Veel opgereguleerde genen stimuleren de migratie en invasie van tumorcellen, wat leidt tot een slechte prognose. Het is van cruciaal belang om te bepalen welke genen de migratie en invasie van tumorcellen reguleren. Dit protocol presenteert een methode om de effecten van de verhoogde expressie van een gen op de migratie en invasie van tumorcellen in realtime te onderzoeken.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Real-time kwantitatieve meting van tumorcelmigratie en -invasie na synthetische mRNA-transfectie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Tumorcellen zijn zeer beweeglijk en invasief en vertonen veranderde genexpressiepatronen. Kennis van hoe veranderingen in genexpressie de migratie en invasie van tumorcellen reguleren, is essentieel voor het begrijpen van de mechanismen van tumorcelinfiltratie in naburige gezonde weefsels en metastase. Eerder werd aangetoond dat gen-knockdown, gevolgd door de impedantie-gebaseerde real-time meting van tumorcelmigratie en -invasie, de identificatie van de genen mogelijk maakt die nodig zijn voor tumorcelmigratie en -invasie. Onlangs hebben de mRNA-vaccins tegen SARS-CoV-2 de belangstelling voor het gebruik van synthetisch mRNA voor therapeutische doeleinden vergroot. Hier werd de methode met synthetisch mRNA herzien om het effect van genoverexpressie op de migratie en invasie van tumorcellen te bestuderen. Deze studie toont aan dat verhoogde genexpressie met synthetische mRNA-transfectie gevolgd door impedantie-gebaseerde real-time meting kan helpen bij het identificeren van de genen die de migratie en invasie van tumorcellen stimuleren. Dit methodedocument geeft belangrijke details over de procedures voor het onderzoeken van het effect van veranderde genexpressie op de migratie en invasie van tumorcellen.
Inleiding
De beweeglijkheid van tumorcellen speelt een cruciale rol bij metastase 1,2. De verspreiding van tumorcellen naar naburige en afgelegen gezonde weefsels maakt de behandeling van kanker moeilijk en draagt bij aan recidief 3,4. Daarom is het essentieel om de mechanismen van de beweeglijkheid van tumorcellen te begrijpen en relevante therapeutische strategieën te ontwikkelen. Aangezien veel tumorcellen veranderde genexpressieprofielen hebben, is het cruciaal om te begrijpen welke veranderingen in het genexpressieprofiel leiden tot een veranderde beweeglij....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Synthese van mRNA
OPMERKING: Voor de mRNA-synthese moeten alle reagentia en apparatuur speciaal worden behandeld om de RNases vóór gebruik te inactiveren. Zie de materiaaltabel voor meer informatie over alle materialen, instrumenten en reagentia die in dit protocol worden gebruikt.
- Linearisatie van DNA
OPMERKING: Muizen-cDNA's van CrkI en CrkL werden gekloond in de pFLAG-CMV-5a-expressievector om de FLAG-epitooptag toe te voegen aan de C-terminus en gesubkloneerd in de pcDNA3.1/myc-His-vector om de T7-promotor op te nemen, zoals eerder beschreven ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Crk- en CrkL-eiwitten spelen een belangrijke rol in de beweeglijkheid van veel celtypen, waaronder neuronen22, T-cellen23, fibroblasten 18,19 en een verscheidenheid aan tumorcellen13. Aangezien is gemeld dat Crk- en CrkL-eiwitten verhoogd zijn in glioblastoom24,25,26, werden de effecten van de overexpressie van CrkI, een splice-variant van Crk
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Migratie en invasie zijn belangrijke kenmerken van tumorcellen. Het meten van de beweeglijkheid van tumorcellen en het begrijpen van het onderliggende mechanisme dat de beweeglijkheid van tumorcellen regelt, bieden cruciale inzichten in therapeutische interventies 2,27. Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om celmigratie te bestuderen7. De wondgenezingstest met behulp van krassen of kweekinzetstukken is een eenvoudige en veelgebruikte.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.
Dankbetuigingen
De auteurs danken het Medical Writing Center van Children's Mercy Kansas City voor het redigeren van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door Natalie's A.R.T. Foundation (aan T.P.) en door een MCA Partners Advisory Board-subsidie van Children's Mercy Hospital (CMH) en het University of Kansas Cancer Center (KUCC) (aan TP).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| AlphaImager HP | ProteinSimple | 92-13823-00 | Agarose gel imaging system |
| α-Tubulin antibody | Sigma | T9026 | Gebruikt voor het detecteren van α-tubulin eiwit (verdunning 1:3.000) |
| CIM-plate 16 | Agilent Technologies, Inc | 5665825001 | Cell invasion and migration plates |
| Crk antibody | BD Biosciences | 610035 | Gebruikt voor het detecteren van CrkI en CrkII eiwitten (verdunning 1:1.500) |
| CrkL antibody | Santa Cruz | sc-319 | Gebruikt voor het detecteren van CrkL eiwit (verdunning 1:1.500) |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | ATCC | 302002 | Celcultuurmedium |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CV | Buffer gebruikt om cellen te wassen |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | Supplement voor kweekmedium |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | Thermo Scientific | 51030285 | CO2 incubator |
| IRDye 800CW goat anti-mouse IgG secundair antilichaam | Li-Cor | 926-32210 | Secundair antilichaam voor Western blot analyse (verdunning 1:10.000) |
| IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG secundair antilichaam | Li-Cor | 926-32211 | Secundair antilichaam voor Western blot analyse (verdunning 1:10.000) |
| Lithium chloride | Invitrogen | AM9480 | Gebruikt voor RNA precipitatie |
| Matrigel matrix | Corning | 354234 | Extracellulair matrix (ECM) gel |
| MEGAscript T7 transcriptie kit | Invitrogen | AM1334 | Gebruikt voor RNA synthese |
| Millennium RNA markers | Invitrogen | AM7150 | Gebruikt voor formaldehyde agarose gel elektroforese |
| Mini centrifuge | ISC BioExpress | C1301P-ISC | Gebruikt om cellen te centrifugeren |
| Mouse brain QUICK-Clone cDNA | TaKaRa | 637301 | Bron van genen (inserts) voor klonen |
| NanoQuant | Tecan | M200PRO | Nucleïnezuur kwantificeringssysteem |
| Neon elektroporatie systeem | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Elektroporatie systeem1 |
| Neon transfectie systeem 10 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | Elektroporatie kit |
| Neon transfectie systeem 100 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK10096 | Elektroporatie kit |
| NorthernMax denaturerende gel buffer | Invitrogen | AM8676 | Gebruikt voor formaldehyde agarose gel elektroforese |
| NorthernMax formaldehyde laad kleurstof | Invitrogen | AM8552 | Gebruikt voor formaldehyde agarose gel elektroforese |
| NorthernMax loopbuffer | Invitrogen | AM8671 | Gebruikt voor formaldehyde agarose gel elektroforese |
| Nuclease-free water | Teknova | W3331 | Gebruikt voor verschillende reacties tijdens mRNA synthese |
| Odyssey CLx Imager | Li-Cor | Imager voor Western blot analyse | |
| pcDNA3.1/myc-His | Invitrogen | V80020 | De vector waarin inserts (muis CrkI en CrkL cDNA's) werden gekloond |
| pFLAG-CMV-5a | Millipore Sigma | E7523 | Bron van het FLAG epitoop tag |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Sigma | P2069 | Gebruikt voor DNA extractie |
| PmeI | New England BioLabs | R0560L | Gebruikt om de plasmiden te lineariseren voor mRNA synthese |
| Poly(A) tailing kit | Invitrogen | AM1350 | Gebruikt voor poly(A) tail reactie |
| Polystyreen weefsel kweekschaal (100 x 20 mm stijl) | Corning | 353003 | Gebruikt voor het kweken van cellen vóór transfectie |
| Polystyreen weefsel kweekschaal (35 x 10 mm stijl) | Corning | 353001 | Gebruikt voor het kweken van getransfecteerde cellen |
| Proteinase K | Invitrogen | 25530049 | Gebruikt om eiwit in de reactiemix te verwijderen |
| Purifier Axiom Class II, Type C1 | Labconco Corporation | 304410001 | Bioveiligheidskast voor steriele omgang met cellen |
| Resuspensie Buffer R | ThermoFisher Scientific | Een buffer die in de elektroporatie kits, MPK1025 en MPK10096 is inbegrepen. De buffer wordt gebruikt om cellen voorafgaand aan elektroporatie te hersuspenderen, en de samenstelling ervan is eigendomsinformatie. | |
| RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | RNA decontaminatie oplossing |
| Scepter | Millipore | C85360 | Handbediende geautomatiseerde celteller |
| ScriptCap 2'-O-methyltransferase kit | Cellscript | C-SCMT0625 | Gebruikt voor capping reactie |
| ScriptCap m7G capping systeem | Cellscript | C-SCCE0625 | Gebruikt voor capping reactie |
| Sodium dodecylsulfaat oplossing | Invitrogen | 15553-035 | Detergeerd gebruikt voor de proteinase K reactie |
| Sorvall Legend XT centrifuge | Thermo Scientific | 75004532 | Tischcentrifuge om cellen te centrifugeren |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | Gebruikt voor dissociatie van cellen |
| U-118MG | ATCC | HTB15 | Een adherante cellijn afkomstig van een humane glioblastoom patiënt |
| Vinculin antibody | Sigma | V9131 | Gebruikt voor het detecteren van vinculine eiwit (verdunning 1:100.000) |
| xCELLigence RTCA DP | Agilent Technologies, Inc | 380601050 | Instrument gebruikt voor real-time cel analyse |
| 1Elektroporatie parameters en andere gerelateerde informatie voor verschillende cellijnen zijn beschikbaar op de homepage van de |
Referenties
- Palmer, T. D., Ashby, W. J., Lewis, J. D., Zijlstra, A. Targeting tumor cell motility to prevent metastasis. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (8), 568-581 (2011).
- Eccles, S. A., Box, C., Court, W. Cell migration/invasion assays and their application in....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
