Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Het meten van de thermogenese van de skeletspieren bij muizen en ratten

3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64264

⸱

27 juli 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Biomedical Sciences, Kent State University, 2College of Public Health, Kent State University, 3Department of Biological Sciences, Kent State University

In dit artikel

Samenvatting

Muizen en ratten worden chirurgisch geïmplanteerd met externe temperatuurtransponders en vervolgens gewend aan de testomgeving en procedure. Veranderingen in spiertemperatuur worden gemeten als reactie op farmacologische of contextuele stimuli in de thuiskooi of tijdens voorgeschreven fysieke activiteit (d.w.z. loopband lopen met een constante snelheid).

Samenvatting

Skeletspierthermogenese biedt een potentiële weg voor een beter begrip van metabole homeostase en de mechanismen die ten grondslag liggen aan het energieverbruik. Verrassend weinig bewijs is beschikbaar om de neurale, myocellulaire en moleculaire mechanismen van thermogenese direct te koppelen aan meetbare veranderingen in spiertemperatuur. Dit artikel beschrijft een methode waarbij temperatuurtransponders worden gebruikt om directe metingen van de temperatuur van de spieren van muizen en ratten op te halen.

Externe transponders worden chirurgisch geïmplanteerd in de spieren van muizen en ratten en de dieren krijgen de tijd om te herstellen. Muizen en ratten moeten dan herhaaldelijk gewend raken aan de testomgeving en procedure. Veranderingen in spiertemperatuur worden gemeten als reactie op farmacologische of contextuele stimuli in de thuiskooi. Spiertemperatuur kan ook worden gemeten tijdens voorgeschreven fysieke activiteit (d.w.z. loopband lopen met een constante snelheid) om veranderingen in activiteit te berekenen als bijdragers aan de veranderingen in spiertemperatuur veroorzaakt door deze stimuli.

Deze methode is met succes gebruikt om mechanismen op te helderen die ten grondslag liggen aan spierthermogene controle op het niveau van de hersenen, het sympathische zenuwstelsel en de skeletspieren. Er worden demonstraties gegeven van dit succes met behulp van roofdiergeur (PO; frettengeur) als een contextuele stimulus en injecties van oxytocine (Oxt) als een farmacologische stimulus, waarbij roofdiergeur spierthermogenese induceert en Oxt de spiertemperatuur onderdrukt. Deze datasets tonen dus de effectiviteit van deze methode bij het detecteren van snelle veranderingen in spiertemperatuur.

Inleiding

Binnen metabolisch onderzoek is het onderzoek van de thermogenese van de skeletspieren een veelbelovende nieuwe weg voor het onderzoeken van homeostase van het lichaamsgewicht. De gepubliceerde literatuur ondersteunt het idee dat de thermogene reacties van een van de grootste orgaansystemen van het lichaam - de skeletspieren - een manier bieden om het energieverbruik en andere metabole effecten te verhogen, waardoor effectief herbalanceringssystemen binnen ziekten zoals obesitasworden hersteld 1,2,3. Als de spier als een thermogeen orgaan kan worden beschouwd, moeten studies een praktische methodologie gebruiken om thermogene veranderingen in dit orgaan te bestuderen. De wens om de endotherme impact van skeletspieren te begrijpen en het nut van deze methodologie voor het bestuderen van niet-rillende spierthermogenese zijn niet specifiek voor metabole studies. Disciplines zoals evolutie4, vergelijkende fysiologie5 en ecofysiologie 6,7 hebben een gevestigd belang getoond in het begrijpen van de manieren waarop spierthermogenese kan bijdragen aan endothermie en hoe dit mechanisme zich aanpast aan de omgeving. Het gepresenteerde protocol biedt de kritieke methoden die nodig zijn om deze vragen aan te pakken.

De verstrekte methode kan worden gebruikt bij de beoordeling van zowel contextuele als farmacologische stimulimodulatie van spiertemperatuur, inclusief de unieke techniek van het verstrekken van roofdiergeur (PO) om de context te verschuiven om roofdierdreiging te repliceren. Eerdere rapporten hebben aangetoond dat PO snel een aanzienlijke toename van spierthermogenese kan induceren8. Bovendien kunnen farmacologische stimuli ook de spiertemperatuur veranderen. Dit is aangetoond in de context van PO-geïnduceerde spierthermogenese, waarbij farmacologische blokkade van perifere β-adrenerge receptoren, met behulp van nadolol, het vermogen van PO om spierthermogenese te induceren remde zonder de contractiele thermogenese tijdens het lopen op de loopband significant te beïnvloeden8. Centrale toediening van melanocortinereceptoragonisten bij ratten is ook gebruikt om hersenmechanismen te onderscheiden die de thermogenese veranderen 9,10.

Hier is een voorlopig onderzoek naar het vermogen van het neurohormoon oxytocine (Oxt) om de spierthermogenese bij muizen te veranderen. Net als bij roofdierdreiging verhogen sociale ontmoetingen met een conspecifiek van hetzelfde geslacht de lichaamstemperatuur, een fenomeen dat sociale hyperthermie wordt genoemd11. Gezien de relevantie van Oxt voor sociaal gedrag12, is er gespeculeerd dat Oxt een mediator is van sociale hyperthermie bij muizen. Inderdaad, een oxytocinereceptorantagonist vermindert sociale hyperthermie bij muizen11, en muizenpups zonder Oxt vertonen tekorten in gedrags- en fysiologische aspecten van thermoregulatie, waaronder thermogenese13. Gezien het feit dat Harshaw et al. (2021) geen bewijs hebben gevonden dat β3 adrenerge receptorafhankelijke bruine vetweefsel (BAT) thermogenese met sociale hyperthermie11 ondersteunt, is gesteld dat sociale hyperthermie kan worden aangedreven door Oxt's inductie van spierthermogenese.

Om de thermogenese van de skeletspieren te meten, gebruikt het volgende protocol de implantatie van voorgeprogrammeerde IPTT-300-transponders naast de spier van belang in een muis of rat 8,10,14,15. Deze transponders zijn in glas ingekapselde microchips die worden gelezen met behulp van overeenkomstige transponderlezers. Weinig tot geen onderzoek heeft deze technologie in deze hoedanigheid gebruikt, hoewel studies hebben gesuggereerd dat de specificiteit van deze methode nodig is16,17. Eerdere onderzoeken hebben de betrouwbaarheid van deze methode aangetoond en een verscheidenheid aan manieren waarop temperatuurtransponders kunnen worden gebruikt in vergelijking met andere temperatuurtestmethoden18 of in combinatie met chirurgische methoden (bijv. Cannulatie19). Studies van deze aard zijn echter gebaseerd op verschillende strategische plaatsingen om de totale lichaamstemperatuur 20,21,22 of gespecificeerde weefsels zoals BBT 23,24,25 te meten.

In plaats van de temperatuur vanaf deze locaties te meten of tijdens het gebruik van oor- of rectale thermometers26, biedt de hier beschreven methode specificiteit voor de spier van belang. Het vermogen om een site te targeten door transponders direct naast de spieren van belang te implanteren, is effectiever voor het specifiek onderzoeken van spierthermogenese. Het biedt een nieuwe weg naast die van oppervlakte-infraroodthermometrie27,28 of cutane temperatuurmetingen via thermokoppel29. Bovendien bieden de gegevens die via deze methode worden verstrekt een reeks onderzoeksmogelijkheden, waardoor de noodzaak van grote, dure, hightech apparatuur en software zoals infraroodthermografie 30,31,32 wordt vermeden.

Deze methode is met succes gebruikt om de temperatuur in de quadriceps en gastrocnemius te meten, hetzij unilateraal of bilateraal. Deze methode is ook effectief geweest in combinatie met stereotaxische chirurgie 14,15. Binnen ~ 7-10 cm van de transponderpoot worden draagbare transponderlezers (DAS-8027 / DAS-7007R) gebruikt om de temperatuur te scannen, te meten en weer te geven. Deze afstand is van cruciaal belang en waardevol geweest voor eerdere onderzoeken 8,9,10 omdat het potentiële stressoren en temperatuurveranderende variabelen zoals dierbehandeling tijdens de testprocedures minimaliseert. Met behulp van timers kunnen metingen vervolgens worden geregistreerd en verzameld over een bepaalde periode zonder directe interactie met de dieren.

Om de verstoring van muizen tijdens het testen verder te minimaliseren, beschrijft deze methode de assemblage en het gebruik van risers gemaakt van PVC-leidingen om de experimentator tijdens het testen toegang te geven tot de bodem van de thuiskooien. Met behulp van de risers in combinatie met de digitale lezer kunnen temperatuurmetingen van de transponderpoot worden uitgevoerd zonder enige dierlijke interactie nadat de stimulus is geplaatst. Tegen minimale kosten kan deze methode worden gebruikt in combinatie met farmacologische en contextuele stimuli, waardoor deze vrij toegankelijk is voor onderzoekers. Bovendien kan deze methode worden gebruikt met een aanzienlijk aantal proefpersonen (~ 16 muizen of ~ 12 ratten) tegelijk, waardoor tijd wordt bespaard bij het verhogen van de totale doorvoer voor elk onderzoeksproject.

Geïntroduceerd in deze methode is een vervaardigd mechanisme voor het presenteren van geuren aan muizen met behulp van roestvrijstalen mesh thee-infuserballen, vanaf nu aangeduid als "theeballen". Hoewel deze theeballen ideaal zijn voor het bevatten van geurmateriaal, worden in deze studies handdoeken die gedurende 2-3 weken als in-cage bedding dienden voor fretten, een natuurlijk roofdier van muizen en ratten, in elke behandeling theebal geplaatst. Elke handdoek wordt in vierkanten van 5 cm x 5 cm gesneden. Deze aliquoting wordt ook herhaald met verder identieke geurloze controlehanddoeken. Het presenteren van deze geuren zonder een barrière (d.w.z. theebal) leidde ertoe dat muizen de vezels in hun kooien versnipperden, waardoor de fysieke activiteit toenam. Dit gedrag was niet zo opvallend bij ratten. Theeballen bieden een geventileerde behuizing aan de handdoek, waardoor volledige toegang tot de geur wordt gegeven terwijl ze gedurende de hele experimentele proef beschermd blijven. Deze theeballen kunnen worden ontsmet in overeenstemming met de protocollen voor dierlijk gebruik, worden voorbereid en direct na de operatie worden geïntroduceerd om te beginnen met het wennen van de dieren aan de structuur, samen met de controleprikkel. Muizen kunnen dan leven met de extra verrijking, waardoor de salience van de acute stimuluspresentatie afneemt.

Gewenning aan de aanwezigheid van de theebal is slechts één aspect van gewenning dat van cruciaal belang is voor deze methode. Het beschreven gewenningsprotocol bestaat ook uit herhaalde blootstelling aan de testprocedure om de testomgeving te normaliseren (d.w.z. personeel, transport en beweging naar de testlocatie, blootstelling aan stimulus). Deze uitgebreide gewenning minimaliseert genuanceerde reacties van de dieren en richt metingen op de gewenste afhankelijke variabelen (bijvoorbeeld farmacologische of contextuele stimuli). Eerdere beoordeling van dit protocol heeft vier proeven geïdentificeerd als het minimumaantal gewenningsen dat nodig is voor temperatuurtests in thuiskooien bij ratten8. Als het testen wordt gescheiden door lange perioden (meer dan 2-3 weken), moeten de dieren opnieuw worden gewend. Voor herhaalde gewenning is minimaal één tot twee proeven voldoende. Als temperatuurtests echter worden gescheiden door langere perioden, kan het nodig zijn om meer onderzoeken te herhalen.

In de voortdurende inspanning om muizen en ratten aan de testprocedure te laten wennen, moet in elke experimentele proef een acclimatisatieperiode vóór de presentatie van de stimulus worden opgenomen. Deze acclimatisatietijd is van cruciaal belang om temperatuur en activiteit opnieuw in evenwicht te brengen nadat deze naar de testlocatie is verplaatst. Knaagdieren hebben de neiging om sterke temperatuurstijgingen te hebben als gevolg van translocatie. Acclimatisatie moet bestaan uit minimaal 1 uur zonder interactie van de experimentator op de dag van het testen voordat een farmacologisch agens of contextuele stimuli worden toegevoegd. Dit is elke testdag nodig.

In de geschetste thuiskooitemperatuurtests hebben muizen het vrije bereik van hun thuiskooi om rond te zwerven als reactie op de geteste stimulus. Dit kan variabele verschuivingen in activiteit veroorzaken, die van invloed zijn op de nauwkeurigheid van temperatuurmetingen en dus op de analyse van de thermogene effecten van de onafhankelijke variabele (bijv. Farmacologische of contextuele stimulus). Als erkenning van de mogelijke veranderingen in temperatuur als gevolg van het activiteitsniveau, is hieronder een protocol opgenomen dat het gebruik van temperatuur tijdens het lopen op de loopband beschrijft. De gepubliceerde literatuur beschrijft het succesvolle gebruik van deze procedure bij ratten en wordt momenteel gebruikt bij muizen 8,10,14,15. Loopbandlopen handhaaft een constante snelheid van activiteit voor de proefpersoon. Voor deze studie worden loopbanden strikt gebruikt om het activiteitsniveau te controleren en daarom zijn ze ingesteld op de laagst beschikbare snelheid op de loopband om het lopen voor muizen en een vergelijkbare lage instelling voor ratten te bevorderen.

De volgende procedure wordt beschreven voor de temperatuurmeting van unilaterale gastrocnemius bij muizen en roofdiergeurpresentatie. Het ontwerp kan worden gebruikt in combinatie met farmacologische middelen en is overdraagbaar op ratten en andere skeletspiergroepen (d.w.z. quadriceps) bij muizen. Voor ratten kunnen transponders bilateraal in de gastrocnemius en in bruin vetweefsel worden geplaatst. Vanwege grootte- en afstandsbeperkingen kan slechts één transponder per muis worden gebruikt. Kleine wijzigingen (bijvoorbeeld het verwijderen van contextuele stimuli) kunnen worden aangebracht om thermogene reacties op farmacologische middelen te beoordelen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Deze methoden kunnen worden toegepast op zowel ratten- als muismodellen en werden uitgevoerd met institutionele goedkeuring (Kent State University, IACUC Approval # 359 en # 340 CN 12-04). Voorafgaand aan de implementatie van het protocol moeten dieren worden gehuisvest in overeenstemming met de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren.

1. De transponderlezer voorbereiden

OPMERKING: Voor gebruik moet de transponderlezer worden ingesteld; de volgende stappen bevatten alleen de instellingswijzigingen die nodig zijn voor dit onderzoek. Dit deel van het protocol is direct gekoppeld aan de DAS-8027-IUS draagbare lezers; andere leesmodellen moeten de instructies van de handleiding volgen om programmeerresultaten te bereiken.

  1. Stel Audio-pieptoon in op UIT.
    1. Schakel het apparaat in door op de SCAN-knop te drukken en wacht tot de verlichting op het OLED-scherm verschijnt. Houd de knop BACK/MENU ingedrukt om naar het menuscherm te gaan.
    2. Blader met de knop NEXT/ENTER door de opties tot OPERATIONELE INSTALLATIE. Schakel hier de pijlen omhoog of omlaag om JA te draaien en open het operationele submenu.
    3. Blader met de knop NEXT/ENTER naar AUDIO BEEP. Aangezien de standaardinstelling AAN is, schakelt u de pijlen omhoog of omlaag in en wijzigt u de instelling in UIT.
    4. Druk op de knop NEXT/ENTER om deze instellingswijziging op te slaan.
  2. Stel Trillen bij lezen in op AAN.
    1. Volg stap 1.1 tot en met stap 1.2 of voltooi de volgende stap direct na stap 1.4.
    2. Scrol met de knop NEXT/ENTER naar TRILLEN BIJ LEZEN. Aangezien de standaardinstelling UIT is, schakelt u de pijlen omhoog en omlaag in en wijzigt u de instelling in AAN om via trillingen te voelen wanneer de meting is voltooid, ongeacht of u het scherm kunt bekijken.

2. Programma transponders

OPMERKING: Elke geïmplanteerde transponder moet eerst worden geprogrammeerd met een dieridentificatie (dier-ID of transponder-ID). Deze nomenclatuur kan worden gebruikt als secundaire identificatie voor de proefpersoon (bijvoorbeeld vier cijfers voor de afkorting van de muizenstam, locatie van de transponder en nog eens drie tot vier cijfers om het diernummer aan te geven). De programmering kan dagen voor de operatie worden voltooid, terwijl de transponders steriel blijven voorafgaand aan de operatie.

  1. Voer de ID-code in op de transponder.
    1. Breng een boosterspoel aan op de lezerkop — een specifiek accessoire voor model DAS 8027-IUS, dat helpt bij de programmeerprocedure.
    2. Plaats met een gehandschoende hand de transponder (in de applicator) in de boosterspoel.
    3. Schakel het apparaat in door op de SCAN-knop te drukken en wacht tot het OLED-scherm oplicht. Houd de knop BACK/MENU ingedrukt om naar het menuscherm te gaan.
    4. Blader met de knop NEXT/ENTER door de opties totDAT U TRANSPONDER-ID SCHRIJFT. Schakel hier de pijlen omhoog of omlaag om JA te draaien.
    5. Schakel met de knop NEXT/ENTER de id-code in.
    6. Gebruik de pijltoetsen omhoog en omlaag om door cijfers en letters te bladeren. Druk na elke tekenselectie op NEXT/ENTER om naar het volgende teken te gaan.
    7. Wanneer de ID-code is voltooid, drukt u op SCAN om de transponder te schrijven.
    8. Verwijder de transponder uit de boosterspoel en herhaal dit indien nodig. Controleer of de transponder temperatuurveranderingen afleest door de ingesloten transponders tussen gehandschoende handen te verwarmen en te meten met de temperatuurscanner.
      OPMERKING: DE INSTELLINGEN VOOR AUTO MULTI WRITE en SEQUENTIAL COUNT kunnen worden ingesteld op AAN om meerdere of sequentiële transponderprogrammering tijdens een sessie mogelijk te maken. Elke transponder moet tijdens het programmeren worden getest.

3. Bereid "thuiskooiballen" voor

  1. Doe 5 cm x 5 cm geurloze/controlehanddoek in een theebal.
  2. Plaats deze thuiskooiballen na de operatie in nieuwe thuiskooien om het dier te laten wennen aan de methode waarin de contextuele stimuli tijdens het testen worden gepresenteerd. Vervang deze thuiskooiballen elke 2 weken.

4. Chirurgie en postoperatieve zorg

  1. Weeg en noteer het lichaamsgewicht van de proefpersonen vóór de operatie. Gebruik een inductiekamer om anesthesie (bijv. 2-5% isofluraan) aan het dier te geven.
  2. Gebruik elektrische tondeuses om de achterpoot volledig te scheren. Analgesie toedienen (bijv. 5 mg/kg ketoprofen, s.c.) in overeenstemming met de institutionele richtlijnen.
    OPMERKING: Aanvullende analgesie kan nodig zijn als deze procedure wordt gecombineerd met andere chirurgische methoden.
  3. Reinig het gebied met 70% alcohol (of in de handel verkrijgbaar steriel alcoholdoekje) en povidon-jodiumwas (of in de handel verkrijgbare steriele, individueel verpakte betadine-wattenstaafjes) afwisselend ten minste drie keer, eindigend met povidon-jodium.
  4. Breng het dier terug naar de inductiekamer en verdoof het dier tot chirurgische niveaus. Zet vervolgens de muis in een gezichtsmasker voor voortdurende blootstelling aan anesthesie. Breng neomycine oftalmische zalf aan op de ogen van het dier om uitdroging tijdens anesthesie te voorkomen.
    OPMERKING: De procedure mag niet beginnen totdat de muis geen bewijs van pijnontvangst vertoont (d.w.z. corneareflex, staartknijpreactie, teenknijpreflex).
  5. Gebruik alleen een chirurgische schaar en maak een ondiepe snee door de huid op de rechter achterpoot.
  6. Ga parallel aan de gastrocnemius en plaats de scherpe rand van een voorgeprogrammeerde en niet-afgedekte steriele transponder in de incisie. Zorg ervoor dat de groene zuiger naar boven is gericht en zichtbaar is. Blijf de transponderapplicator in de incisie duwen totdat de opening van de transponderapplicator niet langer zichtbaar is.
    OPMERKING: Druk niet per ongeluk op de groene zuiger op de transponderapplicator tijdens stap 4.6. Voortijdige ontlading van de transponder zal leiden tot onjuiste plaatsing.
  7. Draai de applicator 180°, waardoor de groene zuiger naar beneden gericht is naar de ledemaat van de muis, niet langer zichtbaar voor de experimentator. Duw de transponderapplicator op de uiteindelijke locatie. Eenmaal in ideale plaatsing, naast of gedeeltelijk ingesloten in de gastrocnemius, duwt u de groene zuiger, waardoor de druk van de applicator de hand van de onderzoeker terug van de muis kan leiden.
  8. Gebruik een tang om de geopende huid bij elkaar te houden en plaats een wondclip met een steriele autoclip of steriele hechting. Gebruik indien nodig absorbeerbare hechtingen voorafgaand aan de steriele autoclip om de fascialaag te sluiten. Controleer met behulp van de transponderlezer de temperatuur van de muizenspier.
  9. Haal de muis uit de narcose en plaats hem in een schone thuiskooi bovenop een watercirculatief verwarmingskussen dat op laag is ingesteld voor herstel. Zorg ervoor dat de thuiskooi een theebal met een geurloze handdoek bevat om de gewenning te beginnen.
    OPMERKING: De muis moet binnen 15 minuten ontwaken uit de operatie. Voedsel kan op de bodem van de kooi worden geplaatst voor gemakkelijke toegang tijdens hersteldagen.
  10. Postoperatieve zorg
    1. Registreer dagelijks muisgewichten en temperaturen met behulp van een transponderlezer gedurende ten minste 2 dagen na de operatie of totdat muizen het lichaamsgewicht herwinnen of stabiliseren.
    2. Dien niet-narcotische analgesie (bijv. 5 mg / kg ketoprofen, s.c.) eenmaal daags toe aan de muizen gedurende ten minste 2 dagen na de operatie, met aanvullende doses indien nodig.
      OPMERKING: Muizen en ratten moeten binnen 5-8 dagen na de operatie volledig herstellen en kunnen gewennings- en testprocedures ondergaan.

5. Testvoorbereiding - thuiskooi

  1. Risers bouwen
    OPMERKING: De onderstaande stap is gebaseerd op kooien met een filter van 194 mm x 181 mm x 398 mm. Om grotere kooien te passen (bijvoorbeeld een rattenhuiskooi), moet de breedte worden aangepast.
    1. Snijd de PVC-buis met een ratelende PVC-snijder in acht secties en monteer volgens figuur 1C. Dit geeft een open tafelbladstructuur die ongeveer vier kooien kan bevatten. Maak het gewenste aantal stijgers.
  2. Opstelling van de ruimte
    1. Wijs een locatie toe aan elke riser in de testruimte. Scheid de risers die zijn ingesteld om verschillende contextuele stimuli (d.w.z. geuren) te ontvangen met een minimum van 2 m om verstorende variabelen te voorkomen.
      OPMERKING: Elke muis moet een toegewezen testlocatie hebben in de testruimte en op de fysieke risers, zoveel als mogelijk is om te voorkomen dat er associaties ontstaan tussen verschillende locaties en thermogene stimuli.
    2. Bevestig met behulp van magneetstrips chirurgische vellen of jassen over de stootborden, waardoor een visuele barrière ontstaat tussen de onderzoeker en de proefpersonen. Stel deze barrière in om temperatuurveranderingen als gevolg van muisactiviteit te minimaliseren bij het bekijken van experimentatoren die naar de kooi of rond de testruimte bewegen.
    3. (Optioneel) Plaats spiegels op het oppervlak onder de stootborden om het zicht op de bodem van de kooi tijdens het testen te vergemakkelijken.
      OPMERKING: Risers kunnen worden ontsmet via een kooiwassysteem. Doeken of chirurgische vellen moeten worden gewassen voorafgaand aan gewenning en testen.
  3. Theebalbereiding
    1. Bereid theeballetjes met controle- en PO-handdoeken (ongeveer 5 cm x 5 cm). Om kruisbesmetting te voorkomen, bereidt u eerst theeballetjes met controlegeur.
      OPMERKING: Predator-geur handdoeken moeten vóór gebruik worden getest op ziekteverwekkers. Deze handdoeken moeten ook worden ingesloten en materialen die ermee interageren, moeten onmiddellijk worden ontsmet (d.w.z. kooiwas), waardoor blootstelling van de geur aan andere dieren wordt voorkomen.

6. Temperatuurtesten - thuiskooi

OPMERKING: Dieren moeten gewend zijn aan de hele testprocedure, met uitzondering van experimentele contextuele of farmacologische stimuli. Dit moet minimaal 4x worden voltooid voordat u gaat testen.

  1. Breng de dieren over naar de voorbereide testruimte. Plaats de dieren op een vooraf toegewezen plaats op de riser. Deze locatie moet hetzelfde zijn tijdens alle gewennings- en testprocedures.
  2. Verwijder de "thuiskooibal" uit de thuiskooi van de muis en bedek de kooien opnieuw met een doek of chirurgisch laken. Laat de muizen 1-2 uur wennen aan de testruimte.
  3. Nadat de acclimatisatie is voltooid, gebruikt u de scanner om de basistemperatuur van elk onderwerp te meten en vast te leggen. Vermijd het manipuleren van de stoffen bekleding tijdens de metingen.
    OPMERKING: Farmacologische middelen kunnen hier worden toegepast. Wachttijd na injectie of toepassing kan indien nodig worden toegevoegd voordat u gaat testen. Het registreren van een secundaire uitgangswaarde direct voor het testen wordt aanbevolen na de toevoeging van een farmacologisch agens om de respons op farmacologische stimuli te controleren. Als de geurrespons niet wordt getest, kunnen de temperatuurmetingen van de muizen direct na de injectie beginnen. Randomisatie moet worden gebruikt bij het verstrekken van stimuli.
  4. Leg de kooi bloot en plaats de theebal (control of PO) op de vloer van de thuiskooi. Vervang het deksel van de kooi en de doekbedekking.
  5. Begin de stopwatch. Meet de temperaturen van de proefpersonen in dezelfde volgorde van theebalplaatsing. Registreer temperaturen en kloktijd van metingen volgens de gewenste tijdstippen.
  6. Wanneer het experiment is voltooid, verwijdert u de behandelingsbal. Plaats de muizen die PO hebben gekregen in een nieuwe thuiskooi met de originele "thuiskooibal". Breng de "thuiskooibal" terug naar de kooi van de muizen die controlegeur hebben ontvangen. Breng de muizen over naar de huisvestingslocatie.
    OPMERKING: De bovenstaande procedure kan worden vertaald naar rattenmodellen in kooien van de juiste grootte. Aanpassingen van de in figuur 1C voorgestelde metingen kunnen nodig zijn om een betere toegang tot de bodem van de thuiskooi mogelijk te maken.

figure-protocol-1
Figuur 1: Temperatuurtesten van transponders en thuiskooien. (A) Diagram van unilaterale transponderplaatsing voor het testen van de temperatuur in een gastrocnemius van een muis. Eenmaal geprogrammeerd en geplaatst, kan de transponderlezer (DAS-8027-IUS, getoond) worden gebruikt om de temperatuur te meten. (B) Links, foto van een open gaas roestvrijstalen theebal en een handdoek van 5 cm x 5 cm. Rechts, ingesloten theebal, gebruikt om gewennings- en geurhanddoeken vast te houden in het testen van thuiskooien. (C) Schema van risers geconstrueerd met PVC-leidingen voor het testen van thuiskooien. (D) Workflow van het testprotocol voor thuiskooien. (E) Beelden van de faciliteit van het testgebied van de thuiskooi. Links vier muizenkooien bovenop een riser. Magneetstrips bevinden zich op de aangrenzende muur en magneten en chirurgisch doek liggen op tafel. Rechts, bedekte muizenkooien op stijgers. (A), (C) en (D) zijn gemaakt met Biorender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

7. Temperatuurtesten - loopband lopen

  1. Wijs elk dier een loopband toe als hun toegewezen locatie voor gewennings- en testprocedures.
  2. Bereid de loopbanden voor op testen en zorg ervoor dat de shockers functioneel zijn.
    OPMERKING: Voor loopbandlopen moeten loopbanden worden ingesteld op het laagst beschikbare tempo dat continue beweging bevordert, maar niet hardlopen voor zowel gewenning als testen. Voor de 1012M-2 Modular Enclosed Metabolic Treadmill is dit 5,2 m/min voor muizen en 7 m/min voor ratten. Dit tempo moet mogelijk worden aangepast op basis van de obesitas van het onderwerp. Shockers moeten worden ingesteld op een intensiteit en herhalingsfrequentie van 5,0.
  3. Gewenning
    1. Verplaats de muizen naar de testruimte. Laat muizen 1-2 uur wennen aan de kameroverdracht in hun thuiskooien.
    2. Na het acclimatiseren, begeleid de muizen naar de opening van hun toegewezen loopband en sluit de loopband. Start de riem, shocker en stopwatch.
    3. Laat de muizen 15 minuten op de loopbanden lopen, met schokprikkel als motivatie voor beweging. Stop de test onmiddellijk als een dier gedurende een langere periode op een actieve shocker blijft.
    4. Verwijder na de test de muizen en breng ze terug naar de thuiskooien.
    5. Reinig de loopbanden met vloeibaar wasmiddel en water.
  4. Testing
    1. Verplaats de muizen naar de testruimte. Laat de muizen 1-2 uur wennen aan de kameroverdracht in hun thuiskooien.
    2. Meet en registreer de basislijntemperatuur voordat u de muis naar de loopband verplaatst.
      OPMERKING: Voor tests met farmacologische middelen, breng of injecteer ze hier, volgens het schema in figuur 2A. Wachttijd na injectie kan indien nodig worden toegevoegd voordat de muizen op de loopband worden geplaatst. Randomisatie moet worden gebruikt bij het verstrekken van stimuli.
    3. Plaats 5 cm x 5 cm vierkanten controle- of PO-handdoeken in de loopband die zich het dichtst bij de voorkant van de loopband bevindt. Bevestig de handdoeken aan het plafond van de loopband of eronder voor eenvoudige plaatsing en verwijdering.
    4. Leid de muizen naar de toegewezen loopband. Zet de loopbandriem en shocker aan.
    5. Start de stopwatch. Meet de proefpersonen in dezelfde volgorde als waarin de muizen in de loopbanden zijn opgesteld. Noteer de temperaturen en kloktijd van de metingen volgens de gewenste tijdstippen.
      OPMERKING: De temperatuur kan betrouwbaar worden gemeten van buiten de loopband terwijl een muis zich tijdens het lopen in een afgesloten loopband bevindt. Voor ratten kunnen de beperkingen van de loopbandgrootte en de afstand van de transponderlezer vereisen dat een experimentator de achterkant van de loopband openhoudt om de lezer in de loopband te plaatsen, dichter bij het onderwerp.
    6. Wanneer de test is voltooid, schakelt u de shockers en loopbanden uit; breng de muizen terug naar hun thuiskooien. Breng de muizen over naar de huisvestingslocatie.
    7. Reinig de loopbanden met vloeibaar reinigingsmiddel en water, met bijzondere aandacht voor het verwijderen van eventuele resterende PO.
    8. Wanneer de experimenten zijn voltooid, euthanaseert u de dieren (bijvoorbeeld met behulp van CO 2-inademing) en bevestigt u visueel de transponderlocatie.

figure-protocol-2
Figuur 2: Activiteitsgestuurde temperatuurtesten. (A) Workflow van activiteitsgecontroleerde temperatuurtesten met een farmacologisch middel met behulp van loopbandlopen. (B) Afbeeldingen van faciliteiten van loopbanden. Links een afbeelding van de volledige opstelling van de apparatuur. Juist, een beter beeld van individuele loopbanden en shockers. (A) is gemaakt met Biorender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Transponders werden eenzijdig geïmplanteerd in de rechter gastrocnemius van tien 4-6 maanden oude, wild-type (WT) muizen gefokt uit de SF1-Cre stam (Tg(Nr5a1-cre)7Lowl/J, Strain #012462, C57BL/6J en FVB achtergronden; vrouwelijke N = 5; mannelijke N = 5). Na herstel werden de muizen gewend aan een thuiskooitemperatuurtestprocedure die geen contextuele stimulus (bijv. PO) bevatte. Temperatuurmetingen met behulp van een transponderstaf werden geregistreerd in hun behuizing en na overdracht naar de testlocatie. Muizen krege...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit temperatuurtestprotocol biedt het veld een mogelijkheid om de thermogenese van de skeletspieren direct te meten. Dit is van cruciaal belang omdat onderzoek zich verdiept in het identificeren van de mechanismen die ten grondslag liggen aan spierthermogenese33. De methode biedt twee kosteneffectieve protocollen voor het meten van de thermogenese van de skeletspieren onder contextuele en farmacologische omstandigheden. Dit protocol benadrukt het belang van zowel gewenning als acclimatisatie binne...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk wordt ondersteund door R15 DK097644 en R15 DK108668. We bedanken Dr. Chaitanya K Gavini en Dr. Megan Rich voor eerdere bijdragen en Dr. Stanley Dannemiller voor het waarborgen van onze naleving van de richtlijnen voor het gebruik van institutionele dieren. Een speciale dank aan Dr. Tim Bartness voor het leveren van het fundamentele onderzoek dat nodig is om deze methode en de bijbehorende studies te bouwen. De figuren 1A, C, D en figuur 2A zijn gemaakt met behulp van Biorender.com.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1012M-2 Modular Enclosed Metabolic Treadmill for Mice, 2 Lanes w/ ShockColumbus Instruments
1012R-2 Modular Enclosed Metabolic Treadmill for Rats, 2 Lanes w/ ShockColumbus Instruments
1-1/4 in. Ratcheting PVC CutterBrassCraft
1 mL SyringesFisher ScientificBD 309659
Betadine SwabsFisher Scientific19-898-945
Booster CoilBioMedic Data SystemsTransponder Accessoire
Electric ClippersAndis40 Ultraedge Clipper Blade
Flexible Mirror SheetsAmazonZelfklevende niet-glazen spiegeltegels
ForcepsFisher Scientific89259-940
Heating Pad
Induction Chamber (isoflurane)Kent ScientificVetFlo-07303.0 L Laaggeprijsde kamers voor traditionele verdamper
KetoprophenMed-Vet Intl.RXKETO-50
Magnetic StripsAmazon
MagnetsAmazonDIYMAG magnetische haken 40lbs
NeedlesMed-Vet Intl.26400
Neomycin/Polymixin/Bacitracin met Hydrocortison oogzalf, 3.5 gMed-Vet Intl.RXNPB-HC
Oasis absorbeerbare hechtingMed-Vet Intl.MV-H821-V
Predator (Fret) geurhanddoekenMarshall BioResources
PVC-buis
Reflex Wound Clip RemoverCellPoint Scientific
Reflex Wound Clip, 7 mm (muis)CellPoint Scientific
Reflex Wound Clip, 9 mm (rat)CellPoint Scientific
Srerile Autoclip, 7 mm (muis)CellPoint ScientificWondclip-applicateur (muis)
Roestvrij staalfilter Interval Seasonings Thee-infuusAmazon
Steriel Autoclip, 9 mm (rat)CellPoint ScientificWondclip-applicateur (rat)
Steriele zoutoplossingMed-Vet Intl.RX0.9NACL-10
Chirurgische schaarFisher Scientific08-951-5
Chirurgische lakens
Handdoeken (Controle/Habituatie)Amazon100% katoenen handdoeken, wit
TranspondersBioMedic Data SystemsModel: IPTT-300
TransponderlezerBioMedic Data SystemsModel: DAS-8027-IUS/ DAS-7007R
VersacleanFisher Scientific18-200-700vloeibaar wasmiddel
Webcol Alcohol PrepsCovidien22-246-073 
Wedge stukken voor PVC-buis

Referenties

  1. Periasamy, M., Herrera, J. L., Reis, F. C. G. Skeletal muscle thermogenesis and its role in whole body energy metabolism. Diabetes Metabolism Journal. 41 (5), 327-336 (2017).
  2. Rowland, L. A., Bal, N. C., Periasamy, M. The role of skeletal-muscle-based thermogenic mechanisms in vertebrate endothermy. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 90 (4), 1279-1297 (2015).
  3. Maurya, S. K., et al. Sarcolipin is a key determinant of the basal metabolic rate, and its overexpression enhances energy expenditure and resistance against diet-induced obesity. Journal of Biological Chemistry. 290 (17), 10840-10849 (2015).
  4. Grigg, G., et al. Whole-body endothermy: Ancient, homologous and widespread among the ancestors of mammals, birds and crocodylians. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 97 (2), 766-801 (2022).
  5. Franck, J. P. C., Slight-Simcoe, E., Wegner, N. C. Endothermy in the smalleye opah (Lampris incognitus): A potential role for the uncoupling protein sarcolipin. Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Molecular & Integrative Physiology. 233, 48-52 (2019).
  6. Nowack, J., et al. Muscle nonshivering thermogenesis in a feral mammal. Scientific Reports. 9, 6378(2019).
  7. Oliver, S. R., Anderson, K. J., Hunstiger, M. M., Andrews, M. T. Turning down the heat: Down-regulation of sarcolipin in a hibernating mammal. Neuroscience Letters. 696, 13-19 (2019).
  8. Gorrell, E., et al. Skeletal muscle thermogenesis induction by exposure to predator odor. The Journal of Experimental Biology. 223, Pt 8 (2020).
  9. Gavini, C. K., et al. Leanness and heightened nonresting energy expenditure: Role of skeletal muscle activity thermogenesis. The American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 306 (6), 635-647 (2014).
  10. Almundarij, T. I., Gavini, C. K., Novak, C. M. Suppressed sympathetic outflow to skeletal muscle, muscle thermogenesis, and activity energy expenditure with calorie restriction. Physiological Reports. 5 (4), 13171(2017).
  11. Harshaw, C., Lanzkowsky, J., Tran, A. D., Bradley, A. R., Jaime, M. Oxytocin and 'social hyperthermia': Interaction with beta3-adrenergic receptor-mediated thermogenesis and significance for the expression of social behavior in male and female mice. Hormones and Behavior. 131, 104981(2021).
  12. Caldwell, H. K. Oxytocin and vasopressin: Powerful regulators of social behavior. The Neuroscientist. 23 (5), 517-528 (2017).
  13. Harshaw, C., Leffel, J. K., Alberts, J. R. Oxytocin and the warm outer glow: Thermoregulatory deficits cause huddling abnormalities in oxytocin-deficient mouse pups. Hormones and Behavior. 98, 145-158 (2018).
  14. Gavini, C. K., Britton, S. L., Koch, L. G., Novak, C. M. Inherently lean rats have enhanced activity and skeletal muscle response to central melanocortin receptors. Obesity. 26 (5), 885-894 (2018).
  15. Gavini, C. K., Jones, W. C., Novak, C. M. Ventromedial hypothalamic melanocortin receptor activation: regulation of activity energy expenditure and skeletal muscle thermogenesis. The Journal of Physiology. 594 (18), 5285-5301 (2016).
  16. Zaretsky, D. V., Romanovsky, A. A., Zaretskaia, M. V., Molkov, Y. I. Tissue oxidative metabolism can increase the difference between local temperature and arterial blood temperature by up to 1.3(o)C: Implications for brain, brown adipose tissue, and muscle physiology. Temperature. 5 (1), 22-35 (2018).
  17. Yoo, Y., et al. Exercise activates compensatory thermoregulatory reaction in rats: A modeling study. Journal of Applied Physiology. 119 (12), 1400-1410 (2015).
  18. Langer, F., Fietz, J. Ways to measure body temperature in the field. Journal of Thermal Biology. 42, 46-51 (2014).
  19. Pence, S., et al. Central apolipoprotein A-IV stimulates thermogenesis in brown adipose tissue. International Journal of Molecular Sciences. 22 (3), 1221(2021).
  20. Li, D., et al. Homeostatic disturbance of thermoregulatory functions in rats with chronic fatigue. Journal of Neuroscience Research. 165, 45-50 (2021).
  21. Carlier, J., et al. Pharmacodynamic effects, pharmacokinetics, and metabolism of the synthetic cannabinoid AM-2201 in male rats. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 367 (3), 543-550 (2018).
  22. Pato, A. M., Romero, D. M., Sosa Holt, C. S., Nemirovsky, S. I., Wolansky, M. J. Use of subcutaneous transponders to monitor body temperature in laboratory rats. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 114, 107145(2022).
  23. Almeida, D. L., et al. Lean in one way, in obesity another: Effects of moderate exercise in brown adipose tissue of early overfed male Wistar rats. International Journal of Obesity. 46 (1), 137-143 (2022).
  24. Brito, M. N., Brito, N. A., Baro, D. J., Song, C. K., Bartness, T. J. Differential activation of the sympathetic innervation of adipose tissues by melanocortin receptor stimulation. Endocrinology. 148 (11), 5339-5347 (2007).
  25. Vaughan, C. H., Shrestha, Y. B., Bartness, T. J. Characterization of a novel melanocortin receptor-containing node in the SNS outflow circuitry to brown adipose tissue involved in thermogenesis. Brain Research. 1411, 17-27 (2011).
  26. Kort, W. J., Hekking-Weijma, J. M., TenKate, M. T., Sorm, V., VanStrik, R. A microchip implant system as a method to determine body temperature of terminally ill rats and mice. Laboratory Animals. 32 (3), 260-269 (1998).
  27. Mei, J., et al. Body temperature measurement in mice during acute illness: Implantable temperature transponder versus surface infrared thermometry. Scientific Reports. 8, 3526(2018).
  28. Warn, P. A., et al. Infrared body temperature measurement of mice as an early predictor of death in experimental fungal infections. Laboratory Animals. 37 (2), 126-131 (2003).
  29. Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 32 (1), 77-88 (1988).
  30. Fiebig, K., Jourdan, T., Kock, M. H., Merle, R., Thone-Reineke, C. Evaluation of infrared thermography for temperature measurement in adult male NMRI nude mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 57 (6), 715-724 (2018).
  31. Franco, N. H., Geros, A., Oliveira, L., Olsson, I. A. S., Aguiar, P. ThermoLabAnimal - A high-throughput analysis software for non-invasive thermal assessment of laboratory mice. Physiology & Behavior. 207, 113-121 (2019).
  32. Koganti, S. R., et al. Disruption of KATP channel expression in skeletal muscle by targeted oligonucleotide delivery promotes activity-linked thermogenesis. Molecular Therapy. 23 (4), 707-716 (2015).
  33. Bal, N. C., Periasamy, M. Uncoupling of sarcoendoplasmic reticulum calcium ATPase pump activity by sarcolipin as the basis for muscle non-shivering thermogenesis. Philosophical Transactions of the Royal Society B. 375 (1793), 20190135(2020).
  34. Hicks, C., et al. Body temperature and cardiac changes induced by peripherally administered oxytocin, vasopressin and the non-peptide oxytocin receptor agonist WAY 267,464: a biotelemetry study in rats. British Journal of Pharmacology. 171 (11), 2868-2887 (2014).
  35. Kasahara, Y., et al. Oxytocin receptor in the hypothalamus is sufficient to rescue normal thermoregulatory function in male oxytocin receptor knockout mice. Endocrinology. 154 (11), 4305-4315 (2013).
  36. Kasahara, Y., et al. Role of the oxytocin receptor expressed in the rostral medullary raphe in thermoregulation during cold conditions. Frontiers in Endocrinology. 6, 180(2015).
  37. Yuan, J., Zhang, R., Wu, R., Gu, Y., Lu, Y. The effects of oxytocin to rectify metabolic dysfunction in obese mice are associated with increased thermogenesis. Molecular and Cellular Endocrinology. 514, 110903(2020).
  38. Scholl, J. L., Afzal, A., Fox, L. C., Watt, M. J., Forster, G. L. Sex differences in anxiety-like behaviors in rats. Physiology & Behavior. 211, 112670(2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Meting van spiertemperatuurtemperatuurtranspondersspiertemperatuur bij muizenspiertemperatuur bij rattenfarmacologische stimulatiepredatorgeurstimulusloopbandactiviteitsympathisch zenuwstelselthermogene controle van spieren
Het meten van de thermogenese van de skeletspieren bij muizen en ratten
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.