Generatie van een muis kunstmatig decidualisatiemodel met ovariëctomie voor endometriumdecidualisatieonderzoek

Samenvatting

Hier beschrijven we de methode voor het genereren van een kunstmatig decidualisatiemodel met behulp van de ovariëctomische muis, een klassiek endometriumdecidualisatie-experiment op het onderzoeksgebied van endometriumdecidualisatie.

Samenvatting

Endometriumdecidualisatie is een uniek differentiatieproces van het endometrium, nauw verwant aan menstruatie en zwangerschap. Aantasting van decidualisatie leidt tot verschillende endometriumstoornissen, zoals onvruchtbaarheid, terugkerende miskraam en vroeggeboorte. De ontwikkeling en het gebruik van het endometriumdecidualisatiemodel in reproductieve studies zijn al lange tijd een hoogtepunt voor reproductieve onderzoekers. De muis is uitgebreid gebruikt bij het bestuderen van voortplanting en decidualisatie. Er zijn drie gevestigde muismodellen met betrekking tot decidualisatie, namelijk natuurlijke zwangerschapsdecidualisatie (NPD), kunstmatige decidualisatie (AD) en in vitro decidualisatie (IVD). Onder hen wordt AD beschouwd als een betrouwbaar model voor muisdecidualisatie, dat gemakkelijk te implementeren is en dicht bij NPD ligt. Dit artikel richt zich op een aangepaste methode van het generatie- en toepassingsproces van het kunstmatige decidualisatiemodel van de muis met ovariëctomie om ovariële effecten te voorkomen, die zeer reproduceerbare resultaten kunnen verkrijgen met kleine variaties binnen de groep. Deze methode biedt een goed en betrouwbaar diermodel voor de studie van endometriumdecidualisatie.

Inleiding

Met de ontwikkeling van door de mens geassisteerde voortplantingstechnologie heeft het huidige klinische zwangerschapspercentage van in-vitrofertilisatie-embryotransfer (IVF-ET) dat van natuurlijke zwangerschap bereikt of zelfs overtroffen. Desondanks ondergaan veel patiënten in de klinische praktijk voor geassisteerde voortplanting nog steeds meerdere embryotransfers, maar slagen er niet in om de zwangerschap naar wens te bereiken. Het specifieke moleculaire mechanisme is echter nog steeds onduidelijk, dus klinische interventie is niet effectief, wat een van de belangrijke uitdagingen is voor reproductieve geneeskunde ^1,2.

Endometriumfactoren zijn verantwoordelijk voor ongeveer tweederde van de oorzaken van IVF-falen³. Implantatie van menselijk embryo is verdeeld in drie fasen: positionering, adhesie en invasie ^4,5,6. Het maternale endometrium ondergaat een reeks veranderingen om tegemoet te komen aan de komst van het embryo. Het vormen van een implantatie "vensterperiode" biedt gunstige omstandigheden voor embryo-implantatie ^7,8.

Bij de meeste zoogdieren, nadat de blastocyst zich hecht aan het luminale epitheel van de baarmoeder, beginnen de stromale cellen rond de blastocyst zich snel te vermenigvuldigen en te differentiëren, en de snelle remodellering van het mesenchym verandert van vorm en functie, wat leidt tot embryo-implantatie ^5,9,10. De snelle toename van het volume en gewicht van de plaats zorgt ervoor dat de blastocyst wordt ingebed in het baarmoederstroma, een proces dat bekend staat als decidualisatie¹¹. Het endometriumstroma differentieert en remodelleert ter voorbereiding op de zwangerschap, terwijl de overgang van stromale cellen ruimte en nieuwe signaalverbindingen biedt voor deciduale cellen om hun functies uit te voeren^12,13. Stromale cellen transformeren in deciduale cellen en scheiden veel iconische factoren af, zoals prolactine (PRL), insuline-achtig groeifactorbindend eiwit 1 (Igfbp1), enzovoort. Studies hebben aangetoond dat abnormale decidualisatie een van de belangrijkste redenen is voor het falen van embryo-implantatie, maar de oorzaak van abnormale decidualisatie is nog steeds onduidelijk en moet verder worden opgehelderd ^1,14.

Het kunstmatige decidualisatiemodel van de muis is essentieel voor het bestuderen van het fysiologische proces en de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan decidualisatie. Kunstmatige decidualisatie (AD) verwijst voornamelijk naar het proces van endometriumdecidualisatie dat is vastgesteld door kunstmatige methoden om zwangerschap of de menstruatiecyclus te simuleren. In termen van morfologie is er weinig algemeen verschil tussen zwangerschapsdecidualisatie en kunstmatige decidualisatie^15,16. De baarmoederklieren bestaan in het baarmoederslijmvlies voordat decidua zich vormen en verdwijnen na decidualisatie. Wat de genexpressie betreft, wordt slechts een klein verschil vastgesteld tussen natuurlijke zwangerschapsdecidualisatie (NPD) en AD¹⁵. Bijgevolg kan het kunstmatige decidualisatiemodel bij muizen zwangerschapsdecidualisatie simuleren om de onbekende pathogenese en nieuwe behandeling van menselijke reproductieve ziekten te verkennen.

NPD, AD en in vitro decidualisatie (IVD) zijn drie methoden om muisdecidualisatie te bereiken. Het NPD-model is afhankelijk van natuurlijke zwangerschap en ligt het dichtst bij de fysiologische toestand van de moeder, inclusief de effecten van embryo's. Het vergelijken van de verschillen tussen implantatie- en niet-implantatieplaatsen is een meer fysiologische en handige benadering voor het bestuderen van decidualisatie. Het AD-model werd ontwikkeld door een intra-uteriene injectie van sesamolie te gebruiken als een stimulerend middel om decidualisatie te induceren in een pseudopregnant vrouwelijke muis gepaard met vasectomie mannetjes om de impact van embryo's te voorkomen. Zowel NPD- als AD-modellen spelen een essentiële rol in verschillende onderzoeksdoeleinden, maar ze kunnen paringsfalen en verschillen binnen de groep niet voorkomen die worden veroorzaakt door de verschillende activiteiten van het maternale hormoonmetabolisme. IVD is een methode die afhankelijk is van de behandeling van gecombineerd oestrogeen en progesteron op cellulair niveau, waarvoor strengere experimentele omstandigheden en operationele capaciteit vereist zijn. Het in vitro model kan de decidual respons echter niet volledig simuleren onder fysiologische omstandigheden¹⁵. Daarom stellen we een eenvoudige en verbeterde inductiemethode voor die is aangepast van traditionele AD om het effect van endogene hormonen op decidualisatie te verminderen. Gebaseerd op het verzekeren van het succes van decidualisatie-inductie, is het dichter bij de fysiologische toestand en meer geschikt voor experimenten die embryofactoren moeten uitsluiten.

Protocol

Alle beschreven dierproeven werden goedgekeurd door het Affiliated Drum Tower Hospital van het Nanjing University Medical School's Committee on the Use and Care of Animals (nr. 20171202). Alle operaties volgen de juiste dierverzorgings- en gebruiksinstantie en nationale richtlijnen.

OPMERKING: Muizen werden grootgebracht in een specifieke pathogeenvrije (SPF) omgeving, met een temperatuur van 22 °C ± 1 °C, een relatieve vochtigheid van 50% ± 1%, een licht/donkercyclus van 12 uur/12 uur en vrije toegang tot voedsel en water.

1. Ovariëctomie bij muizen

1. Steriliseer de chirurgische instrumenten met een sterilisator voor hoge temperatuur en hoge druk 1 dag voor de operatie.
2. Weeg 8 weken oude C57BL/6-muizen en injecteer intraperitoneaal (i.p) 1% natriumpentobarbital dienovereenkomstig om de muizen te verdoven. De gebruikte dosis is 40 mg/kg¹⁷. Deze dosis biedt 40-60 minuten sedatie, die voldoet aan de vereisten van een ovariëctomie. Voor preoperatieve analgesie, injecteer muizen met 5 mg / kg meloxicam (s.c).
   OPMERKING: Succesvolle anesthesie bij muizen kan worden aangegeven door het verdwijnen van diepe spierreflexen en een gestage ademhaling. Tekenen van succesvolle anesthesie zijn onder meer geen knipperen bij het aanraken van de binnenste canthus, niet slikken bij het trekken van de tong, geen beenbuiging bij het knijpen van de huid tussen de tenen en geen stuiteren bij het nodig hebben van de staart.
3. Breng de beschermende oogzalf aan op de oogbollen om uitdroging tijdens de anesthesie te voorkomen.
4. Start de operatie wanneer muizen volledig verdoofd zijn. Plaats en bevestig de muizen in buikligging op het operatieoppervlak en scheer het haar op de rug nadat je ze hebt bevochtigd met een sopje. Desinfecteer de huid na het scheren met 70% ethanol.
5. Zoek de operatie-incisieplaats op 0,5 cm (of 1,0 cm onder de rib) op de bovenrand van de dijwortel van beide achterpoten evenwijdig aan de wervelkolom (figuur 1A).
   OPMERKING: Een juiste incisielocatie is essentieel voor het snel lokaliseren van de eierstok.
6. Neem de incisieplaats als het midden en desinfecteer het incisiegebied 3x met jodophor en plaats vervolgens een chirurgisch gordijn rond het incisiegebied.
7. Maak een longitudinale incisie van ongeveer 0,5-1,0 cm met een schaar. Snijd de fascia en scheid passief de spieren met een pincet.
8. Zoek een stuk van het witte vetkussen in het incisieveld dicht bij de onderpool van de nier door de dunne spierlaag (figuur 1B).
   OPMERKING: Het witte vetkussen is de meest voor de hand liggende indicator van de locatie van de eierstok.
9. Klem de vetmassa vast met hemostatische clips en trek de eierstok omwikkeld door het vetkussen uit de incisie.
10. Klem de overgang van de eierstok en de eileider vast met een gebogen pincet en verwijder de eierstok langs de ovariële steel met een schaar. Stop het bloeden met behulp van een elektrocoagulatiepen of een naald van een spuit van 1 ml die op de alcohollamp wordt verwarmd.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat u de eileider bewaart, die het anatomische oriëntatiepunt is voor de daaropvolgende injectie van sesamolie in de baarmoederhoorns.
11. Spoel de chirurgische incisie met een normale zoutoplossing om weefselhechting te voorkomen, gebruik een hechting van 4-0 om respectievelijk de spier en de huid te naaien en desinfecteer de chirurgische incisie opnieuw met jodofor.
12. Plaats de muizen in buikligging in de kooi en reanimeer ze gedurende ongeveer 2 uur in een incubator van 25 °C uitgerust met een lichtbron en een ventilatiesysteem.
13. Let na de operatie op de muizen, zet ze alleen terug op de oorspronkelijke voederplaats totdat ze volledig herstellen en geef ze voldoende water en voedsel.

2. Postoperatieve rust en oestrogeen- en progesteronformulering

1. Zorg ervoor dat de muizen 2 weken rusten na ovariëctomie.
2. Voeg in een ultraschone kast oestrogeen (2 ng / μL) en progesteron (0,2 ng / μL) toe aan sesamolie in RNA-enzymvrije centrifugebuizen.
3. Plaats de centrifugebuizen in een thermostatisch waterbad bij 37 °C en schud de buizen continu om het oplossen te versnellen.
4. Na volledige oplossing verdeelt u de sesamolie-oplossing in 100 μL aliqouts voor gemakkelijk gebruik. Bewaar de bereide oestrogeen- en progesteronoplossingen in de koelkast bij 4 °C.

3. Geïnduceerd kunstmatig decidualisatiemodel

1. Injecteer subcutaan (s.c) 100 ng oestrogeen in 50 μL sesamolie in elke muis gedurende 3 dagen, gevolgd door 2 dagen rust¹⁵.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat het oestrogeen en progesteron zijn geformuleerd en op verschillende plaatsen zijn geplaatst. Elke besmetting van oestrogeen door progesteron kan leiden tot falen.
2. Injecteer (s.c.) 1 mg progesteron en 10 ng oestrogeen in 50 μL sesamolie in elke muis gedurende nog eens 3 dagen¹⁵.
3. Bedien de muizen om het kunstmatige decidualisatiemodel¹⁵ 6 uur na de derde oestrogeen-progesteron gecombineerde injectie te induceren.
4. Zoek de baarmoederhoorn aan de onderkant van de eileiders en injecteer 20 μL sesamolie langzaam samen met de baarmoederhoorn, duw het weefsel terug, hecht de incisie en laat de muis herstellen. De benadering van de operatie is hetzelfde als de ovariëctomie van de muis¹⁵.
   OPMERKING: Ga alleen verder met de tweede operatie in het geval van een succesvolle ovariëctomie (huidincisie is goed genezen, de eierstok is volledig weggesneden en het resterende uiteinde van de eileider is niet aan de omliggende weefsels gehecht).
   OPMERKING: Voor het induceren van het AD-model is 20 μL sesamolie geschikt; meer dan 20 μL sesamolie zal gemakkelijk de andere kant binnendringen.
5. Injecteer (s.c.) 50 μL sesamolie met 1 mg progesteron en 10 ng oestrogeen (H.) gedurende nog eens 4 dagen. Zie details in figuur 2^15,18.

4. Monsterverzameling

1. Euthanaseer de muizen (n = 6) door kooldioxide-verstikking en verzamel de baarmoeder. Observeer de vorm van de bilaterale uteri, maak foto's en weeg de baarmoederhoorns (figuur 3A, B).
2. Bevestig 3-5 mm van het baarmoederweefsel met 10% formaline, sluit het in paraffine in en snijd ze. Kleuring de secties met hematoxyline en eosine om de morfologische veranderingen waar te nemen¹⁹ (figuur 4A).
3. Sluit nog eens 3-5 mm van het baarmoederweefsel in in een optimale snijtemperatuurverbinding (OCT), vries in vloeibare stikstof en bewaar in een koelkast van −80 °C. Bevroren doorsnede het weefsel tot 10 μm en detecteer alkalische fosfatase-activiteit in het baarmoederweefsel met behulp van de azokoppelingsmethode²⁰ (figuur 4B).
   OPMERKING: Bevredigende resultaten kunnen worden verkregen met behulp van bevroren secties om ALP-inhoud te detecteren, niet paraffinesecties.
4. Extraheer de totale RNA's van de baarmoeder met Trizol-reagens en voer kwantitatieve real-time PCR (qPCR) uit op een real-time PCR-systeem (Table of Materials) met qPCR-mastermix (Table of Materials) om de relatieve mRNA-expressie van prolactinefamilie 8 subfamilielid 2 (Prl8a2), alkalische fosfataselever / bot / nier (Alpl) en insuline-achtig groeifactorbindend eiwit 1 (Igfbp1) ¹⁵ te detecteren door normalisatie naar 18S mRNA-niveaus (Figuur 4C-E ). Volg de PCR-voorwaarden: fase 1, 95 °C gedurende 30 s; Fase 2, 95 °C gedurende 10 s en 60 °C gedurende 30 s; Herhaal de cyclus 40x. Een volledige lijst van primersequenties is opgenomen in tabel 1.
5. Analyseer qPCR-gegevens met behulp van de ^{2-ΔΔCT-methode en een t-testmethode} voor statistische analyse in de juiste software. In deze studie werd p < 0,05 als statistisch significant beschouwd.

Resultaten

De muis decidualisatie model indexen omvatten de algemene morfologie van de baarmoeder, de massaverhouding van de gedecidualiseerde en niet-gedecidualiseerde baarmoeder, de histologische morfologie van het endometrium en het expressieniveau van decidualisatie marker moleculen. De algemene morfologie van de kunstmatige gedecidualiseerde baarmoeder van muizen geïnduceerd door olie ligt dichter bij die van de baarmoeder tijdens de zwangerschap. Het baarmoederlichaam wordt dik en de baarmoederholte wordt kleiner dan de niet-...

Discussie

Decidualisatie bij muizen is een spontaan proces afhankelijk van de aanwezigheid van embryo's, wat verschilt van mensen. Het is echter gebleken dat kunstmatige stimulatie zoals baarmoederinjectie van glasparels en baarmoederscheuring decidualisatie van het baarmoederslijmvlies kan veroorzaken in plaats van embryo's. Bovendien ontdekten onderzoekers dat veel factoren decidual kunnen induceren of deelnemen aan decidualisatie, zoals de injectie van steroïde hormonen, prostaglandinen en groeiremmende factoren in de baarmoede...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Estrogen	Sigma	E2758	Hormoonsupplement
Progesterone	Sigma	P0130	Hormoonsupplement
Sesame oil	Sigma	S3547	Hormoonsupplement
Sodium pentobarbital	Dainippon Sumitomo Pharma Co.,Ltd.		Anesthesie
Meloxicam injectie	Qilu Animal Health Products Co., Ltd		Pijnstilling
Alkaline phophatase kleurkit(kaplow's/azo koppelingsmethode)	Solarbio	G1480	Alkaline phophatase kleur
Eosine	Servicebio	G1005-2	HE kleur
Hematoxylinen	Servicebio	G1005-1	HE kleur
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q711-02	qPCR
70% ethanol	Lircon	ZH1120090	Desinfect
Jodofoor	Runzekang	RZK-DF	Desinfect
Erytromycine oogzalf	Guangzhou Baiyunshan		Bescherming muisogen
4-0 hechtdraad	Ethicon	W329	Incisiesutuur
10% formaline	Yulu	L25010118	Weefselfixatie
Optimal cutting temperature compound	Sakura	4583	Sectie
Trizol reagens	Ambion	15596018	qPCR