Methodenartikel

Real-time kwantitatieve meting van tumorcelmigratie en -invasie na synthetische mRNA-transfectie

2.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64274

⸱

23 juni 2023

 , 
1Children’s Mercy Research Institute, Children’s Mercy Kansas City, 2Department of Pediatrics, University of Missouri-Kansas City School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Veel opgereguleerde genen stimuleren de migratie en invasie van tumorcellen, wat leidt tot een slechte prognose. Het is van cruciaal belang om te bepalen welke genen de migratie en invasie van tumorcellen reguleren. Dit protocol presenteert een methode om de effecten van de verhoogde expressie van een gen op de migratie en invasie van tumorcellen in realtime te onderzoeken.

Samenvatting

Tumorcellen zijn zeer beweeglijk en invasief en vertonen veranderde genexpressiepatronen. Kennis van hoe veranderingen in genexpressie de migratie en invasie van tumorcellen reguleren, is essentieel voor het begrijpen van de mechanismen van tumorcelinfiltratie in naburige gezonde weefsels en metastase. Eerder werd aangetoond dat gen-knockdown, gevolgd door de impedantie-gebaseerde real-time meting van tumorcelmigratie en -invasie, de identificatie van de genen mogelijk maakt die nodig zijn voor tumorcelmigratie en -invasie. Onlangs hebben de mRNA-vaccins tegen SARS-CoV-2 de belangstelling voor het gebruik van synthetisch mRNA voor therapeutische doeleinden vergroot. Hier werd de methode met synthetisch mRNA herzien om het effect van genoverexpressie op de migratie en invasie van tumorcellen te bestuderen. Deze studie toont aan dat verhoogde genexpressie met synthetische mRNA-transfectie gevolgd door impedantie-gebaseerde real-time meting kan helpen bij het identificeren van de genen die de migratie en invasie van tumorcellen stimuleren. Dit methodedocument geeft belangrijke details over de procedures voor het onderzoeken van het effect van veranderde genexpressie op de migratie en invasie van tumorcellen.

Inleiding

De beweeglijkheid van tumorcellen speelt een cruciale rol bij metastase 1,2. De verspreiding van tumorcellen naar naburige en afgelegen gezonde weefsels maakt de behandeling van kanker moeilijk en draagt bij aan recidief 3,4. Daarom is het essentieel om de mechanismen van de beweeglijkheid van tumorcellen te begrijpen en relevante therapeutische strategieën te ontwikkelen. Aangezien veel tumorcellen veranderde genexpressieprofielen hebben, is het cruciaal om te begrijpen welke veranderingen in het genexpressieprofiel leiden tot een veranderde beweeglijkheid van de tumorcellen 5,6.

Er zijn verschillende testen ontwikkeld om celmigratie in vitro te meten. Sommige tests bieden slechts beperkte informatie omdat metingen alleen op specifieke tijdstippen mogelijk zijn, terwijl andere uitgebreide informatie bieden over de beweeglijkheid van tumorcellen in realtime7. Hoewel veel van deze tests op het gebied van celmotiliteit kwantitatieve resultaten kunnen opleveren op een bepaald moment of het eindpunt, geven ze onvoldoende gedetailleerde informatie over dynamische veranderingen in de snelheid van celmigratie gedurende de experimentele periode. Bovendien kan het moeilijk zijn om mogelijke veranderingen in de celmigratiesnelheid te onderzoeken, afhankelijk van het experimentele ontwerp, de celtypen en het aantal cellen. Bovendien kunnen de effecten van ongecompliceerde behandelingen worden onderzocht door de eenvoudige kwantificering van traditionele motiliteitstests, maar meer geavanceerde kwantificering kan nodig zijn om de complexe effecten van verschillende gecombineerde behandelingen te bestuderen8.

Er is een instrument ontwikkeld voor het bewaken van de elektrische stroom van een microtiterplaat die goed is bedekt met micro-elektroden9. De hechting van cellen aan het oppervlak van de put belemmert de elektronenstroom en de impedantie correleert met de kwantitatieve en kwalitatieve binding van de cellen. De aanwezigheid van de micro-elektroden op de bodem van de put maakt het mogelijk om de adhesie, verspreiding en proliferatie van cellen te meten. De aanwezigheid van de micro-elektroden onder een microporeus membraan van de bovenste kamer maakt het mogelijk om celmigratie en invasie in de onderste kamer te meten, waarbij de bovenste kamer is gecoat met extracellulaire matrix (ECM)-eiwitten om invasie mogelijk te maken10.

Eerder werd aangetoond dat op impedantie gebaseerde real-time metingen van tumorcelmigratie en -invasie real-time gegevens opleveren tijdens het hele experiment, evenals onmiddellijke vergelijkingen en kwantificeringen onder verschillende experimentele omstandigheden11. In dat methodedocument werd gen-knockdown geïnduceerd om de rol van eiwitten die van belang zijn bij de migratie en invasie van tumorcellen te testen. Aangezien een volwaardig gen-knockdown-effect onder de geteste experimentele omstandigheden 3-4 dagen duurde na elektroporatie met kleine interfererende RNA's (siRNA's)8, werden de cellen na de elektroporatie opnieuw geplateerd en 3 dagen later opnieuw geoogst voor de impedantie-gebaseerde real-time meting van tumorcelmigratie en -invasie.

CT10-regulator van kinase (Crk) en Crk-like (CrkL) zijn adaptoreiwitten die eiwit-eiwitinteracties stroomafwaarts van verschillende groeifactorreceptorkinaseroutes en niet-receptortyrosinekinaseroutes bemiddelen12. Verhoogde niveaus van Crk- en CrkL-eiwitten dragen bij aan een slechte prognose bij verschillende vormen van kanker bij de mens, waaronder glioblastoom13. Het is echter onduidelijk hoe verhoogde Crk- en CrkL-eiwitten leiden tot een slechte prognose. Daarom is het belangrijk om het effect van Crk- en CrkL-overexpressie op tumorcelfuncties te definiëren. Eerder werd een gen-knockdown-studie uitgevoerd om aan te tonen dat endogene niveaus van Crk- en CrkL-eiwitten nodig zijn voor glioblastoomcelmigratie en -invasie8. Hier is een aangepast testsysteem ontwikkeld om het effect van Crk- en CrkL-overexpressie op de migratie en invasie van tumorcellen aan te pakken.

Onlangs hebben de in vitro synthese van mRNA en de therapeutische toepassingen ervan hernieuwde aandacht getrokken door de ontwikkeling van de mRNA-vaccins tegen SARS-CoV-2 (beoordeeld door Verbeke et al.14). Bovendien is er opmerkelijke vooruitgang geboekt bij het gebruik van synthetisch mRNA bij kanker en andereziekten15,16. De elektroporatie van cellen is een effectieve methode om synthetisch mRNA af te leveren en voorbijgaande genetische modificatie te induceren (beoordeeld door Campillo-Davo et al.17), en het gebruik van synthetisch mRNA maakt snelle en efficiënte genexpressie in onsterfelijke fibroblasten mogelijk 18. Dit methodedocument combineert genoverexpressie met behulp van synthetisch mRNA met real-time celanalyses om migratie en invasie van tumorcellen te bestuderen. Het experimentele schema dat voor siRNA's wordt gebruikt, werkt echter niet met synthetische mRNA-transfectie, omdat het niveau van exogene eiwitten snel toeneemt en geleidelijk afneemt bij synthetische mRNA-transfectie18. Daarom is de methode aangepast om de real-time analyse van celmigratie en -invasie direct na de transfectie uit te voeren zonder de cellen extra te kweken.

Dit methodedocument toont aan dat het combineren van impedantie-gebaseerde real-time metingen met de transfectie van tumorcellen met synthetische mRNA's een snelle en uitgebreide analyse oplevert van de effecten van gen-upregulatie op tumorcelmigratie en -invasie. Dit methodedocument beschrijft gedetailleerde procedures om te meten hoe de migratie en invasie van glioblastoomcellen worden beïnvloed door de overexpressie van Crk en CrkL. Door de concentratie-afhankelijke effecten van synthetisch mRNA op tumorcelmigratie te onderzoeken, beschrijft het artikel duidelijk hoe een toename van eiwitniveaus de migratie van tumorcellen stimuleert. Daarnaast wordt een benadering gepresenteerd om de concentratie van de ECM-gel te variëren om de effecten van veranderingen in genexpressie op tumorcelinvasie te beoordelen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Synthese van mRNA

OPMERKING: Voor de mRNA-synthese moeten alle reagentia en apparatuur speciaal worden behandeld om de RNases vóór gebruik te inactiveren. Zie de materiaaltabel voor meer informatie over alle materialen, instrumenten en reagentia die in dit protocol worden gebruikt.

  1. Linearisatie van DNA
    OPMERKING: Muizen-cDNA's van CrkI en CrkL werden gekloond in de pFLAG-CMV-5a-expressievector om de FLAG-epitooptag toe te voegen aan de C-terminus en gesubkloneerd in de pcDNA3.1/myc-His-vector om de T7-promotor op te nemen, zoals eerder beschreven 18,19.
    1. Voeg 10 μL 10x reactiebuffer, 1,5 μL PmeI (10.000 eenheden/ml) en 10 μg plasmide-DNA toe aan een microcentrifugebuis om het plasmide-DNA te lineariseren met het restrictie-enzym. Voeg nucleasevrij water toe om het reactievolume op 100 μL te brengen.
    2. Meng door te tikken, draai het naar beneden en incubeer het reactiemengsel een nacht bij 37 °C.
    3. Draai naar beneden en voeg 5 μL 10% natriumdodecylsulfaat (SDS) en 1 μL proteïnase K (20 mg/ml, RNA-kwaliteit) toe aan het reactiemengsel. Klop door te tikken, draai naar beneden en incubeer gedurende 30 minuten bij 50 °C.
    4. Voeg onder de zuurkast 100 μL van de onderste fase fenol:chloroform:isoamylalcohol toe aan het plasmidereactiemengsel voor extractie. Vortex, en centrifugeer vervolgens bij 18.800 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verplaats de bovenste fase naar een nieuwe buis.
    5. Herhaal stap 1.1.4 met chloroform:isoamylalcohol op 24:1.
    6. Breng in de nieuwe buis het reactievolume op 300 μL door 200 μL nucleasevrij water toe te voegen en voeg vervolgens 30 μL 3 M natriumacetaat en 600 μL 100% ethanol toe.
    7. Meng door vortexen en plaats vervolgens bij -20 °C gedurende 30-60 minuten voor de ethanolprecipitatie van het DNA.
    8. Centrifugeer bij 18.800 × g gedurende 20 minuten bij 4 °C, gooi het supernatant weg en spoel de pellet af met 1 ml 70% ethanol. Herhaal de centrifugatie gedurende 10 minuten en verwijder dan het supernatans volledig.
    9. Droog met de dop open gedurende 2 minuten, voeg 30 μL nucleasevrij water toe en resuspendeer de DNA-pellet.
    10. Bepaal de DNA-concentratie met behulp van een spectrofotometer.
    11. Controleer de grootte en hoeveelheid van het gelineariseerde DNA met behulp van agarosegelelektroforese.
  2. RNA-synthese met behulp van T7 RNA-polymerase
    1. Voeg 2 μL van elk 10x transcriptiebuffer, ATP, GTP, UTP, CTP en T7 en 1 μg van een gelineariseerd DNA toe aan een microcentrifugebuis. Voeg nucleasevrij water toe om het reactievolume op 20 μL te brengen.
    2. Meng door te tikken, centrifugeer en incubeer het reactiemengsel gedurende 2 uur bij 37 °C voor RNA-synthese.
    3. Draai naar beneden, voeg 1 μL DNase (2 E/μL) toe en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C om het sjabloon-DNA te verwijderen.
  3. Lithiumchloride precipitatie van het RNA
    1. Voeg 10 μL lithiumchloride (7,5 M) toe aan het reactiemengsel. Mengen door te tikken, centrifugeren en het reactiemengsel gedurende 30 minuten bij -20 °C incuberen.
    2. Centrifugeer bij 18.800 × g gedurende 20 minuten bij 4 °C, gooi het supernatant weg en spoel de pellet af met 500 μl 70% ethanol. Herhaal de centrifugatie gedurende 10 minuten en verwijder dan het supernatans volledig.
    3. Droog met de dop open gedurende 2 minuten, voeg 30 μL nucleasevrij water toe en resuspendeer de RNA-pellet.
  4. Aftopping
    1. Verwarm het RNA-monster gedurende 10 minuten bij 65 °C en plaats het vervolgens op ijs om af te koelen.
    2. Voeg 5 μL elk van 10x afdekbuffer, 10 mM GTP en 1 mM (10x) S-adenosylmethionine (SAM), 2 μL elk van een afdekenzymmix en O-methyltransferase-enzymmix en 1,25 μL RNaseremmer toe. Meng door te tikken, centrifugeer en incubeer het reactiemengsel gedurende 1 uur bij 37 °C.
  5. Poly(A)-residu
    1. Draai het monster naar beneden en voeg vervolgens 6 μL nucleasevrij water, 20 μL 5x E-PAP-buffer, 10 μL 25 mM MnCl2, 10 μL 10 mM ATP en 4 μL E-PAP poly(A)-tailing-enzym toe. Mengen door te tikken, centrifugeren en het reactiemengsel gedurende 2 uur bij 37 °C incuberen.
  6. Lithiumchloride precipitatie en kwantificering van het synthetische mRNA
    1. Voeg 50 μl lithiumchloride (7,5 M) toe en voer lithiumchlorideprecipitatie uit zoals beschreven in de stappen 1.3.1-1.3.3.
    2. Meet de concentratie van het mRNA met behulp van een spectrofotometer.
    3. Controleer de grootte en hoeveelheid mRNA met behulp van formaldehyde (1%-2%), agarose (1%), gelelektroforese.

2. Extracellulaire matrix (ECM) gelcoating van de celinvasie- en migratieplaten (CIM)

OPMERKING: Een CIM-plaat (Cell Invasion and Migration) is een commercieel vervaardigde plaat met 16 putjes voor op impedantie gebaseerde real-time celanalyse. Smeer voor de celinvasietest CIM-platen in met ECM-gel, zoals eerder beschreven, maar met enkele wijzigingen11.

  1. Haal een hoeveelheid ECM-gelbouillon uit de vriezer en bewaar deze op ijs.
  2. Verdun de ECM-gel (10 mg/ml) tot een werkconcentratie (100 μg/ml) door 990 μL Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (zonder serum of antibiotica) te mengen met 10 μL ECM-gel in een microcentrifugebuis. Mengen door voorzichtig pipetteren.
  3. Voeg 60 μL verdunde ECM-gel toe aan elk van de 16 putjes van de bovenste kamer van de CIM-plaat. Pas de omgekeerde pipetteermethode toe en vermijd luchtbellen20,21.
    OPMERKING: Optimaliseer de concentratie van de ECM-gel voor elke cellijn. Voor glioblastoomcellijnen werd 0,1 μg/μL tot 1 μg/μL ECM-gel gebruikt voor optimalisatie.
  4. Plaats de bovenste kamer van de CIM-plaat met de plaatafdekking eraf op een beschermende plastic plaat in een CO2 -incubator gedurende ongeveer 4 uur om een gellaag te vormen.
    LET OP: Tijdens het coaten van de CIM-plaat met ECM-gel mogen de elektroden van de bovenste kamer van de CIM-plaat geen direct contact hebben met de handen van de onderzoeker of de oppervlakken van de apparatuur, inclusief de bioveiligheidskast of de CO2 - incubator.

3. Voorbereiding van de tumorcellen

OPMERKING: Alle celkweekmaterialen moeten steriel worden bewaard. Oogst en elektropomeer de tumorcellen onder een biologische veiligheidskast met geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), zoals eerder beschreven, maar met enkele wijzigingen11.

  1. Kweek van de tumorcellen
    1. Kweek U-118MG-cellen in 10 ml DMEM met 5% foetaal runderserum (FBS) en 1% antibiotica per 100 mm x 20 mm polystyreen weefselkweekschaaltje bij 37 °C in een 5% CO2 -incubator (kweekconditie).
  2. Serumuitputting van de tumorcellen
    OPMERKING: De blootstelling van de cellen aan de chemo-lokstoffen die aanwezig zijn in FBS moet worden geminimaliseerd vóór de celmigratie- en invasietests door een hoge concentratie FBS te gebruiken.
    1. Verwijder het oude medium en voeg 10 ml voorverwarmde DMEM toe met 0,5% FBS en 1% antibiotica per schaaltje (medium, laag serum).
    2. Herhaal stap 3.2.1.
    3. Incubeer de cellen bij 37 °C in een 5% CO2 incubator gedurende 4 uur of langer.
  3. Oogsten van de tumorcellen
    1. Verwijder het oude medium, voeg 8 ml voorverwarmde Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) per gerecht toe, verwijder de DPBS, voeg voorverwarmde 0,05% trypsine-EDTA (2 ml/schaaltje) toe om het oppervlak te bedekken en incubeer gedurende 30 s in de CO2 -incubator.
    2. Zuig de trypsine-EDTA voorzichtig op, voeg medium met een laag serumgehalte (7 ml/schaaltje) toe en verzamel vervolgens cellen in een centrifugebuis van 50 ml of 15 ml.
    3. Aliquot een klein aantal cellen en gebruik een draagbare geautomatiseerde celteller om de cellen te tellen.
    4. Bereken het totale aantal cellen en het benodigde volume voor 10.000 cellen/μL.
    5. Centrifugeer de cellen door ze gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur bij 100 × g te centrifugeren, zuig het supernatant op, voeg het berekende volume DMEM met 0,5% FBS (zonder antibiotica) toe en resuspendeer de celpellet voorzichtig.
    6. Breng voor elke behandeling 110 μl van de celsuspensie, die 1,1 miljoen cellen bevat, over in een microcentrifugebuis.
    7. Herhaal stap 3.3.6 om de cellen over te brengen naar vier microcentrifugebuisjes voor vier verschillende behandelingen.
      OPMERKING: Een CIM-plaat heeft in totaal 16 putjes. Ontwerp vier verschillende behandelingen ter vergelijking, zodat voor elke behandeling vier putjes van de CIM-plaat kunnen worden toegewezen. Gebruik de geëlektropoleerde cellen voor de volgende experimenten: western blot-analyses (0,3 miljoen cellen per weefselkweekschaal van 35 mm), vier putjes met real-time celmigratietesten (0,1 miljoen cellen/putje) en vier putjes met real-time celinvasietesten (0,1 miljoen cellen/putje) voor elke behandeling. Pas het aantal cellen aan dat moet worden geëlektropoleerd als het experimentele ontwerp verandert.

4. Elektroporatie van de tumorcellen

  1. Om het medium te verwijderen, voegt u 1 ml DPBS toe aan de celsuspensie in elk buisje, draait u de celsuspensie drie keer gedurende 10 seconden en draait u het buisje elke 10 s 180° rond met behulp van een minicentrifuge, en verwijdert u het supernatans met behulp van een micropipet.
    OPMERKING: Het is belangrijk om een compacte maar gemakkelijk resuspendeerbare celpellet te vormen.
  2. Voeg 110 μL resuspensiebuffer R toe aan de celpellet om 0,1 miljoen cellen in 10 μL te verkrijgen.
  3. Voeg synthetisch mRNA toe aan de celpellet om een concentratie van 0,2-20 ng/μL te verkrijgen, afhankelijk van het gewenste expressieniveau. Meng en resuspendeer de celpellet voorzichtig door te tikken of voorzichtig te pipetteren.
    OPMERKING: Gebruik verschillende concentraties synthetisch mRNA, onderzoek de eiwitexpressie met behulp van western blot-analyse en bepaal de concentratie synthetisch mRNA die leidt tot het gewenste expressieniveau om de specifieke correlatie tussen de eiwitexpressie en biologische effecten te onderzoeken.
  4. Elektroporeren van 10 μL van de celsuspensie met een elektroporatiesysteem bij 1.350 V gedurende 10 ms met telkens drie pulsen.
  5. Breng de geëlektropoleerde cellen over in een nieuwe microcentrifugebuis met 1,1 ml DMEM met 0,5% FBS.
  6. Herhaal de elektroporatie totdat de rest van de celsuspensie is geëlektroporeerd. Combineer de geëlektropoleerde cellen in de microcentrifugebuis om 1,1 miljoen cellen in 1,1 ml te verkrijgen.
    OPMERKING: Zowel 100 μL als 10 μL elektroporatietips kunnen worden gebruikt om een groot aantal cellen te elektropoleren, maar de elektroporatietips voor 10 μL en 100 μL zijn inbegrepen in twee afzonderlijke kits en moeten apart worden aangeschaft. Resuspensiebuffer R is inbegrepen in beide kits.
  7. Na voltooiing van alle respectievelijke elektroporaties, resuspendeert u de gepoolde cellen voorzichtig.
  8. Plaats 0,3 miljoen cellen in een polystyreenkweekschaaltje van 35 mm x 10 mm met 2 ml DMEM met 5% FBS, en kweek de cellen gedurende 1 dag onder de kweekconditie voor totale cellysaatbereiding en western blot-analyses.
  9. Bewaar de rest van de geëlektropoleerde cellen op kamertemperatuur totdat het real-time celanalysesysteem klaar is.

5. Instellen van de real-time celanalysator, het programma en de CIM-platen

OPMERKING: Bereid de real-time celanalysator en twee CIM-platen voor, zoals eerder beschreven11.

  1. Evenwicht van de real-time celanalysator
    1. Verplaats de real-time celanalysator enkele uren voor gebruik naar een CO2 -incubator om het systeem onder de kweekomstandigheden in evenwicht te brengen.
  2. Opzetten van het analyseprogramma
    1. Open het analyseprogramma door te dubbelklikken op het pictogram van de real-time celanalysesoftware op het bureaublad.
    2. Zodra de optie Standaardconfiguratie van het experimentpatroon is geopend, selecteert u de optie om drie experimenten afzonderlijk uit te voeren.
      NOTITIE: Elke houder heeft een apart venster. Er zijn verschillende tabbladen om het meetinterval en de meetduur, gegevensanalyse en andere experimentele omstandigheden in te stellen.
    3. Open elke houder door op het tabblad Nummer te klikken.
    4. Klik op het tabblad Experimentnotities , selecteer de map waarin de gegevens worden opgeslagen en voer de naam van het experiment in.
    5. Klik op het tabblad Lay-out , stel viervoudige putjes in voor elke behandelingsvoorwaarde door vier putjes tegelijk te selecteren en de voorbeeldinformatie in te voeren, en klik vervolgens op Toepassen.
    6. Klik op het tabblad Schema | Voeg een stap toe om de tweestapsmodus van de celimpedantiemetingen in te stellen. Klik vervolgens op Toepassen om de eerste stap in te stellen.
    7. Klik nogmaals op Een stap toevoegen , voer 10 minuten in voor het interval en 48 uur voor de duur voor migratie en invasie en klik op Toepassen om de tweede stap in te stellen.
      OPMERKING: De eerste stap omvat een eenmalige nulmeting (één veeg met een interval van 1 minuut). De tweede stap meet de celimpedantie voor het experiment (bijvoorbeeld 289 sweeps met een interval van 10 minuten gedurende 48 uur) bij de wieg. Pas het interval en de duur aan, afhankelijk van het experimentele ontwerp.
    8. Ga naar de volgende houder en stel deze in door stap 5.2.3-5.2.7 te herhalen.
  3. Voorbereiding van de CIM-platen
    1. Een uur voordat de celimpedantiemeting begint, vult u de putjes van de onderste kamer van de CIM-plaat met 160 μL DMEM met 10% serum of andere chemo-lokstoffen.
    2. Monteer de bovenste kamer met de ECM-gelgecoate putten (voor invasie) of ongecoate putten (voor migratie) met de onderste kamer.
    3. Voeg 50 μL laag-serummedium toe aan de putjes van de bovenste kamer van de CIM-plaat voor de celmigratietest en plaats de CIM-plaat in de houder van het systeem.
    4. Klik op het tabblad Bericht en zorg ervoor dat het bericht Verbindingen ok wordt weergegeven. De CIM-plaat is nu klaar voor het experiment.
    5. Pre-incubeer de geassembleerde CIM-plaat in de CO2 -incubator gedurende 30-60 minuten vóór de real-time celanalyse om de CIM-plaat te laten wennen aan de kweekconditie.

6. Real-time celanalyse en gegevensexport

OPMERKING: Voer een basislijnmeting, celzaaiing, celimpedantiemeting en gegevensexport uit zoals eerder beschreven11.

  1. Basislijn meting
    NOTITIE: De basislijn moet worden afgelezen nadat de CIM-plaat is geacclimatiseerd en voordat de cellen worden toegevoegd aan de putjes van de bovenste kamer.
    1. Klik op de Start-knop voor elke houder. Wanneer het venster Opslaan als wordt weergegeven, slaat u het experimentele bestand op om de basislijnmeting uit te voeren.
  2. Cel zaaien
    1. Haal de CIM-plaat uit de houder en plaats deze in de bioveiligheidskast op de plaathouder.
    2. Voeg 100 μL (met 100.000 cellen) geëlektropoleerde cellen toe aan de putjes van de bovenste kamer van de CIM-plaat volgens het programma in de besturingseenheid. Pas de omgekeerde pipetteermethode toe en vermijd luchtbellen.
    3. Laat de CIM-plaat 30 minuten onder de bioveiligheidskast op kamertemperatuur staan om ervoor te zorgen dat de cellen zich gelijkmatig over de bodem van de put verspreiden.
  3. Meting van de celimpedantie
    1. Verplaats de volledig geassembleerde CIM-plaat terug naar de betreffende houder. Klik op de startknop van de houder om de celimpedantiemeting voor de tweede stap te starten.
    2. Klik op het tabblad Plot , klik vervolgens op de knop Alles toevoegen en selecteer de vakjes Gemiddelde en STD DEV om de gegevens in realtime te visualiseren.
      OPMERKING: De standaard plotoptie is Tijd voor de x-as en Celindex voor de y-as. In de sectie Plotselectie kan de gebruiker alternatieve opties voor de y-as selecteren: Normalized Cell Index of Delta Cell Index. Zodra de laatste sweep is uitgevoerd, is het experiment voltooid en worden de resultaten automatisch opgeslagen.
  4. Export van de gegevens voor analyse
    1. Klik op het tabblad Plot en selecteer de vakjes Gemiddelde en STD DEV om de gegevens voor elk putje afzonderlijk te kopiëren.
    2. Klik met de rechtermuisknop op het tekengebied en selecteer Gegevens kopiëren in lijstindeling.
    3. Open een leeg spreadsheetbestand, plak de gegevens en sla het bestand op.
    4. Ga terug naar het analyseprogramma, klik op het tabblad Plaat voor elke houder en selecteer Loslaten om het experiment voor de houder te sluiten.
    5. Ga terug naar het spreadsheetbestand en pas de tijd van de onbewerkte gegevens aan, zodat de starttijd bij de tweede stap de werkelijke starttijd voor de meting wordt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Crk- en CrkL-eiwitten spelen een belangrijke rol in de beweeglijkheid van veel celtypen, waaronder neuronen22, T-cellen23, fibroblasten 18,19 en een verscheidenheid aan tumorcellen13. Aangezien is gemeld dat Crk- en CrkL-eiwitten verhoogd zijn in glioblastoom24,25,26, werden de effecten van de overexpressie van CrkI, een splice-variant van Crk

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Migratie en invasie zijn belangrijke kenmerken van tumorcellen. Het meten van de beweeglijkheid van tumorcellen en het begrijpen van het onderliggende mechanisme dat de beweeglijkheid van tumorcellen regelt, bieden cruciale inzichten in therapeutische interventies 2,27. Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om celmigratie te bestuderen7. De wondgenezingstest met behulp van krassen of kweekinzetstukken is een eenvoudige en veelgebruikte...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.

Dankbetuigingen

De auteurs danken het Medical Writing Center van Children's Mercy Kansas City voor het redigeren van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door Natalie's A.R.T. Foundation (aan T.P.) en door een MCA Partners Advisory Board-subsidie van Children's Mercy Hospital (CMH) en het University of Kansas Cancer Center (KUCC) (aan TP).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AlphaImager HPProteinSimple92-13823-00Agarose gel imaging system
α-Tubulin antibodySigmaT9026Gebruikt voor het detecteren van α-tubulin eiwit (verdunning 1:3.000)
CIM-plate 16Agilent Technologies, Inc5665825001Cell invasion and migration plates
Crk antibodyBD Biosciences610035Gebruikt voor het detecteren van CrkI en CrkII eiwitten (verdunning 1:1.500)
CrkL antibodySanta Cruzsc-319Gebruikt voor het detecteren van CrkL eiwit (verdunning 1:1.500)
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)ATCC302002Celcultuurmedium
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)Corning21-031-CVBuffer gebruikt om cellen te wassen
Fetal bovine serum (FBS)HycloneSH30910.03Supplement voor kweekmedium
Heracell VIOS 160i CO2 incubatorThermo Scientific51030285CO2 incubator
IRDye 800CW goat anti-mouse IgG secundair antilichaamLi-Cor926-32210Secundair antilichaam voor Western blot analyse (verdunning 1:10.000)
IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG secundair antilichaamLi-Cor926-32211Secundair antilichaam voor Western blot analyse  (verdunning 1:10.000)
Lithium chloride InvitrogenAM9480Gebruikt voor RNA precipitatie
Matrigel matrixCorning354234Extracellulair matrix (ECM) gel
MEGAscript T7 transcriptie kitInvitrogenAM1334Gebruikt voor RNA synthese
Millennium RNA markersInvitrogenAM7150Gebruikt voor formaldehyde agarose gel elektroforese
Mini centrifugeISC BioExpressC1301P-ISCGebruikt om cellen te centrifugeren
Mouse brain QUICK-Clone cDNATaKaRa637301Bron van genen (inserts) voor klonen
NanoQuantTecanM200PRONucleïnezuur kwantificeringssysteem
Neon elektroporatie systeem ThermoFisher ScientificMPK5000Elektroporatie systeem1
Neon transfectie systeem 10 µL kitThermoFisher ScientificMPK1025Elektroporatie kit
Neon transfectie systeem 100 µL kitThermoFisher ScientificMPK10096Elektroporatie kit
NorthernMax denaturerende gel bufferInvitrogenAM8676Gebruikt voor formaldehyde agarose gel elektroforese
NorthernMax formaldehyde laad kleurstofInvitrogenAM8552Gebruikt voor formaldehyde agarose gel elektroforese
NorthernMax loopbufferInvitrogenAM8671Gebruikt voor formaldehyde agarose gel elektroforese
Nuclease-free waterTeknovaW3331Gebruikt voor verschillende reacties tijdens mRNA synthese
Odyssey CLx ImagerLi-CorImager voor Western blot analyse
pcDNA3.1/myc-HisInvitrogenV80020De vector waarin inserts (muis CrkI en CrkL cDNA's) werden gekloond
pFLAG-CMV-5aMillipore SigmaE7523Bron van het FLAG epitoop tag
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol SigmaP2069Gebruikt voor DNA extractie
PmeINew England BioLabsR0560LGebruikt om de plasmiden te lineariseren voor mRNA synthese
Poly(A) tailing kitInvitrogenAM1350Gebruikt voor poly(A) tail reactie
Polystyreen weefsel kweekschaal (100 x 20 mm stijl)Corning353003Gebruikt voor het kweken van cellen vóór transfectie
Polystyreen weefsel kweekschaal (35 x 10 mm stijl)Corning353001Gebruikt voor het kweken van getransfecteerde cellen
Proteinase KInvitrogen25530049Gebruikt om eiwit in de reactiemix te verwijderen
Purifier Axiom Class II, Type C1Labconco Corporation304410001Bioveiligheidskast voor steriele omgang met cellen
Resuspensie Buffer RThermoFisher ScientificEen buffer die in de elektroporatie kits, MPK1025 en MPK10096 is inbegrepen. De buffer wordt gebruikt om cellen voorafgaand aan elektroporatie te hersuspenderen, en de samenstelling ervan is eigendomsinformatie.
RNaseZapInvitrogenAM9780RNA decontaminatie oplossing
ScepterMilliporeC85360Handbediende geautomatiseerde celteller 
ScriptCap 2'-O-methyltransferase kitCellscriptC-SCMT0625Gebruikt voor capping reactie
ScriptCap m7G capping systeemCellscriptC-SCCE0625Gebruikt voor capping reactie
Sodium dodecylsulfaat oplossingInvitrogen15553-035Detergeerd gebruikt voor de proteinase K reactie
Sorvall Legend XT centrifugeThermo Scientific75004532Tischcentrifuge om cellen te centrifugeren
Trypsin-EDTAGibco25300-054Gebruikt voor dissociatie van cellen
U-118MG ATCCHTB15Een adherante cellijn afkomstig van een humane glioblastoom patiënt
Vinculin antibodySigmaV9131Gebruikt voor het detecteren van vinculine eiwit (verdunning 1:100.000)
xCELLigence RTCA DPAgilent Technologies, Inc380601050Instrument gebruikt voor real-time cel analyse
1Elektroporatie parameters en andere gerelateerde informatie voor verschillende cellijnen zijn beschikbaar op de homepage van de

Referenties

  1. Palmer, T. D., Ashby, W. J., Lewis, J. D., Zijlstra, A. Targeting tumor cell motility to prevent metastasis. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (8), 568-581 (2011).
  2. Eccles, S. A., Box, C., Court, W. Cell migration/invasion assays and their application in cancer drug discovery. Biotechnology Annual Review. 11, 391-421 (2005).
  3. Kluiver, T. A., Alieva, M., van Vuurden, D. G., Wehrens, E. J., Rios, A. C. Invaders exposed: Understanding and targeting tumor cell invasion in diffuse intrinsic pontine glioma. Frontiers in Oncology. 10, 92(2020).
  4. Xie, Q., Mittal, S., Berens, M. E. Targeting adaptive glioblastoma: An overview of proliferation and invasion. Neuro-Oncology. 16 (12), 1575-1584 (2014).
  5. Wee, Y., Wang, T., Liu, Y., Li, X., Zhao, M. A pan-cancer study of copy number gain and up-regulation in human oncogenes. Life Sciences. 211, 206-214 (2018).
  6. Zhao, M., Liu, Y., Qu, H. Expression of epithelial-mesenchymal transition-related genes increases with copy number in multiple cancer types. Oncotarget. 7 (17), 24688-24699 (2016).
  7. Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107(2019).
  8. Park, T., Large, N., Curran, T. Quantitative assessment of glioblastoma phenotypes in vitro establishes cell migration as a robust readout of Crk and CrkL activity. The Journal of Biological Chemistry. 296, 100390(2021).
  9. Urcan, E., et al. Real-time xCELLigence impedance analysis of the cytotoxicity of dental composite components on human gingival fibroblasts. Dental Materials. 26 (1), 51-58 (2010).
  10. Limame, R., et al. Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays. PLoS One. 7 (10), e46536(2012).
  11. Mudduluru, G., Large, N., Park, T. Impedance-based real-time measurement of cancer cell migration and invasion. Journal of Visualized Experiments. (158), e60997(2020).
  12. Feller, S. M. Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles. Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).
  13. Park, T. Crk and CrkL as therapeutic targets for cancer treatment. Cells. 10 (4), 739(2021).
  14. Verbeke, R., Lentacker, I., De Smedt, S. C., Dewitte, H. The dawn of mRNA vaccines: The COVID-19 case. Journal of Controlled Release. 333, 511-520 (2021).
  15. Heine, A., Juranek, S., Brossart, P. Clinical and immunological effects of mRNA vaccines in malignant diseases. Molecular Cancer. 20 (1), 52(2021).
  16. Kwon, H., et al. Emergence of synthetic mRNA: In vitro synthesis of mRNA and its applications in regenerative medicine. Biomaterials. 156, 172-193 (2018).
  17. Campillo-Davo, D., et al. The ins and outs of messenger RNA electroporation for physical gene delivery in immune cell-based therapy. Pharmaceutics. 13 (3), 396(2021).
  18. Park, T., Koptyra, M., Curran, T. Fibroblast growth requires CT10 regulator of kinase (Crk) and Crk-like (CrkL). The Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).
  19. Park, T. J., Curran, T. Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility. Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).
  20. Chou, P. P., Jaynes, P. K., King, B. P., Chapman, E., Bailey, J. L. Precision comparison between conventional (method-I) and reverse (method-Ii) pipetting. Clinical Chemistry. 30 (6), 958(1984).
  21. Pushparaj, P. N. Revisiting the micropipetting techniques in biomedical sciences: A fundamental prerequisite in good laboratory practice. Bioinformation. 16 (1), 8-12 (2020).
  22. Park, T. J., Curran, T. Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway. The Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).
  23. Huang, Y., et al. CRK proteins selectively regulate T cell migration into inflamed tissues. The Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 1019-1032 (2015).
  24. Wang, L., et al. Signaling adaptor protein Crk is indispensable for malignant feature of glioblastoma cell line KMG4. Biochemical and Biophysical Research Communications. 362 (4), 976-981 (2007).
  25. Kumar, S., et al. Reciprocal regulation of Abl kinase by Crk Y251 and Abi1 controls invasive phenotypes in glioblastoma. Oncotarget. 6 (35), 37792-37807 (2015).
  26. Kumar, S., et al. Crk tyrosine phosphorylation regulates PDGF-BB-inducible Src activation and breast tumorigenicity and metastasis. Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).
  27. Raudenska, M., et al. Engine shutdown: Migrastatic strategies and prevention of metastases. Trends in Cancer. 9 (4), 293-308 (2023).
  28. Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration. Medicinal Research Reviews. 27 (2), 149-176 (2007).
  29. Farasani, A., Darbre, P. D. Long-term exposure to triclosan increases migration and invasion of human breast epithelial cells in vitro. Journal of Applied Toxicology. 41 (7), 1115-1126 (2021).
  30. Hanusova, V., Skalova, L., Kralova, V., Matouskova, P. The effect of flubendazole on adhesion and migration in SW480 and SW620 colon cancer cells. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (6), 837-846 (2018).
  31. Lago-Baameiro, N., et al. PARK7/DJ-1 inhibition decreases invasion and proliferation of uveal melanoma cells. Tumori. 109 (1), 47-53 (2023).
  32. Escalona, R. M., et al. Knock down of TIMP-2 by siRNA and CRISPR/Cas9 mediates diverse cellular reprogramming of metastasis and chemosensitivity in ovarian cancer. Cancer Cell International. 22 (1), 422(2022).
  33. Mosca, L., et al. Effects of S-adenosyl-L-methionine on the invasion and migration of head and neck squamous cancer cells and analysis of the underlying mechanisms. International Journal of Oncology. 56 (5), 1212-1224 (2020).
  34. Zhao, Q., et al. VEGI174 protein and its functional domain peptides exert antitumour effects on renal cell carcinoma. International Journal of Oncology. 54 (1), 390-398 (2019).
  35. Witte, D., et al. TGF-beta1-induced cell migration in pancreatic carcinoma cells is RAC1 and NOX4-dependent and requires RAC1 and NOX4-dependent activation of p38 MAPK. Oncology Reports. 38 (6), 3693-3701 (2017).
  36. Bui, L. C., et al. Regulation of aquaporin 3 expression by the AhR pathway is critical to cell migration. Toxicological Sciences. 149 (1), 158-166 (2016).
  37. Tsuji, K., et al. Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
  38. Frandsen, S. K., McNeil, A. K., Novak, I., McNeil, P. L., Gehl, J. Difference in membrane repair capacity between cancer cell lines and a normal cell line. The Journal of Membrane Biology. 249 (4), 569-576 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Celinvasiereal time celanalyseimpedantiemetingelectroporatiegen overexpressieECM gelassayglioblastoomcellencelmigratieassay

Gerelateerde artikelen