Absolute DNA-dichtheid in celkernen in kaart brengen met behulp van lokalisatiemicroscopie met één molecuul

Summary

Het huidige protocol beschrijft een methode voor het meten van absolute DNA-dichtheden in adherente celkernen met behulp van Voronoi-tessellatie van lokalisatiemicroscopiegegevens van één molecuul, bekend volume, genoomgrootte en celcyclusstadium.

Abstract

In de celkern bevinden stille genen zich over het algemeen in chromatinegebieden met een hoge dichtheid, heterochromatine genaamd, terwijl actieve genen meestal te vinden zijn op het grensvlak tussen chromatine en de interchromatineruimte die euchromatine wordt genoemd. Op dit moment is de karakterisering van eu- en heterochromatine meestal gebaseerd op epigenetische modificaties van histon-eiwitten langs de DNA-sequentie, terwijl er weinig bekend is over absolute DNA-dichtheden in de celkern en hun functionele implicaties. Modellen van de kern die uitsluitend gebaseerd zijn op biochemische gegevens en aannames over de aard van chromatine als polymeer verschillen nog steeds fundamenteel van beeldvormingsgegevens die worden gegenereerd door microscopie met hoge resolutie. Dit geeft aan dat er nog belangrijke structureel relevante informatie ontbreekt. We zijn van mening dat ruimtelijke beperkingen betrokken kunnen zijn bij genregulatie en hebben daarom een methode ontwikkeld die het mogelijk maakt om absolute DNA-dichtheden in celkernen van zoogdieren te meten door superresolutielokalisatiegegevens om te zetten in dichtheidskaarten op schaal door middel van Voronoi-vlakvulling.

Introduction

Sinds de begindagen van de celbiologie heeft de celkern - de zetel van genetische informatie - biologen gefascineerd. Na het toepassen van zelf ontwikkelde cytologische kleuringsmethoden, ontdekte Emil Heitz in 1928 anders, intens gekleurde gebieden in de celkern¹. Hij noemde de intenser gekleurde, dichte gebieden "heterochromatine", terwijl hij de minder sterk gekleurde, minder dichte gebieden "euchromatine" noemde. In de loop van de tijd werd duidelijk dat actieve genen zich meestal in euchromatine bevinden, terwijl dichtere gebieden rijk bleken te zijn aan repetitieve elementen en stille genen. De termen heterochromatine en euchromatine zijn tot op de dag van vandaag bewaard gebleven, hoewel hun definitie is veranderd van structurele naar moleculaire eigenschappen (zie hieronder). Tegenwoordig weten we dat de celkern is verdeeld in twee hoofdfasen. Eén vloeistof (het interchromatinecompartiment), waarin de nucleaire lichamen, het splitsingscompartiment en het nucleoplasma zijn ondergebracht, en de andere vaste, hydrogel-achtige chromatinedomein, die de chromosoomgebieden en de nucleoli² omvat. Op het grensvlak van de interchromatineruimte is chromatine minder dicht, en dit is waar meestal de genetisch actieve processen zoals transcriptie, replicatie en reparatie plaatsvinden ^3,4,5, terwijl naast de lamina, rond de nucleoli en in de buurt van de centromeren, chromatine hoge verdichtingsniveaus vertoont en over het algemeen transcriptioneel vrij inactief is⁶.

Op moleculair niveau wordt chromatine opgebouwd uit DNA dat rond nucleosomen is gewikkeld (een octameer van histon-eiwitten in de kern). De histonen bezitten intrinsiek ongeordende staartdomeinen die posttranslationeel kunnen worden gewijzigd door verschillende chemische groepen (methyl-, acetyl-, fosfor-, biotine), aminozuren (arginine) of zelfs eiwitten (SUMO, Ubiquitine) toe te ^voegen7. Deze modificaties kunnen worden gelezen en andere eiwitten aantrekken (bijv. chromatine-remodeler, HP1, reparatie-eiwitten, RNA) en daardoor de fysiologische toestand van de DNA-sequentie definiëren (transcriptioneel permissief/restrictief), zonder de sequentie direct te veranderen (dus "epi"genetisch)⁷. Het type en het aantal modificaties rond een specifieke sequentie kan sterk verschillen tussen celtypen, is omkeerbaar en kan veranderen tijdens ontwikkeling, veroudering en ziekte ^8,9,10. Er zijn modificaties van histonstaarten die vaker voorkomen in sterk getranscribeerde regio's en modificaties die overheersen in regio's van het genoom die weinig of geen transcriptieactiviteit hebben.

Sterk getranscribeerde gebieden die rijk zijn aan H3K4-modificaties of waarvan de histonstaarten geacetyleerd zijn, worden bijvoorbeeld meestal beschreven als euchromatine, terwijl gebieden die rijk zijn aan repressieve histonmodificaties (H3K9me3, H3K27me3 of H4K20me3) worden aangeduid als heterochromatine, dat verder wordt onderverdeeld in constitutief heterochromatine (transcriptioneel inactief in alle cellen) (bijv. H4K20me3) en facultatief heterochromatine (chromatine gedempt afhankelijk van het celtype, bijv. H3K27me3)⁶. Hoewel biochemische en moleculair biologische methoden zeer geschikt zijn voor het meten van chemische veranderingen op sequentieniveau, is het veel uitdagender om ze te gebruiken om met behulp van deze methoden uitspraken te doen over ruimtelijke eigenschappen op mesoschaal.

Er zijn bijvoorbeeld pogingen ondernomen om met behulp van nabijheidsinformatie uit Hi-C-experimenten, die nauwe nabijheden van DNA tussen sequentiegebieden detecteren en in kaart brengen, ruimtelijke modellen van het genoom¹¹ te reconstrueren. Uit een directe vergelijking met hoge-resolutiebeelden van licht en elektronenmicroscopie blijkt echter dat dit slechts in beperkte mate mogelijk is (Figuur 1). Hoewel methoden zoals Hi-C¹² chromosoomgebieden in interfasecellen correct kunnen detecteren als afzonderlijke entiteiten, zijn deze modellen nogal "bijziend", omdat DNA-sequentienabijheid alleen blind is om ruimtelijke relaties tussen verder weg gelegen delen van het genoom weer te geven en dus niet erg geschikt zijn voor een goede 3D-genoomreconstructie. Daarom kunnen dichtheidsverschillen ook niet goed worden weergegeven door informatie over de contactfrequentie. Dit leidt tot "spaghettified" representaties van het genoom in de kern (zie Figuur 1B), die lijken voor te komen in een bal van wolachtige, vrij toegankelijke lussen.

Om de weg vrij te maken voor een integratief, realistischer beeld van de kern dat biochemische informatie combineert met biofysische en structurele gegevens, moeten methoden worden ontwikkeld die het mogelijk maken om gegevens te genereren over verschillende aspecten van nucleaire organisatie. Tot voor kort was het ook moeilijk om absolute DNA-dichtheden in celkernen te bepalen op basis van beeldvormingsgegevens. De redenen hiervoor waren de beperkte resolutie van conventionele lichtmicroscopen, problemen in de elektronenmicroscopie om specifiek DNA te kleuren, en de kleine waarnemingsvolumes in de elektronenmicroscopie.

De resolutie van conventionele fluorescentiemicroscopen wordt beperkt door de diffractie van licht. Het beeld van een puntbron van licht wordt door de diffractielimiet uitgespreid en kan worden beschreven door de Point-Spread-Function (PSF). Volgens de PSF neemt het beeld van een fluorofoor, die bij benadering als een puntbron van licht kan worden beschouwd, een volume van een bepaalde grootte in beslag rond zijn oorsprongsbron (fluorofoor)¹³. Wanneer veel fluoroforen, die zich veel dichter bij elkaar bevinden dan de afmetingen van hun diffractiebeperkte afbeeldingen, tegelijkertijd worden geëxciteerd, worden de afgebeelde intensiteitsverdelingen over elkaar heen gelegd en kan de locatie van de afzonderlijke fluoroforen niet worden opgelost. Sequentiële, stochastische lichtemissie van fluoroforen (knipperend) maakt optische isolatie van individuele moleculen mogelijk en dus het vinden van hun exacte locaties door de intensiteit van de zwaartekrachtcentra van hun signalen te bepalen.

Dit kan worden gebruikt om structurele informatie van monsters te reconstrueren door de accumulatie van fluorofoorlokalisatiegegevens uit vele opgenomen beelden. Deze methode wordt over het algemeen single-molecule localization microscopy (SMLM) genoemd (voor meer informatie zie¹⁴). Hoe meer fotonen een fluorofoor uitzendt tijdens zijn 'on-time', hoe nauwkeuriger de intensiteit van de zwaartekrachtcentra kan worden bepaald. Astigmatische lenzen in het straalpad zetten signalen van fluoroforen boven of onder het optische brandpuntsvlak om in ellipsen, die kunnen worden gebruikt om hun positie langs de optische as te bepalen. De lange assen van de ellipsen die afkomstig zijn van fluorescerende signalen onder het brandvlak worden 90° gedraaid in vergelijking met de assen van de ellipsen die afkomstig zijn van fluoroforen boven het brandpuntsvlak. Verder maakt de asverhouding van deze ellipsen het mogelijk om de positie van het molecuul langs de optische as ten opzichte van het brandvlak te bepalen binnen een bereik van ±300 nm¹⁵.

De kwaliteit van superresolutiebeelden die worden gegenereerd door de reconstructie van stochastische knipperende gebeurtenissen hangt sterk af van de labeldichtheid en het aantal knipperende gebeurtenissen. Deze laatste zijn afhankelijk van de fotostabiliteit van de fluoroforen en het aantal knipperende gebeurtenissen voordat ze uiteindelijk falen (aantal aan/uit-cycli). De hier beschreven methode voor het verkrijgen van superresolutiebeelden van intranucleaire DNA-distributie wordt fBALM genoemd (DNA-structuur fluctuating-assisted binding-activated localization microscopy). Het is gebaseerd op fluoroforen die tijdelijk intercaleren tot nucleïnezuren en pas fluoresceren als ze aan het DNA zijn gebonden^16,17. Vanwege de geladen residuen van zijn fosfor-diester-ruggengraat is DNA een sterk negatief geladen polymeer. Stabilisatie van de complementaire DNA-strengen in levende cellen vereist neutralisatie door positief geladen eiwitten (bijv. histonen) en ionen. Door de pH te verlagen, wordt de stabiliteit van de complementaire paring van de basen verminderd, zodat intercalerende kleurstoffen in en uit kunnen diffunderen^16,17.

Afhankelijk van de intercalerende fluorescerende kleurstof kan deze toestand binnen een bepaald pH-bereik worden bereikt. Fluorescerende kleurstoffen zoals YoYo-1 en SYTOX Orange fluoresceren alleen wanneer ze aan DNA zijn gebonden en omdat intercalerende kleurstoffen (in tegenstelling tot kleurstoffen die de kleine groef van het DNA binden, zoals Hoechst en 4',6-diamidino-2-fenylindool [DAPI]) meestal op een sequentie-onafhankelijke manier binden, zijn ze zeer geschikt voor het in kaart brengen van de distributie van DNA in celkernen door middel van lokalisatiemicroscopie.

Voronoi-vlakvulling is een wiskundige methode die het mogelijk maakt om de ruimte op te delen in verschillende partities op basis van de locatie van de punten. In 2D-Space weerspiegelt de grootte van de resulterende tegels het omgekeerde van de dichtheid van punten¹⁸. Omdat lokalisatiemicroscopie beelden reconstrueert als een reeks punten die de locatie van fluoroforen weergeven, kan Voronoi-vlakvulling helpen bij het bepalen van de dichtheid van lokalisatiesignalen (Figuur 2). Het gebruik van een DNA-specifieke kleurstof als fluorofoor maakt het dus mogelijk om DNA-dichtheden te meten.

A priori kennis van het DNA-gehalte (aantal basenparen) en de ruimtelijke dimensie van de kern maakt het mogelijk om de relatieve DNA-dichtheden om te zetten in absolute DNA-dichtheden. Het volgende protocol toont het in kaart brengen van absolute DNA-dichtheden in adherente cellen met behulp van SMLM met een zeer hoge resolutie en toont aan dat deze dichtheden onderhevig zijn aan grote variaties.

Protocol

OPMERKING: Figuur 3 geeft een overzicht van de workflow die in dit gedeelte wordt beschreven. Zie de Tabel met materialen voor meer informatie over de reagentia, materialen, apparatuur en software die in dit protocol worden gebruikt. De code die voor deze publicatie is gebruikt, kan hier worden bekeken en gedownload: https://github.com/irradiator/Mapping-absolute-DNA-density-in-cell-nuclei-using-SMLM-microscopy.

1. Celcultuur

1. Kweek C3H10T1/2-, HFB- en HeLa-cellen in DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer aangevuld met 5% CO₂. Wanneer cellen dicht bij samenvloeiing zijn, subcultuur de cellen door ze te splitsen in een verhouding van respectievelijk 1:3 (C3H10T1/2, HFB) en 1:10 (HeLa).
2. Een dag voor het uitvoeren van de metingen zaait u de cellen van exponentieel groeiende culturen op een gerasterde schaal van 35 mm. Zorg ervoor dat de observatieschalen een uitstekende optische kwaliteit bieden voor fluorescentiemicroscopie (glazen bodem met een dikte van 170 μm, #1.5) en een raster hebben om cellen eenduidig te lokaliseren. Zorg er ook voor dat de cellen zich in een eencellige suspensie bevinden en dat het hele oppervlak van de schaal homogeen met cellen is bedekt.
   OPMERKING: Het wordt aanbevolen om schalen met een bedrukt raster te gebruiken om opnieuw de exacte cellen te vinden die aan een bepaald celcyclusstadium zijn toegewezen.
3. Voeg indien nodig voor het experiment 100 nM trichostatine A (TSA) toe aan het celkweekmedium en incubeer de cellen onder de omstandigheden die eerder zijn beschreven in stap 1.1.

2. Voorbereiding van het monster

1. Was de cellen op de dag van de meting één keer met 1x DPBS voordat u ze 30 minuten fixeert in 4% paraformaldehyde (PFA) in 1x DPBS.
   OPMERKING: Voor reproduceerbare resultaten moet u ervoor zorgen dat er elke keer een verse PFA-oplossing wordt bereid en moet u er speciaal op letten dat de PFA-concentratie nauwkeurig is.
2. Was de cellen na het verwijderen van het fixatief opnieuw 2x met 1x DPBS voordat u ze gedurende 20 minuten permeabiliseert in 1x DPBS met 0,4% Triton X-100.
3. Verwijder de permeabilisatiebuffer met een pipet en voer een extra wasstap uit met 1x DPBS voordat u de cellen behandelt met een RNase-cocktail (verdunning 1:1.000 in 1x DPBS). Plaats de cellen 30 minuten in een broedmachine bij 37 °C in een bevochtigde kamer.
4. Bereid de kleuringsoplossing voor door de fBALM-compatibele SYTOX Orange-stockoplossing te verdunnen (5 mM in 1x DPBS bij 1:10.000 verdunning).
5. Verwijder de RNase-buffer met behulp van een pipet en pas een extra wasstap toe met 1x DPBS voordat u de kleuroplossing toevoegt. Incubeer de cellen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur in een bevochtigde kamer.
6. Verwijder de SYTOX Orange-kleuroplossing van de cellen met een pipet, was met 1x DPBS en bewaar de cellen in 1x DPBS, beschermd tegen intens licht.

3. Bepaling van de cytometrische celcyclus

OPMERKING: Voor deze stap werd hier een omgekeerde screeningsmicroscoop met hoge inhoud gebruikt, maar elke geautomatiseerde, omgekeerde breedveldfluorescentiemicroscoop kan worden gebruikt. De intensiteit van de hele kern is een maat voor het DNA-gehalte; Zorg er daarom voor dat u het gaatje volledig opent als u een confocaal systeem gebruikt. Luchtobjectieven met een lage numerieke apertuur (NA) hebben de voorkeur boven objectieven met een onderdompeling in olie.

1. Plaats de schaal met de cellen op een inverse fluorescentiemicroscoop die is uitgerust met een gemotoriseerde tafel en software waarmee grote gebieden op het monster kunnen worden gereconstrueerd door automatisch opgenomen beelden aan elkaar te naaien.
2. Kies een objectieflens die het mogelijk maakt om voldoende cellen per gezichtsveld vast te leggen (ten minste 900 afzonderlijke kernen in totaal [voor details, zie Roukos et ^al.19]) zodat de beeldacquisitie voor de bepaling van de celcyclus binnen een redelijke termijn kan worden uitgevoerd. Gebruik een lens die geen grote verschillen in intensiteit vertoont tussen het centrum en de randen. Als een dergelijke lens niet beschikbaar is, past u een flat-field-correctie toe op de beelden (zie stap 7). Om dit protocol te volgen, gebruikt u een breedveldfluorescentiemicroscoop die is uitgerust met een 20x NA 0.4 luchtlens met een scherptediepte = 8 μm.
3. Bedek tijdens het verkrijgen van de afbeelding het centrale gedeelte van de schaal met behulp van geschikte filters voor de gebruikte fluorofoor. Maak helderveldfoto's in de modus voor doorvallend licht.
   OPMERKING: Brightfield-afbeeldingen zijn belangrijk voor het verplaatsen van cellen op het raster in stap 4.6.
4. Zet de schaal met de cellen in de koelkast bij 4 °C tot stap 4.4.
5. Reconstrueer het gescande gebied op basis van de afzonderlijke afbeeldingen door de opgenomen afzonderlijke afbeeldingen naast elkaar te leggen.
6. Breng de beeldgegevens van de fluorescerende DNA-kleuring over naar een computer waarop de open source-software CellProfiler4.2.1²⁰ draait.
7. Als een vlakveldcorrectie van de fluorescentiebeelden nodig is, genereer dan een referentiebeeld van de gebruikte microscoop op basis van de opgenomen beelden. Open de pijplijn Illumination Correction.cpproj (opgenomen als aanvullend bestand 1); Merk op dat de pijplijn als een reeks op het scherm verschijnt waarin op verschillende stappen kan worden geklikt. Sleep de afbeeldingen naar het aangewezen veld in de eerste stapafbeeldingen van de pijplijn.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat u alle niet-afbeeldingsgegevens in de vermelde bestanden uitsluit met behulp van de filteropties in het onderste deel van het venster.
8. Klik in de laatste stap van de verlichtingscorrectiepijplijn op Afbeeldingen opslaan om een locatie te definiëren waar de referentieafbeeldingen worden opgeslagen en klik vervolgens op de knop Afbeeldingen analyseren .
9. Open de pijplijn CellCycleAnalysis.cpproj (opgenomen als aanvullend bestand 2). Sleep de beelden die zijn opgenomen in stap 3.3 (zie afbeelding 4A als voorbeeld), inclusief de referentieafbeelding (stap 3.8), naar het daarvoor bestemde veld in de eerste stap Afbeeldingen van de pijplijn.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat u alle niet-afbeeldingsgegevens in de vermelde bestanden uitsluit met behulp van de filteropties in het onderste deel van het venster.
10. Kies in de stap CorrectIlluminationApply van de pijplijn de referentieafbeelding in het vervolgkeuzemenu door de functie Selecteer de verlichting te selecteren.
11. Definieer in de laatste stap van de pijplijn voor celcyclusanalyse een locatie waar het referentiebeeld is opgeslagen in stap 3.7 en klik op de knop Afbeeldingen analyseren om te beginnen met het bulksgewijs meten van de geïntegreerde fluorescentie-intensiteiten van alle kernen in de beelden die zijn opgenomen in stap 3.3.
    OPMERKING: CellProfiler4.2.1 genereert een tekstbestand "CellCycleAnalysis_Nuclei.txt", dat de gegevens van elke gemeten kern bevat (afbeelding, object-ID, geïntegreerde fluorescentie-intensiteit, afbeeldingscoördinaten) in CSV-indeling.
12. Zorg ervoor dat het element DisplayHistogram van de pijplijn is ingeschakeld als actief.
13. Noteer de geïntegreerde fluorescentie-intensiteiten in het histogram voor de pieken G₁ en G₂ (zie figuur 4B als voorbeeld) en voer de intervallen eromheen in de FilteredObjects-elementen van de pijplijn in. Activeer de pijplijnelementen door op de selectievakjes te klikken.
14. Activeer de bijbehorende DisplayDataOnImage-pijplijnelementen om een afbeelding te genereren die de cellen in fase G₁ of G₂ markeert en voer de pijplijn opnieuw uit (zie afbeelding 4C als voorbeeld).
15. Kies maximaal vijf cellen die de gewenste celcyclusfase vertegenwoordigen uit het gegenereerde beeld in het gemarkeerde gebied van de waarnemingskamer en probeer de cellen op de SMLM-microscoop te verplaatsen.
    OPMERKING: Aangezien hier twee cellijnen met een onbekende genoomgrootte worden gebruikt, werden de genoomgroottes bepaald door G 1-pieken van een menselijke fibroblastcellijn te vergelijken met de G_1-pieken van HeLa- en C3H10T1/2-cellen. De histogrammen en de proportionele relatie tussen hun genoomgroottes kunnen worden bekeken in aanvullende figuur S1.

4. SMLM-fBALSEM

OPMERKING: Hoewel de netto som van zuurstof in deze gecombineerde biochemische reacties nul is, wordt aanbevolen om de reactie uit te voeren in een schaal die niet is afgesloten, aangezien beperkte zuurstofconcentraties de productie van D-glucono-1,5-lacton kunnen vertragen. De toenemende concentratie van D-glucono-1,5-lacton verlaagt geleidelijk de pH, wat nodig is omdat een onmiddellijke verlaging van de pH de ultrastructuur van het monster zal veranderen.

1. Bereid 1 ml van de beeldvormingsbuffer voor door de volgende ingrediënten te mengen: 900 μl glucose (1 g/ml glucose in 1x DPBS), 50 μl glucose-oxidase (0,5 mg/ml in 1x DPBS) en 50 μl catalase (40 μg/ml in 1x DPBS).
2. Verwijder de 1x DPBS uit het monster met behulp van een pipet en voeg 1 ml van de beeldvormingsbuffer toe aan het schaaltje met de cellen.
3. Monteer de schaal op de tafel van een microscoop die geschikt is voor SMLM. Gebruik een hoge NA-objectieflens en een hoge optische vergroting.
4. Zoek een van de gekozen kernen (uit stap 3.15) met behulp van het coördinatensysteem van de schotel en centreer deze in het gezichtsveld van de camera.
   OPMERKING: De enzymatische reactie duurt ~60-180 minuten totdat de juiste pH voor de fBALM-methode is bereikt en het juiste knipperen mogelijk maakt. Het wordt aanbevolen om de observatieschotel zo snel mogelijk te monteren om het monster voldoende tijd te geven om zich aan te passen aan de temperatuur van het instrument, aangezien temperatuurveranderingen kunnen leiden tot axiale drift. Zorg ervoor dat de temperatuur in de ruimte waarin de SMLM-microscoop is ondergebracht, tijdens de meting stabiel is.
5. Bepaal de hoogte van de kern door de focus te veranderen met de z-drive van de microscoop en de positie van de boven- en ondergrenzen vast te leggen.
6. Controleer op verschillende tijdstippen of het knipperen goed is geproduceerd door het fBalm proces door het laservermogen te verhogen. Zodra het monster de juiste stochastische knippering vertoont, begint u met het verkrijgen van de beeldreeksen die nodig zijn voor de reconstructie van de superopgeloste SMLM.
   OPMERKING: De microscoop die voor fBALM wordt gebruikt, moet zijn uitgerust met excitatielasers die geschikt zijn om de gebruikte fluorofoor te exciteren en die voldoende hoge fotondichtheden kunnen genereren om voldoende fotontellingen per frame te garanderen. Test dit in een pilot-experiment voor alle andere experimenten.
7. Zodra het juiste knipperen van het fBalm proces is verzekerd, begint u met het verkrijgen van de beeldreeks met een belichtingstijd van 50 ms, wat resulteert in een framesnelheid van ~20 fps.
8. Neem een z-stack door de kern (rond het middengedeelte) met stapintervallen van 200 nm en slechts 500 frames per licht optisch gedeelte. Terug in het middengedeelte neemt u een beeldreeks van 50.000 frames om voldoende knipperende gebeurtenissen te verzamelen voor een goede reconstructie van structurele details met hoge lokalisatieprecisie (dit duurt ~45 min).
   OPMERKING: De z-stack is belangrijk om de fractie van het DNA-signaal van de middensectie te bepalen ten opzichte van de hele kern. Zorg ervoor dat de effectieve pixelgrootte goed geschikt is voor SMLM²² en dat het signaal op de camera de sensor niet verzadigt.
9. Zorg ervoor dat aan de volgende vereisten wordt voldaan
   1. Zorg ervoor dat de acquisitiecomputer voldoende schijfruimte bevat, want afhankelijk van het aantal en de grootte van 16-bits afbeeldingen kunnen de bestandsgroottes van de afbeeldingsstapels behoorlijk groot worden.
   2. Zorg ervoor dat de computer waarop de acquisitiesoftware draait, een bestandssysteem op het gebruikte opslagapparaat aankan dat grote bestandsgroottes (>4 GB) aankan en dat de overdrachtssnelheid naar het opslagapparaat voldoende hoog is om de bestanden in realtime te schrijven wanneer u beeldgegevens rechtstreeks op het opslagapparaat opneemt.
   3. Zorg er bij het opslaan van de gegevens na het verzamelen van afbeeldingen voor dat de computer is uitgerust met voldoende RAM (bijv. 64 GB).

5. Voorbereiden en opnemen van een schotel met fluorescerende kralen voor z-kalibratie van de SMLM-microscoop

OPMERKING: Voor een goede axiale kalibratie van de astigmatische lenzen van de microscoop om de juiste locaties langs de optische as toe te wijzen, moet worden overwogen om z-stacks van fluorescerende 100 nm-kralen op te nemen.

1. Verdun de kralen 1:10.000 in 1x DPBS en zaai de 100 nm kralen op hetzelfde type schaaltje dat je gebruikt hebt voor de SMLM-metingen.
   OPMERKING: Gebruik alleen de beste optische kwaliteit en specificaties zoals #1.5 dekglaasjes.
2. Monteer de kalibratieschotel op de microscoop; Neem beeldstapels op door het brandvlak van de kralen (~1,5 μm in totaal; hier worden stappen van 10 nm gebruikt)¹⁵.
3. Breng de gegevens over naar de gegevensanalysecomputer.
   OPMERKING: Bewaar en gebruik de kalibratiedia's niet voor lange tijd.

6. SMLM-gegevensverwerking

OPMERKING: De ImageJ^23-plug-in "ThunderSTORM"²⁴ werd gebruikt voor de registratie van de lokalisaties (bijv. conversie van de knipperende vlekken in de beeldstapel in een lijst met lokalisatiecoördinaten, framenummer, enz.). ImageJ of Fiji²⁵ draait op alle belangrijke desktopbesturingssystemen (Linux/Windows/macOS) en kan gratis worden gedownload en gebruikt.

1. Als u ThunderSTORM in FijI wilt gebruiken, moet u de updatesite van het Hohlbein Lab toevoegen onder HELP | bijwerken | Beheer updatesites, vink het selectievakje voor het Hohlbein Lab aan en start Fiji opnieuw op. Zorg ervoor dat het programma toegang heeft tot voldoende geheugen.
   OPMERKING: De afbeeldingsgegevens moeten in een bestandsformaat zijn dat kan worden gelezen door ImageJ/Fiji. Wanneer u de gegevens op een standaard commercieel systeem registreert, opent u de gegevens rechtstreeks met behulp van de Bio-Formats-plug-in voor ImageJ (die automatisch bij Fiji wordt geleverd). In dit geval werd een MATLAB-script h52tif.m (verstrekt op de GitHub-pagina die aan het begin van het protocol wordt genoemd) gebruikt om de gegevens die zijn opgenomen door onze aangepaste set-up te converteren van het hdf5-formaat naar het TIFF-formaat.
   1. Afhankelijk van de hoeveelheid geheugen die beschikbaar is op het gebruikte systeem en het aantal frames dat moet worden opgenomen, splitst u de gegevens op in verschillende substacks om te voorkomen dat u zonder geheugen komt te zitten.
      OPMERKING: Hieronder worden de instellingen gebruikt die zijn gebruikt voor het extraheren van de gegevens die in het resultatengedeelte worden weergegeven. Voor een meer gedetailleerde uitleg van de ThunderSTORM-instellingen raadpleegt u de ThunderSTORM-tutorials, die online te vinden zijn.
2. Optimaliseer de instellingen voor de detectie van knipperende signalen door de ThunderSTORM-instellingen aan te passen aan de gewenste opnameomstandigheden. Klik op ThunderSTORM | Voer Analyse uit, kies Camera-instelling en voer de juiste pixelgrootte van de beeldgegevens, het A/D-aantal, de kwantumefficiëntie van de gebruikte camera, het basisniveau en de EM-versterking in (voor deze opstelling pixelgrootte: 65 nm, A/D-telling: 0,64, kwantumefficiëntie: 0,8).
3. Kies vervolgens het algoritme om de lokalisatiecoördinaten te bepalen door de knipperende signalen aan te passen. Gebruik in het gedeelte Beeldfiltering het Wavelet-filter (B-Spline) met een B-Spline orde 3 en een B-Spline schaal 2.0. Stel voor de andere instellingen de methode Geschatte lokalisatie van moleculen in op Lokaal maximum, Drempel voor piekintensiteit op 2*std (Wave.F1) en Connectiviteit op 8-buurt. Kies in de sectie Subpixellokalisatie van moleculen PSF: Geïntegreerd Gaussiaans, Aanpasradius [px]: 3, Aanpasmethode: Maximale waarschijnlijkheid en Initiële sigma [px]: 1,6.
4. Voer de invoegtoepassing uit om een tabel te maken met een vermelding voor elke gedetecteerde lokalisatie en de eigenschappen ervan. Sla de tabel op de harde schijf op.
5. Als meerdere beeldstapels moeten worden geanalyseerd of als de afbeeldingsstapels moeten worden opgesplitst in verschillende stapels (bijvoorbeeld om de analyse van grote datasets mogelijk te maken of in het geval dat er niet veel geheugen in de gegevensanalysecomputer beschikbaar is), automatiseer dan de lokalisatiedetectie door een macro uit te voeren.
6. Als de acquisitiegegevens in meerdere afbeeldingsstapels moesten worden gepartitioneerd, kunt u de lokalisatietabellen in ThunderSTORM samenvoegen door het ene bestand na het andere te importeren. Zorg ervoor dat de optie Toevoegen aan huidige tabel in het menu Importeren is geactiveerd en dat het juiste startnummer wordt gebruikt om te voorkomen dat lokalisaties in de tabel worden overschreven.
7. Nadat de volledige lokalisatietabel is gegenereerd, controleert u het resultaat door de afbeelding te reconstrueren op basis van de locaties in de resultatentabel. Druk op de visualisatieknop in het resultatenvenster van ThunderSTORM en wacht tot de gereconstrueerde afbeelding (bijv. histogram van de lokalisaties) verschijnt.
8. Controleer het gereconstrueerde beeld op problemen zoals zijwaartse drift en andere beeldvormingsartefacten. Meet en corrigeer drift in het submenu Drift door de kruiscorrelatie van opgesomde subsecties van de gegevensstapel te bepalen (hier gebruikt) of door fiduciale markeringen in de steekproef te gebruiken. Nadat u op het menu >> hebt gedrukt, voert u 5 bakken en de vergrotingsfactor (6.5 in dit protocol) in. Wacht tot er een venster verschijnt met de x- en y-drift.
   OPMERKING: De eerste beelden na het opnemen kunnen nog steeds last hebben van een sterke achtergrondfluorescentie (terwijl de fluoroforen in de donkere toestand worden gebracht); daarom kan het nodig zijn om de eerste paar honderd afbeeldingen uit te sluiten van de analyse (typ bijvoorbeeld "frame >500" in het filterveld in het hoofdvenster van ThunderSTORM).
9. Om te voorkomen dat signalen die zichtbaar zijn over meerdere opeenvolgende frames worden overgeteld, past u samenvoeging toe op de lokalisatiegegevens met behulp van een straal die rekening houdt met de gemiddelde lokalisatieprecisie (20 nm hier), 1 donker frame en 0 maximale frames (geen beperking op de maximale aan-tijd van een molecuul).
10. Als alleen een dunne lichte optische ultradunne doorsnede moet worden geanalyseerd, sluit dan alle lokalisaties boven en onder het brandpuntsvlak uit van de dataset. Zoek eerst naar het punt in z dat de meeste lokalisatie bevat door op Plot Histogram te drukken in het venster met de resultatentabel en negeer vervolgens de lokalisaties 50 nm boven en onder dit punt met behulp van de filteropdracht:
    z > "histogram piek" - 50 & z < "histogram piek" + 50
11. Voor het bepalen van de DNA-fractie in het opgenomen gedeelte worden de lokalisaties in elk vlak van de beeldstapel (dikte 200 nm; 100 nm aan elke kant) bepaald die zijn vastgelegd in stap 4.7.1. Open de eerste tabel met lokalisatieresultaten van de stack door plug-ins te kiezen | Onweer | Importeren/exporteren | Importeer resultaten en filter elke opgenomen slice op 200 nm. Klik hiervoor op Toepassen na het typen in het filterveld:
    z > -100 & z < 100
12. Klik op Visualisatie en kies de optie Histogrammen om van elk segment een afbeelding te genereren. Sla de resulterende afbeelding op in een map in de TIFF-indeling. Sluit alle geopende afbeeldingen. Herhaal dit voor alle beeldvlakken.
13. Open alle segmenten en combineer ze met behulp van Afbeelding | Stapels | Afbeeldingen om te stapelen. Afbeelding kiezen | Stapels | Z-Project en kies de optie Som . Open de ROI Manager in ImageJ (Analyseren | Gereedschap | ROI-Manager); kies vervolgens de Gereedschap voor het selecteren van polygonen op de ImageJ-werkbalk in het hoofdvenster van ImageJ en schets de kern. Klik op Toevoegen in de ROI-Manager.
    1. Klik op Analyseren | Stel Metingen in en selecteer Geïntegreerde dichtheid. Klik op Analyseren | Meten. Open in ThunderSTORM de resultatentabel van het middenvlak zoals hierboven beschreven en filter deze op een dikte van 100 nm met behulp van de volgende opdracht in het filterveld:
       z > -50 & z < 50
14. Genereer een histogram van de gefilterde lokalisaties zoals hierboven beschreven, activeer de gedefinieerde ROI door deze te selecteren in de ROI Manager en klik op Analyseren | Meten.
15. Bepaal de fractie van de lokalisaties in de 100 nm dikke middensectie ten opzichte van het totale aantal lokalisaties door de gemeten geïntegreerde dichtheden te delen - de conversiefactor die nodig is in stap 8.2 voor het berekenen van de absolute DNA-dichtheden.
    OPMERKING: Het DNA-gehalte is evenredig met het aantal lokalisaties. Om de DNA-fractie in het afgebeelde superresolutiebeeld (middensectie) te schatten, is het daarom voldoende om het totale aantal lokalisaties in het volume van de hele kern te bepalen en om het totale aantal lokalisaties in de betreffende sectie te bepalen. Dit kan worden bereikt door 2D-histogrammen van de lokalisaties te genereren.

7. Z-kalibratie van de SMLM-microscoop

1. Open de beeldstapels die zijn opgenomen in sectie 5 in Fiji.
2. Selecteer in het menu van de ThunderSTORM-plug-in het submenu 3D-kalibratie | Cilindrische lens kalibratie.
3. Voer de stapgrootte in die wordt gebruikt om de kalibratiegegevens vast te leggen (10 nm) en definieer het gebied van de beeldstapel dat voor de kalibratie zal worden gebruikt.
4. Geef een locatie op om het kalibratiebestand op te slaan.
5. Gebruik de kalibratiegegevens in het dialoogvenster Analyse uitvoeren door PSF: Elliptisch Gaussiaans (3D-astigmatisme) te selecteren in het deelvenster Subpixellokalisatie van moleculen en het bestandspad aan te passen aan het kalibratiebestand dat in sectie 5 is gemaakt.

8. Voronoi Vlakvulling

OPMERKING: Zodra de lokalisatietabel is gegenereerd en verzorgd, gaat u verder met de laatste stap van de beeldanalyse: de Voronoi-vlakvulling. Gebruik MATLAB 2021 voor deze stap; de MATLAB-scripts maken deel uit van het softwarepakket "Localization Analyzer for Nanoscale Distributions" (LAND) en kunnen worden gedownload via de links in de Materiaaltabel. Net als bij het vastleggen van de gegevens en het genereren van de lokalisatietabel, is het belangrijk om een systeem te gebruiken dat goed is uitgerust met geheugen en verwerkingskracht. Het systeem dat werd gebruikt om de afbeeldingen voor deze publicatie te genereren, was uitgerust met 128 GB RAM en een 9-core Intel i9 CPU.

1. Converteer de ThunderSTORM-lokalisatietabel van het .csv-formaat naar het Orte-formaat door het MATLAB-script "TS2Orte.m" uit te voeren, dat de lokalisatietabel omzet in een MATLAB-matrix en opslaat in het ".mat"-formaat.
2. Zodra de gegevens het juiste formaat hebben, begint u met de voorbereidingen voor de Voronoi-vlakvulling en DNA-dichtheidsberekening. Bereken de conversiefactor door het aantal basenparen in de kern te delen door het relatieve aantal lokalisaties in de afgebeelde sectie ten opzichte van het volume (zie stap 6.15). Ga naar de map LAND-Voronoi en open in de submap /coreAlgorithm het bestand voronoiCluster.m en pas de conversiefactor aan voor de absolute dichtheidsberekeningen op regel 13.
   OPMERKING: Zie Figuur 5 voor een voorbeeld van de G₁ HeLa-kern; Er werd een omrekeningsfactor van 265 gemeten.
3. Bewerk het script dat de analyse "VonoRoi.m" start. Pas het bestandspad aan naar de Orte-lokalisatiegegevens en de uitvoermap voor de resultaatbestanden. Geef in de coördinatenlijst de coördinaten op die het gebied definiëren waarin de vlakvulling moet worden uitgevoerd. Aangezien het lang kan duren om de Voronoi-vlakvulling te berekenen (afhankelijk van de specificaties van de gebruikte machine), definieert u meerdere gebieden die moeten worden berekend binnen dezelfde invoergegevensset.
4. Nadat je het script hebt uitgevoerd, zoek je naar de afbeelding die de absolute DNA-dichtheden laat zien, samen met andere bestanden die grafieken bevatten die het histogram van de gebiedsverdeling laten zien en een "densities.mat"-bestand met de dichtheden van elke berekende Voronoi-cel in de uitvoermap.

Results

De HeLa-kern die in figuur 5 wordt getoond, is gekozen uit de tabel die is gegenereerd door CellProfiler4.2.1 in sectie 3 om een geïntegreerde fluorescentie-intensiteit te hebben die dicht bij de eerste piek in het histogram in figuur 5 ligt en die kernen in de G_1-fase weergeeft. Gezien zijn kleine omvang en uitgesproken inwendige structuur, is het waarschijnlijk een vroege G_1-kern die nog bezig is met het ...

Discussion

Dit artikel schetst hoe absolute DNA-dichtheden in celkernen van zoogdieren kunnen worden gemeten met behulp van SMLM. Daarnaast hebben we laten zien hoe het stadium van de celcyclus van gekweekte cellen kan worden bepaald en hoe we deze informatie kunnen gebruiken om de hoeveelheid DNA te schatten die aanwezig is in een lichte optische ultradunne sectie. Ook in detail beschreven zijn de voorbereiding van aanhangende cellen voor fBALM SMLM-microscopie en hoe SMLM-gegevens kunnen worden v...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Celcultuur
µ-Schaal 35 mm, hoge Grid-500 Glasbodem	Ibidi	81168
C3H 10T1/2	IMB (Niehrs Lab)
DMEM	ThermoFisher	12320032
dPBS	ThermoFisher	14190144
FBS	Life Technologies	16000-044
HeLa	Microscopy Core Facility (IMB)
HFB	IMB (Kubben Lab)
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
Niet-essentiële aminozuren en vitamines voor HFB
Natriumpyruvaat	S8636
Steekproefvoorbereiding
Catalase	Merck	2593710
Glucose	ThermoFisher	241922500
Glucose-oxidase	Merck	49180
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
RNase Cocktail	ThermoFisher	AM2286
SYTOX Orange	ThermoFisher	S11368
TetraSpeck Fluorescent Microspheres Sampler Kit	ThermoFisher	T7284
Triton X-100	ThermoFisher	327372500
Software
BioFormats	OpenMicroscopy.org		open source software https://www.openmicroscopy.org/bio-formats/
CellProfiler v4.2.1	CellProfiler.org		open source software https://cellprofiler.org
FiJI	nih.gov		open source software https://imagej.net/software/fiji/?Downloads
LAND	nih.gov		open source software https://github.com/Jan-NM/LAND
MatLab 2021	Math Works		commerciële software - vereist "Image Processing Toolbox"
R v.4..0.3	r-project.org		open source software https://www.r-project.org
ThunderSTORM v1.3			open source software https://zitmen.github.io/thunderstorm/
Microscopen:
AF 7000	Leica
Leica GSD	Leica
SMLM Microscoop	Cremer Lab		op maat gebouwd door Dr. S-Y. Chen