen van peptiden die de Src-kinase-activiteit remmen en dus een veelbelovend vermogen tegen kanker bezitten, zoals aangetoond met behulp van acellulaire en cellulaire testen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kanker wordt veroorzaakt door de abnormale groei van normale cellen en is een van de meest dodelijke ziekten ter wereld. Deze abnormale cellen verspreiden zich naar verschillende organen in het lichaam via een proces dat metastase wordt genoemd. De meest voorkomende vorm van kanker is borstkanker, die in 2020 bij 2,26 miljoen mensen voorkwam. Bovendien waren er in 1.80 ongeveer 2020 miljoen sterfgevallen als gevolg van longkanker1. Volgens de Wereldgezondheidsorganisatie stierven in 2020 ongeveer 10 miljoen mensen aan kanker2. Kankercellen verschillen van normale cellen doordat ze bepaalde enzymen, zoals eiwittyrosinekinasen (PTK's), tot overexpressie brengen. Het National Cancer Institute definieert kinasen als enzymen die in staat zijn andere eiwitten of suikers te fosforyleren3. Kennis van de regulerende functie van kinasen kan het ontwerp van effectieve geneesmiddelen tegen kanker vergemakkelijken. PTK's katalyseren bijvoorbeeld de fosforylering van andere eiwitten of suikers, en als gevolg daarvan wordt ATP omgezet in ADP door het verlies van een fosfaatgroep. In totaal codeert 80% van de oncogenen en protooncogenen voor PTK's4. Src-kinasen zijn een familie van niet-receptortyrosinekinasen, waaronder Lck, Fyn, Hck, Blk, Yes en Yrk, die tot overexpressie worden gebracht in kankercellen, vooral bij borstkanker 5,6. Src-tyrosinekinasen worden geassocieerd met mitogenese, differentiatie, T-celactivering en celtransformatie. Src helpt bij de invasie en metastase van kankercellen vanwege het vermogen om de adhesie van kankercellen te verminderen. Er zijn vijf verschillende domeinen in Src-kinase, geordend van de N- tot C-terminals als: vetzuurdomein, Src-homologie 3-domein (SH3), Src-homologie 2-domein (SH2), tyrosinekinasedomein (SH1) en C-terminaal regulerend domein7.

figure-introduction-1
Figuur 1: De doeldomeinen in het Src-kinase-enzym, waaronder een SH3-domein, SH2-domein, kinasedomein (SH1) en een kort C-terminaal regulatiesegment. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Het kinasedomein SH1 wordt het meest getarget bij het ontwerpen van Src-kinaseremmers, omdat het twee geconserveerde plaatsen voor ATP en substraatbinding bevat (Figuur 1). Als de aminozuursequentie van het kinasedomein bekend is, kan het substraat ook worden gebruikt als doelwit om een verbinding te ontwerpen die de binding van het substraat aan Src-kinase8 nabootst. Daarnaast kunnen andere sites, zoals de SH3- en SH2-domeinen, als doelwit worden gebruikt. In vergelijking met andere chemotherapiemiddelen vertonen kinaseremmers minder toxiciteit en een hogere werkzaamheid9. Vanaf september 2021 zijn er 73 kleine moleculen die fungeren als kinaseremmers die zijn goedgekeurd door de FDA10. Imatinib is een voorbeeld van een geneesmiddel tegen kanker dat selectief de activiteit van tyrosinekinase remt; Sommige patiënten zijn echter resistent tegen het geneesmiddel vanwege het verschijnen van een puntmutatie in het kinasedomein11. AstraZeneca bracht Saracatinib op de markt, een geneesmiddel dat de Src-familie van tyrosinekinasen remt met een IC50-waarde (de concentratie waarbij 50% remming optreedt) van 2,7 nM, maar het werd verdisconteerd in fase 2-onderzoeken12. Van de 52 PTK-remmers die begin 2020 door de Amerikaanse FDA zijn goedgekeurd,blokkeren er 13 slechts 28 doelreceptor-PTK's, 11 blokkeren de niet-receptor-PTK, 11 remmen eiwitserine/threonine-eiwitkinasen en twee blokkeren MEK1/213. De toenemende belangstelling voor onderzoek naar oncologie zal de ontdekking van kinaseremmers als potentiële geneesmiddelen tegen kanker blijven voeden. Tot nu toe zijn echter slechts 50 van de 500 eiwitkinasen het doelwit geweest van behandeling; Daarom wordt verwacht dat in de nabije toekomst een groter aantal kinasen zal worden bestudeerd voor de ontwikkeling van geneesmiddelen14. Daarnaast is er behoefte aan het ontdekken van kinaseremmers om nog niet-geïdentificeerde kinasemutaties te onderzoeken die tot kanker leiden.

Deze studie was dus gericht op het ontwikkelen van peptiden die kunnen worden gebruikt als remmers voor de Src-familie en zich richten op de ATP-bindingsplaats vanwege het vermogen om te dienen als een geconserveerde plaats tussen verschillende kinasen. Daartoe werd een reeks dipeptiden met gemethyleerd tryptofaan en/of gemethyleerd arginine gesynthetiseerd en getest op hun synergetisch vermogen om Src-kinase te remmen. De indoolring van tryptofaan bootst het adenine van ATP na en concurreert met ATP van binding aan de ATP-bindingsplaats. Bovendien concurreert het gemethyleerde arginine in de ligand om het SH3-domein van Src. Onderzoekers toonden aan dat een polypeptide dat gedemethyleerd arginine bevat, het SH3-domein remt, mogelijk als gevolg van een specifieke geconserveerde sequentie op het SH3-bindingsmotief (d.w.z. PXXP), dat een bindingsaffiniteit heeft met een ligand dat twee tot drie Arg-residuen bevat in de N-terminal of één tot twee Arg-residuen op de C-terminal van de liganden15, 16,17. De guanidinogroep van Arg bindt aan het geconserveerde Asp-99-residu van het SH3-domein18,19, terwijl het resterende deel van de Arg bindt aan het geconserveerde Trp-118 van het enzym, zoals bevestigd door NMR-analyse en de kristalstructuren van verschillende SH3-domeinen19. Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de synthese van zeven gemethyleerde dipeptiden en het testen van hun remmingsvermogen tegen Src-kinase. Verder werd het vermogen van deze peptiden om verschillende kankercellijnen in vitro te doden onderzocht.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Synthese van peptiden

OPMERKING: De synthese van W-R wordt beschreven als een representatief voorbeeld (Figuur 2).

  1. Weeg 566 mg (0,3 mmol) H-Arg(Pbf)-2-chloortrirylhars af en voeg dit toe aan het peptidesynthesevat (zie materiaaltabel), volgens de procedure die wordt gebruikt door Mandal et al20. Voer peptidesynthese uit met behulp van de gevestigde strategie voor peptidesynthese in de vaste fase (SPPS)21.
    OPMERKING: Gemethyleerde of gedimethyleerde dipeptiden die onnatuurlijke aminozuren bevatten, werden geassembleerd op een ijsbaanamidehars (laadcapaciteit van 0,3 mmol/g), terwijl dipeptiden die natuurlijke aminozuren bevatten, werden geassembleerd op een hars waaraan het eerste aminozuur was bevestigd, zoals de H-Arg(Pbf)-2-chloortrirylhars (laadvermogen van 0,3 mmol/g). Belangrijk is dat de ijsbaanamidehars een peptide produceert dat is afgedekt met een C-terminaal NH2.
  2. Zwelt de droge hars gedurende 1 uur in 5 ml N,N-dimethylformamide (DMF) onder stikstofgasdruk die is verbonden met het peptidevat.
    OPMERKING: Voer het gehele syntheseproces uit in een zuurkast. Tijdens het experiment moeten een veiligheidsbril, handschoenen en een laboratoriumjas worden gedragen. Een timer is ook essentieel om bij te houden tussen de stappen voor het toevoegen van chemische reagentia.
  3. Verwijder overtollig DMF met behulp van stikstofgasdruk die tijdens het syntheseproces is verbonden met het peptidesynthesevat.
  4. Weeg 473,9 mg Fmoc-trp(Boc)-OH (0,9 mmol) en 341 mg 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorfosfaat (HBTU) (0,9 mmol) af als koppelingsreagentia. Voeg de poeders toe aan een reageerbuis en los ze op in 5 ml droog DMF.
  5. Voeg 313,4 μl (1,8 mmol) N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) als activeringsmiddel toe aan de reageerbuis (stap 1.4) en meng door de buis te schudden.
  6. Voeg de inhoud van het reageerbuisje toe aan de hars en laat de reactie 1 uur doorgaan onder stikstofgas bij kamertemperatuur. Giet vervolgens het overtollige DMF af met behulp van stikstofgasdruk en was de hars 3x met DMF.
  7. Deprotect de N-terminal Fmoc met 5 ml 20% piperidine in DMF (v/v) gedurende 20 minuten onder stikstofgas. Was de hars 3x met DMF (3 x 5 ml).
  8. Droog de hars door 5 ml dichloormethaan (DCM) toe te voegen en houd het 5 minuten onder stikstofgas, en tap vervolgens de DCM af met behulp van stikstofgasdruk. Voeg 5 ml methanol toe onder stikstofgas gedurende 5 minuten om de droogheid van de hars te vergroten.
  9. Voeg 10 ml van een vers bereide decolletécocktail van TFA/thioanisol/dithiothreitol/anisol (90:3:5:2 v/v/w/v) toe gedurende 2,5 uur om alle zijketens te ontbeschermen en het dipeptide van de hars te splitsen.
    LET OP: De decolletécocktail moet in een glazen maatcilinder worden toegevoegd, omdat TFA zuur en gevaarlijk is; Wees voorzichtig bij het gebruik.
  10. Giet de reactieoplossing na 2,5 uur met behulp van stikstofdruk uit het peptidevat in een kolf met ronde bodem. Voeg 250 ml koude diethylether (Et2O) toe aan de kolf met ronde bodem die de ruwe peptide bevat om de peptide neer te slaan.
  11. Filtreer het neergeslagen peptide met behulp van een filterpapier in een conische trechter met één zijarm die is verbonden met water (zodat de filtratie plaatsvindt als gevolg van de waterdruk), en verzamel het neerslag (de peptiden) om de ether volledig te verwijderen. Het ruwe peptide slaat binnen 10 minuten neer.
  12. Zuiver het ruwe peptide op een omgekeerde fase high-performance vloeistofchromatografie (HPLC) kolom (zie Materiaaltabel) met behulp van een gradiëntsysteem. Gebruik een gradiënt van 0%-100% acetonitril met 0,1% TFA in water dat 0,1% TFA bevat gedurende 30-60 minuten bij een stroomsnelheid van 1 ml/min.

figure-protocol-1
Figuur 2: Vaste-fase peptidesynthese van W-R. Afkortingen: HBTU = 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorfosfaat; DIPEA = N,N-diisopropylethylamine; TFA = trifluorazijnzuur; DMF = dimethylformamide. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Bepaling van de celtoxiciteit van de gesynthetiseerde peptiden

  1. Plaat 2.000 cellen/putje van SK-OV-3-cellen, 5.000 cellen/putje MDA-MB-231-cellen, of 5 × 106 cellen/putje van CCRF-CEM-cellen (in een totaal volume van 100 μL/putje) in een microtiterplaat met 96 putjes. Incubeer de cellen in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2, 95% lucht bij 37 °C tot ze 75%-80% samenvloeiing bereiken.
    OPMERKING: RPMI-16-media worden gebruikt voor het kweken van CCRF-CEM-cellen en Eagle's minimum essential medium (EMEM) voor zowel MDA-MB-231- als SK-OV-3-cellijnen. Beide media worden aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine (10.000 eenheden/ml penicilline en 10 mg/ml streptomycine in 0,9% NaCl). Plaats alle media en supplementen gedurende 30 minuten in een waterbad van 37 °C voordat u met het experiment begint. Het experiment moet worden uitgevoerd in een bioveiligheidskap, met handschoenen en een laboratoriumjas.
  2. Zuig het medium op met behulp van een pipet en voeg 100 μL van het 50 μM peptide of 10 μM doxorubicine (Dox) dat als positieve controle wordt gebruikt in drievoud toe aan putjes met de drie verschillende soorten kankercellen die in de plaat met 96 putjes zijn geplateerd. Plaats de plaat 72 uur terug in de broedmachine (onder dezelfde omstandigheden als vermeld in stap 2.1).
  3. Voeg na 72 uur 20 μL 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyfenyl)-2-(4-sulfofenyl)-2H-tetrazolium (MTS) toe aan de plaat met 96 putjes. Wikkel de plaat in aluminiumfolie en incubeer de plaat gedurende 1-4 uur bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer.
    OPMERKING: MTS is een kleurstof die wordt gebruikt om levende cellen te visualiseren (onbehandeld of behandeld met de peptiden), aangezien alleen de levende cellen MTS-tetrazolium omzetten in gekleurde formazankleurstof die kan worden gemeten bij 490 nm.
  4. Meet de absorptie van het formazan product bij 490 nm (A490) op een microplaatlezer (zie Materiaaltabel). Voeg medium gemengd met MTS toe als een blanco voor het experiment. Gebruik alleen water (aangezien de peptiden in water oplosbaar zijn) en 0,1 N HCl (aangezien WCH3 HCl nodig heeft om op te lossen) als negatieve controles.
  5. Meet het percentage van de celoverleving met behulp van de volgende vergelijking (Eq 1), met behulp van een spreadsheetprogramma (zie Materiaaltabel). De procedure is dezelfde als die van Mandal et al20.
    figure-protocol-2Eq (1)

3. c-Src kinase activiteit test

OPMERKING: De Src-kinase-activiteitstest werd uitgevoerd met behulp van een in de handel verkrijgbare testkit (zie materiaaltabel) in drievoud, volgens de procedure van Chhikara et al.22. Gebruik WCH3 en RCH3 alleen als controles om het effect van het gemethyleerde aminozuur alleen op kinase en met een ander gemethyleerd of niet-gemethyleerd aminozuur te vergelijken.

  1. Voeg in een 384-well low volume zwarte niet-bindende microplaat met ronde bodem 2,5 μL van de reactiecocktail met 0,7 nM His6-Src kinasedomein in kinasebuffer, dat deel uitmaakt van de testkit, toe aan 2,5 μL voorverdunde peptiden opgelost in 10% DMSO (4x doelconcentratie). Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur met behulp van een microplaatschudder (5 rpm) volgens het protocol van de fabrikant.
    OPMERKING: De reactiecocktail bestaat uit de kinasebuffer (200 mM HEPES, pH 7,5), MgCl2 (16 mM), DMSO (4%), EGTA (8 mM), 2-mercaptoethanol (43 mM) en Brij-35 (0,04%). Het optimale substraat van de kinasereactie van dit experiment is (AEEEIYGEFEAKKKK).
  2. Voeg 5 μL van de ATP/substraat (40 μM/600 μM) cocktail toe aan de plaat en incubeer gedurende 30 minuten op een microplate shaker bij kamertemperatuur.
  3. Bereid ondertussen het 1x ADP-detectiemengsel voor dat 8 nM ADP-tracer en 10 μg/ml kleurstofgeconjugeerd ADP 2-antilichaam bevat (zie materiaaltabel) tegen de stop en detecteer buffer B (1x) uit de kit. Stop de kinasereactie (stap 3.2) door 10 μL van het 1x ADP-detectiemengsel toe te voegen en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  4. Meet de fluorescentie-intensiteit met behulp van een microplaatlezer, met excitatie bij 580 nm, emissie bij 630 nm en 10 nm bandbreedte. Verkrijg relatieve fluorescentie-eenheden (RFU's) van het instrument om het percentage enzymremming te verkrijgen, volgens Eq (2).
    figure-protocol-3Eq (2)
  5. Bereken de IC50-waarde zoals vermeld op de website van het bedrijf23.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W-RCH3, WCH3-R CH3, W-R(CH3)2, WCH3-R, WCH3-R(CH3)2 en de controle-W-R-peptiden werden gesynthetiseerd met behulp van Fmoc-peptidesynthese in de vaste fase (Figuur 3), met respectievelijk 95%, 98,7%, 99%, 100%, 100% en 99,5% zuiverheid. De chemische structuren van deze dipeptiden werden bevestigd met behulp van ESI-MS. De m/z-waarden van deze dipeptiden waren respectievel...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De peptiden die hier werden gefabriceerd en getest voor de remming van Src-kinase en het daaruit voortvloeiende doden van kankercellen, bevatten gemethyleerd tryptofaan en/of gemethyleerd arginine, wat onnatuurlijke aminozuren zijn. De vorming van het witte neerslag bij het toevoegen van diethylether is een cruciale stap in de synthese van deze peptiden. Niet alle synthetische peptiden kunnen echter een neerslag vormen; daarom, zelfs wanneer er geen neerslag wordt gevormd, kan een succes...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We willen graag het decanaat van wetenschappelijk onderzoek (DSR) van de King Abdulaziz University (KAU), Jeddah, Saoedi-Arabië, bedanken, die dit project heeft gefinancierd onder subsidienr. (G: 031-130-1443).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-DithiothreitolSigma-Aldrich10708984001Peptide synthese
Aldrich fritted filter funnel for solid-phase syntheseSigma-AldrichZ283304Peptide synthese vat
Alexa594 TracerBell Brook Labs, Madison, WI3013
AnisolSigma-Aldrich8014520500
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay reagents PromegaG3582Cel proliferatie assay (MTS reagent)
Dichloormethaan, 99,9%, Extra DryFishersciAC326850025
Fmoc-ADMA(Pbf)-OHSigma-Aldrich8521070001
Fmoc-Arg(Me,Pbf)-OHSigma-Aldrich8521050001
Fmoc-Arg(Pbf)-OHSigma-Aldrich8520670025
Fmoc-Trp(Boc)-OHSigma-Aldrich47561-25G-F
HPLC C18 kolom Shimadzu  (RP-HPLC systeem)water/acetonitril gradiënt
IRDye QC-1 quencherBell Brook Labs, Madison, WI3013
Microplate reader SpectraMax M2eMolecular devices
Microsoft ExcelMicrosoftspreadsheet software
N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA)Sigma-Aldrich496219
N,N-Dimethylformamide, anhydrous, 99,8%FishersciAA43997M1
Piperidine 20%Sigma-Aldrich80645
Rink Amide hars (100-200 mesh)Sigma-Aldrich8550010025
ThioanisolSigma-Aldrich92358
Transcreener ADP2 FI AssayBell Brook Labs, Madison, WI3013c-Src kinase activiteit assay kit

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Cancer. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer#:~:text=Cancer%20a%20leading%20cause,and%20rectum%20and%20prostate%20cancers (2022).
  3. Negi, P., Cheke, R. S., Patil, V. M. Recent advances in pharmacological diversification of Src family kinase inhibitors. Egyptian Journal of Medical Human Genetics. 22 (1), 52(2021).
  4. Huang, X. L., et al. Role of receptor tyrosine kinases mediated signal transduction pathways in tumor growth and angiogenesis-New insight and futuristic vision. International Journal of Biological Macromolecules. 180, 739-752 (2021).
  5. Mohammed, S., et al. Sublethal doxorubicin promotes migration and invasion of breast cancer cells: role of Src Family non-receptor tyrosine kinases. Breast Cancer Research. 23 (1), 76(2021).
  6. Biscardi, J. S., Ishizawar, R. C., Silva, C. M., Parsons, S. J. Tyrosine kinase signalling in breast cancer: epidermal growth factor receptor and c-Src interactions in breast cancer. Breast Cancer Research. 2 (3), 1-8 (2000).
  7. Ortiz, M. A., et al. Src family kinases, adaptor proteins and the actin cytoskeleton in epithelial-to-mesenchymal transition. Cell Communication and Signaling. 19 (1), 67(2021).
  8. Hill, Z. B., Perera, B. G., Andrews, S. S., Maly, D. J. Targeting diverse signaling interaction sites allows the rapid generation of bivalent kinase inhibitors. ACS Chemical Biology. 7 (3), 487-495 (2012).
  9. Wu, S., Fu, L. Tyrosine kinase inhibitors enhanced the efficacy of conventional chemotherapeutic agent in multidrug resistant cancer cells. Molecular Cancer. 17 (1), 25(2018).
  10. Ayala-Aguilera, C. C., et al. Small molecule kinase inhibitor drugs (1995-2021): Medical indication, pharmacology, and synthesis. Journal of Medicinal Chemistry. 65 (2), 1047-1131 (2022).
  11. Lyczek, A., et al. Mutation in Abl kinase with altered drug-binding kinetics indicates a novel mechanism of imatinib resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (46), 2111451118(2021).
  12. Musumeci, F., Schenone, S., Brullo, C., Botta, M. An update on dual Src/Abl inhibitors. Future Medicinal Chemistry. 4 (6), 799-822 (2012).
  13. Roskoski, R. Properties of FDA-approved small molecule protein kinase inhibitors: A 2020 update. Pharmacological Research. 152, 104609(2020).
  14. Cohen, P., Cross, D., Jänne, P. A. Kinase drug discovery 20 years after imatinib: Progress and future directions. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (7), 551-569 (2021).
  15. Feng, S., Chen, J. K., Yu, H., Simon, J. A., Schreiber, S. L. Two binding orientations for peptides to the Src SH3 domain: development of a general model for SH3-ligand interactions. Science. 266 (5188), 1241-1247 (1994).
  16. Alexandropoulos, K., Cheng, G., Baltimore, D. Proline-rich sequences that bind to Src homology 3 domains with individual specificities. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (8), 3110-3114 (1995).
  17. Feng, S., Kasahara, C., Rickles, R. J., Schreiber, S. L. Specific interactions outside the proline-rich core of two classes of Src homology 3 ligands. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (26), 12408-12415 (1995).
  18. Polverini, E., Rangaraj, G., Libich, D. S., Boggs, J. M., Harauz, G. Binding of the proline-rich segment of myelin basic protein to SH3 domains: Spectroscopic, microarray, and modeling studies of ligand conformation and effects of posttranslational modifications. Biochemistry. 47 (1), 267-282 (2008).
  19. Weng, Z., et al. Structure-function analysis of SH3 domains: SH3 binding specificity altered by single amino acid substitutions. Molecular and Cellular Biology. 15 (10), 5627-5634 (1995).
  20. Mandal, D., Nasrolahi Shirazi, A., Parang, K. Cell-penetrating homochiral cyclic peptides as nuclear-targeting molecular transporters. Angewandte Chemie. 50 (41), 9633-9637 (2011).
  21. Hussein, W. M., Skwarczynski, M., Toth, I. Peptide Synthesis: Methods and Protocols. , Humana Press. (2020).
  22. Chhikara, B. S., et al. Phenylpyrazalopyrimidines as tyrosine kinase inhibitors: Synthesis, antiproliferative activity, and molecular simulations. Molecules. 25 (9), 2135(2020).
  23. TRANSCREENER ADP2 Fl Assay. BellBrook Labs. , Available from: https://www.bellbrooklabs.com/wp-content/uploads/2021/03/Tech-Manual-ADP2-Fl-v031621.pdf (2022).
  24. Sanner, M. F., et al. Cyclic peptides as protein kinase inhibitors: Structure-activity relationship and molecular modeling. Journal of Chemical Information and Modeling. 61 (6), 3015-3026 (2021).
  25. Nahhas, A. F., Nahhas, A. F., Webster, T. J. The physical properties of tripeptide stereocomplex nano-formations. Journal of Biomedical Nanotechnology. 16 (10), 1495-1503 (2020).
  26. Nahhas, A. F., Chang, R., Webster, T. J. Introducing unnatural amino acids-containing tripeptides as antimicrobial and anticancer agents. Journal of Biomedical Nanotechnology. 14 (5), 987-993 (2018).
  27. Deng, G., et al. Tryptophan-containing dipeptide derivatives as potent PPARγ antagonists: design, synthesis, biological evaluation, and molecular modeling. European Journal of Medicinal Chemistry. 43 (12), 2699-2716 (2008).
  28. Chetty, V. T., Sharma, A. M. Can PPARγ agonists have a role in the management of obesity-related hypertension. Vascular Pharmacology. 45 (1), 46-53 (2006).
  29. Skeggs, L. T., Kahn, J. R., Shumway, N. P. The preparation and function of the hypertensin-converting enzyme. Journal of Experimental Medicine. 103 (3), 295-299 (1956).
  30. Lunow, D., Kaiser, S., Brückner, S., Gotsch, A., Henle, T. Selective release of ACE-inhibiting tryptophan-containing dipeptides from food proteins by enzymatic hydrolysis. European Food Research and Technology. 237 (1), 27-37 (2013).
  31. Weber, J., Wilke-Mounts, S., Grell, E., Senior, A. E. Tryptophan fluorescence provides a direct probe of nucleotide binding in the noncatalytic sites of Escherichia coli F1-ATPase. The Journal of Biological Chemistry. 269 (15), 11261-11268 (1994).
  32. Iavarone, A. T., Patriksson, A., vander Spoel, D., Parks, J. H. Fluorescence probe of Trp-cage protein conformation in solution and in gas phase. Journal of the American Chemical Society. 129 (21), 6726-6735 (2007).
  33. Nongonierma, A. B., Fitzgerald, R. J. Inhibition of dipeptidyl peptidase IV (DPP-IV) by tryptophan containing dipeptides. Food & Function. 4 (12), 1843-1849 (2013).
  34. Bjelke, J. R., et al. Dipeptidyl peptidases 8 and 9: specificity and molecular characterization compared with dipeptidyl peptidase IV. The Biochemical Journal. 396 (2), 391-399 (2006).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Src Kinase InhibitionMethylated DipeptidesSolid Phase Peptide SynthesisAnti Cancer PeptidesTyrosine Kinase ActivityAcellular AssaysPeptide PermeabilityCancer Cell LinesPeptide FunctionalizationIC50 Measurement