Technische toepassingen van micro-elektrode array en patchklemopnamen op door mensen geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten

Summary

Door de mens geïnduceerde pluripotente van stamcellen afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CM's) zijn naar voren gekomen als een veelbelovend in vitro model voor door geneesmiddelen geïnduceerde cardiotoxiciteitsscreening en ziektemodellering. Hier beschrijven we een protocol voor het meten van de contractiliteit en elektrofysiologie van hiPSC-CM's.

Abstract

Geneesmiddel-geïnduceerde cardiotoxiciteit is de belangrijkste oorzaak van drugsverloop en terugtrekking uit de markt. Daarom is het gebruik van geschikte preklinische cardiale veiligheidsbeoordelingsmodellen een cruciale stap tijdens de ontwikkeling van geneesmiddelen. Momenteel is de beoordeling van de cardiale veiligheid nog steeds sterk afhankelijk van dierstudies. Diermodellen worden echter geplaagd door een slechte translationele specificiteit voor mensen als gevolg van soortspecifieke verschillen, met name in termen van cardiale elektrofysiologische kenmerken. Er is dus dringend behoefte aan de ontwikkeling van een betrouwbaar, efficiënt en op mensen gebaseerd model voor preklinische cardiale veiligheidsbeoordeling. Door de mens geïnduceerde pluripotente van stamcellen afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CMs) zijn naar voren gekomen als een waardevol in vitro model voor door geneesmiddelen geïnduceerde cardiotoxiciteitsscreening en ziektemodellering. hiPSC-CMs kunnen worden verkregen van personen met verschillende genetische achtergronden en verschillende zieke aandoeningen, waardoor ze een ideaal surrogaat zijn om door geneesmiddelen geïnduceerde cardiotoxiciteit individueel te beoordelen. Daarom moeten methodologieën worden vastgesteld om de functionele kenmerken van hiPSC-CMs uitgebreid te onderzoeken. In dit protocol beschrijven we verschillende functionele assays die kunnen worden beoordeeld op hiPSC-CM's, waaronder de meting van contractiliteit, veldpotentiaal, actiepotentiaal en calciumbehandeling. Over het algemeen heeft de integratie van hiPSC-CM's in preklinische cardiale veiligheidsbeoordeling het potentieel om een revolutie teweeg te brengen in de ontwikkeling van geneesmiddelen.

Introduction

De ontwikkeling van geneesmiddelen is een lang en duur proces. Een studie van nieuwe therapeutische geneesmiddelen goedgekeurd door de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) tussen 2009 en 2018 meldde dat de geschatte mediane kosten van gekapitaliseerd onderzoek en klinische proeven $ 985 miljoen per product^{bedroegen 1}. Geneesmiddel-geïnduceerde cardiotoxiciteit is de belangrijkste oorzaak van drugsverloop en terugtrekking uit de markt². Met name cardiotoxiciteit wordt gemeld onder meerdere klassen van therapeutische geneesmiddelen³. Daarom is cardiale veiligheidsbeoordeling een cruciaal o....

Protocol

1. Voorbereiding van media en oplossingen

1. Bereid hiPSC-CM onderhoudsmedium voor door een fles van 10 ml van 50x B27-supplement en 500 ml RPMI 1640-medium te mengen. Bewaar het medium bij 4 °C en gebruik het binnen een maand. Breng het medium voor gebruik in evenwicht tot kamertemperatuur (RT).
2. Bereid hiPSC-CM zaaimedium door 20 ml serumvervanging en 180 ml hiPSC-CM onderhoudsmedium (10% verdunning, v/v) te mengen. Hoewel vers bereid zaaimedium de voorkeur heeft, kan het niet langer dan 2 weken bij 4 °C worden bewaard. Breng het medium voor gebruik in evenwicht met RT.
3. Bereid extracellulaire matrixcoatingoplossing door één....

Results

Dit protocol beschrijft hoe de contractiebeweging, veldpotentiaal, actiepotentiaal en Ca²⁺ transiënt van hiPSC-CMs kunnen worden gemeten. Een schematisch diagram met de enzymatische spijsvertering, celzaaiing, onderhoud en functionele testgeleiding is weergegeven in figuur 1. De vorming van de hiPSC-CM monolaag is noodzakelijk voor de contractiebewegingsmeting (figuur 2B). Een representatief spoor van de contractie-relaxatiebeweging van hiPSC-CMs is w.......

Discussion

Menselijke iPSC-technologie is naar voren gekomen als een krachtig platform voor ziektemodellering en medicijnscreening. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het meten van hiPSC-CM contractiliteit, veldpotentiaal, actiepotentiaal en Ca²⁺ transiënt. Dit protocol biedt een uitgebreide karakterisering van hiPSC-CM contractiliteit en elektrofysiologie. Deze functionele assays zijn toegepast in meerdere publicaties van onze groep 12,13,18,24,25,26,27.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm glass bottom dish with 20 mm micro-well #1.5 cover glass	Cellvis	D35-20-1.5-N	Patch clamp
50x B27 supplements	Life Technologies	17504-044	hiPSC-CM culture medium
6-well culture plate	E & K Scientific	EK-27160	hiPSC-CM culture
96-well flat clear bottom black polystyrene TC-treated microplates	Corning	3603	Contraction motion measurement
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964	Enzymatic dissociation
Axion's Integrated Studio (AxIS)	Axion Biosystems		navigator software
Borosilicate glass capillaries	Harvard Apparatus	BF 100-50-10,	Patch clamp
CaCl2 1 M in H2O	Sigma-Aldrich	21115	Tyrode’s solution
Cell counting chamber slides	ThermoFisher Scientific	C10228	Cell counting
CytoView 48-well MEA plates	Axion Biosystems	M768-tMEA-48B	MEA
DMEM/F12	Gibco/Life Technologies	12634028	Extracellular matrix medium
DPBS, no calcium, no magnesium	Fisher Scientific	14-190-250
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889	Intracellular pipette solution
EPC 10 USB patch clamp amplifier	Warner Instruments	89-5000	Patch clamp
Fura-2, AM, cell permeant	ThermoFisher Scientific	F1221	Ca2+ transient measurement
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Tyrode’s solution
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Tyrode’s solution
hiPSCs	Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank
KCl	Sigma-Aldrich	529552	Tyrode’s solution
KnockOut Serum Replacement	ThermoFisher Scientific	10828-028	hiPSC-CM seeding medium
KOH 8 M	Sigma-Aldrich	P4494	Intracellular pipette solution
Lambda DG 4	Sutter Instrument Company		Ca2+ transient measurement; ultra-high-speed wavelength switching light source
Luna-FL automated fluorescence cell counter	WISBIOMED	LB-L20001	Cell counting
Maestro Pro MEA system	Axion Biosystems		MEA
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix	Corning	356231	Extracellular matrix medium
MgATP	Sigma-Aldrich	A9187	Intracellular pipette solution
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	Tyrode’s solution
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888	Tyrode’s solution
NaOH 10 M	Sigma-Aldrich	72068	Tyrode’s solution
NIS Elements AR
Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO)	ThermoFisher Scientific	P3000MP	Ca2+ transient measurement
RPMI 1640 medium	Life Technologies	11875-119	hiPSC-CM culture medium
Sony SI8000 Cell Motion Imaging System	Sony Biotechnology		Contraction motion measurement
Sutter Micropipette puller	Sutter Instruments	P-97	Patch clamp
Trypan blue stain	Life Technologies	T10282	Cell counting