Absolute DNA-dichtheid in celkernen in kaart brengen met behulp van lokalisatiemicroscopie met één molecuul

Summary

Het huidige protocol beschrijft een methode voor het meten van absolute DNA-dichtheden in adherente celkernen met behulp van Voronoi-tessellatie van lokalisatiemicroscopiegegevens van één molecuul, bekend volume, genoomgrootte en celcyclusstadium.

Abstract

In de celkern bevinden stille genen zich over het algemeen in chromatinegebieden met een hoge dichtheid, heterochromatine genaamd, terwijl actieve genen meestal te vinden zijn op het grensvlak tussen chromatine en de interchromatineruimte die euchromatine wordt genoemd. Op dit moment is de karakterisering van eu- en heterochromatine meestal gebaseerd op epigenetische modificaties van histon-eiwitten langs de DNA-sequentie, terwijl er weinig bekend is over absolute DNA-dichtheden in de celkern en hun functionele implicaties. Modellen van de kern die uitsluitend gebaseerd zijn op biochemische gegevens en aannames over de aard van chromatine als polymeer verschillen nog steeds fundamenteel van beeldvormingsgegevens die worden gegenereerd door microscopie met hoge resolutie. Dit geeft aan dat er nog belangrijke structureel relevante informatie ontbreekt. We zijn van mening dat ruimtelijke beperkingen betrokken kunnen zijn bij genregulatie en hebben daarom een methode ontwikkeld die het mogelijk maakt om absolute DNA-dichtheden in celkernen van zoogdieren te meten door superresolutielokalisatiegegevens om te zetten in dichtheidskaarten op schaal door middel van Voronoi-vlakvulling.

Introduction

Sinds de begindagen van de celbiologie heeft de celkern - de zetel van genetische informatie - biologen gefascineerd. Na het toepassen van zelf ontwikkelde cytologische kleuringsmethoden, ontdekte Emil Heitz in 1928 anders, intens gekleurde gebieden in de celkern¹. Hij noemde de intenser gekleurde, dichte gebieden "heterochromatine", terwijl hij de minder sterk gekleurde, minder dichte gebieden "euchromatine" noemde. In de loop van de tijd werd duidelijk dat actieve genen zich meestal in euchromatine bevinden, terwijl dichtere gebieden rijk bleken te zijn aan repetitieve elementen en stille genen. De termen het....

Protocol

OPMERKING: Figuur 3 geeft een overzicht van de workflow die in dit gedeelte wordt beschreven. Zie de Tabel met materialen voor meer informatie over de reagentia, materialen, apparatuur en software die in dit protocol worden gebruikt. De code die voor deze publicatie is gebruikt, kan hier worden bekeken en gedownload: https://github.com/irradiator/Mapping-absolute-DNA-density-in-cell-nuclei-using-SMLM-microscopy.

1. Celcultuur

1. Kweek C3H10T1/2-, HFB- en HeLa-cellen in DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum bij 37 °C in een bevocht....

Results

De HeLa-kern die in figuur 5 wordt getoond, is gekozen uit de tabel die is gegenereerd door CellProfiler4.2.1 in sectie 3 om een geïntegreerde fluorescentie-intensiteit te hebben die dicht bij de eerste piek in het histogram in figuur 5 ligt en die kernen in de G_1-fase weergeeft. Gezien zijn kleine omvang en uitgesproken inwendige structuur, is het waarschijnlijk een vroege G_1-kern die nog bezig is met het .......

Discussion

Dit artikel schetst hoe absolute DNA-dichtheden in celkernen van zoogdieren kunnen worden gemeten met behulp van SMLM. Daarnaast hebben we laten zien hoe het stadium van de celcyclus van gekweekte cellen kan worden bepaald en hoe we deze informatie kunnen gebruiken om de hoeveelheid DNA te schatten die aanwezig is in een lichte optische ultradunne sectie. Ook in detail beschreven zijn de voorbereiding van aanhangende cellen voor fBALM SMLM-microscopie en hoe SMLM-gegevens kunnen worden v.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Culture
µ-Dish 35 mm, high Grid-500 Glass Bottom	Ibidi	81168
C3H 10T1/2	IMB (Niehrs Lab)
DMEM	ThermoFisher	12320032
dPBS	ThermoFisher	14190144
FBS	Life Technologies	16000-044
HeLa	Microscopy Core Facility (IMB)
HFB	IMB (Kubben Lab)
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
Nonessential Aminoacids and vitamins for HFB
Sodium Pyruvate	S8636
Sample Prep
Catalase	Merck	2593710
Glucose	ThermoFisher	241922500
Glucose Oxidase	Merck	49180
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
RNase Cocktail	ThermoFisher	AM2286
SYTOX Orange	ThermoFisher	S11368
TetraSpeck Fluorescent Microspheres Sampler Kit	ThermoFisher	T7284
Triton X-100	ThermoFisher	327372500
Software
BioFormats	OpenMicroscopy.org		open source software https://www.openmicroscopy.org/bio-formats/
CellProfiler v4.2.1	CellProfiler.org		open source software https://cellprofiler.org
FiJI	nih.gov		open source software https://imagej.net/software/fiji/?Downloads
LAND	nih.gov		open source software https://github.com/Jan-NM/LAND
MatLab 2021	Math Works		commercial software - requires "Image Processing Toolbox"
R v.4..0.3	r-project.org		open source software https://www.r-project.org
ThunderSTORM v1.3			open source software https://zitmen.github.io/thunderstorm/
Microscopes:
AF 7000	Leica
Leica GSD	Leica
SMLM Microscope	Cremer Lab		custom-built by Dr. S-Y. Chen