Door de mens geïnduceerde pluripotente van stamcellen afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CM's) zijn naar voren gekomen als een veelbelovend in vitro model voor door geneesmiddelen geïnduceerde cardiotoxiciteitsscreening en ziektemodellering. Hier beschrijven we een protocol voor het meten van de contractiliteit en elektrofysiologie van hiPSC-CM's.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Technische toepassingen van micro-elektrode array en patchklemopnamen op door mensen geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Geneesmiddel-geïnduceerde cardiotoxiciteit is de belangrijkste oorzaak van drugsverloop en terugtrekking uit de markt. Daarom is het gebruik van geschikte preklinische cardiale veiligheidsbeoordelingsmodellen een cruciale stap tijdens de ontwikkeling van geneesmiddelen. Momenteel is de beoordeling van de cardiale veiligheid nog steeds sterk afhankelijk van dierstudies. Diermodellen worden echter geplaagd door een slechte translationele specificiteit voor mensen als gevolg van soortspecifieke verschillen, met name in termen van cardiale elektrofysiologische kenmerken. Er is dus dringend behoefte aan de ontwikkeling van een betrouwbaar, efficiënt en op mensen gebaseerd model voor preklinische cardiale veiligheidsbeoordeling. Door de mens geïnduceerde pluripotente van stamcellen afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CMs) zijn naar voren gekomen als een waardevol in vitro model voor door geneesmiddelen geïnduceerde cardiotoxiciteitsscreening en ziektemodellering. hiPSC-CMs kunnen worden verkregen van personen met verschillende genetische achtergronden en verschillende zieke aandoeningen, waardoor ze een ideaal surrogaat zijn om door geneesmiddelen geïnduceerde cardiotoxiciteit individueel te beoordelen. Daarom moeten methodologieën worden vastgesteld om de functionele kenmerken van hiPSC-CMs uitgebreid te onderzoeken. In dit protocol beschrijven we verschillende functionele assays die kunnen worden beoordeeld op hiPSC-CM's, waaronder de meting van contractiliteit, veldpotentiaal, actiepotentiaal en calciumbehandeling. Over het algemeen heeft de integratie van hiPSC-CM's in preklinische cardiale veiligheidsbeoordeling het potentieel om een revolutie teweeg te brengen in de ontwikkeling van geneesmiddelen.
Inleiding
De ontwikkeling van geneesmiddelen is een lang en duur proces. Een studie van nieuwe therapeutische geneesmiddelen goedgekeurd door de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) tussen 2009 en 2018 meldde dat de geschatte mediane kosten van gekapitaliseerd onderzoek en klinische proeven $ 985 miljoen per productbedroegen 1. Geneesmiddel-geïnduceerde cardiotoxiciteit is de belangrijkste oorzaak van drugsverloop en terugtrekking uit de markt2. Met name cardiotoxiciteit wordt gemeld onder meerdere klassen van therapeutische geneesmiddelen3. Daarom is cardiale veiligheidsbeoordeling een cruciaal o....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Voorbereiding van media en oplossingen
- Bereid hiPSC-CM onderhoudsmedium voor door een fles van 10 ml van 50x B27-supplement en 500 ml RPMI 1640-medium te mengen. Bewaar het medium bij 4 °C en gebruik het binnen een maand. Breng het medium voor gebruik in evenwicht tot kamertemperatuur (RT).
- Bereid hiPSC-CM zaaimedium door 20 ml serumvervanging en 180 ml hiPSC-CM onderhoudsmedium (10% verdunning, v/v) te mengen. Hoewel vers bereid zaaimedium de voorkeur heeft, kan het niet langer dan 2 weken bij 4 °C worden bewaard. Breng het medium voor gebruik in evenwicht met RT.
- Bereid extracellulaire matrixcoatingoplossing door één....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Dit protocol beschrijft hoe de contractiebeweging, veldpotentiaal, actiepotentiaal en Ca2+ transiënt van hiPSC-CMs kunnen worden gemeten. Een schematisch diagram met de enzymatische spijsvertering, celzaaiing, onderhoud en functionele testgeleiding is weergegeven in figuur 1. De vorming van de hiPSC-CM monolaag is noodzakelijk voor de contractiebewegingsmeting (figuur 2B). Een representatief spoor van de contractie-relaxatiebeweging van hiPSC-CMs is w.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Menselijke iPSC-technologie is naar voren gekomen als een krachtig platform voor ziektemodellering en medicijnscreening. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het meten van hiPSC-CM contractiliteit, veldpotentiaal, actiepotentiaal en Ca2+ transiënt. Dit protocol biedt een uitgebreide karakterisering van hiPSC-CM contractiliteit en elektrofysiologie. Deze functionele assays zijn toegepast in meerdere publicaties van onze groep 12,13,18,24,25,26,27.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
J.C.W. is mede-oprichter van Greenstone Biosciences, maar heeft geen concurrerende belangen, omdat het hier gepresenteerde werk volledig onafhankelijk is. De andere auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.
Dankbetuigingen
We bedanken Blake Wu voor het proeflezen van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) R01 HL113006, R01 HL141371, R01 HL163680, R01 HL141851, U01FD005978 en NASA NNX16A069A (JCW) en AHA Postdoctoral Fellowship 872244 (GMP).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 35 mm glass bottom dish with 20 mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | D35-20-1.5-N | Patch clamp |
| 50x B27 supplements | Life Technologies | 17504-044 | hiPSC-CM cultuurmedium |
| 6-well culture plate | E & K Scientific | EK-27160 | hiPSC-CM-cultuur |
| 96-well flat clear bottom black polystyrene TC-treated microplates | Corning | 3603 | Contractiebewegingsmeting |
| Accutase | Sigma-Aldrich | A6964 | Enzymatische dissociatie |
| Axion's Integrated Studio (AxIS) | Axion Biosystems | navigator-software | |
| Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | BF 100-50-10, | Patch clamp |
| CaCl2 1 M in H2O | Sigma-Aldrich | 21115 | Tyrode’s oplossing |
| Cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | Celtelling |
| CytoView 48-well MEA plates | Axion Biosystems | M768-tMEA-48B | MEA |
| DMEM/F12 | Gibco/Life Technologies | 12634028 | Extracellulair matrixmedium |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | 14-190-250 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | Intracellulaire pipettoplossing |
| EPC 10 USB patch clamp amplifier | Warner Instruments | 89-5000 | Patch clamp |
| Fura-2, AM, cell permeant | ThermoFisher Scientific | F1221 | Ca2+ transientmeting |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Tyrode’s oplossing |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Tyrode’s oplossing |
| hiPSCs | Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank | ||
| KCl | Sigma-Aldrich | 529552 | Tyrode’s oplossing |
| KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher Scientific | 10828-028 | hiPSC-CM-zaaimedium |
| KOH 8 M | Sigma-Aldrich | P4494 | Intracellulaire pipettoplossing |
| Lambda DG 4 | Sutter Instrument Company | Ca2+ transientmeting; ultrasnel golflengteschakelingslichtbron | |
| Luna-FL automated fluorescence cell counter | WISBIOMED | LB-L20001 | Celtelling |
| Maestro Pro MEA system | Axion Biosystems | MEA | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | Extracellulair matrixmedium |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Intracellulaire pipettoplossing |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Tyrode’s oplossing |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | Tyrode’s oplossing |
| NaOH 10 M | Sigma-Aldrich | 72068 | Tyrode’s oplossing |
| NIS Elements AR | |||
| Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO) | ThermoFisher Scientific | P3000MP | Ca2+ transientmeting |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 11875-119 | hiPSC-CM-cultuurmedium |
| Sony SI8000 Cell Motion Imaging System | Sony Biotechnology | Contractiebewegingsmeting | |
| Sutter Micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | Patch clamp |
| Trypan blue stain | Life Technologies | T10282 | Celtelling |
Referenties
- Wouters, O. J., McKee, M., Luyten, J. Estimated research and development investment needed to bring a new medicine to market, 2009-2018. Journal of the American Medical Association. 323 (9), 844-853 (2020).
- Pang, L., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
