Dit artikel beschrijft een aangepaste techniek voor heterotope gevasculariseerde harttransplantatie met bijgewerkte aseptische techniek, analgesie en anesthesie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een gemodificeerd muizen heterotopisch harttransplantatieprotocol dat overeenkomt met hedendaagse normen voor aseptische techniek, anesthesie en analgesie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De ontwikkeling van experimentele modellen van harttransplantatie bij dieren heeft bijgedragen aan vele vooruitgang op het gebied van immunologie en solide orgaantransplantatie. Hoewel het heterotope gevasculariseerde murine harttransplantatiemodel aanvankelijk werd gebruikt in studies naar transplantaatafstoting met combinaties van niet-overeenkomende inteeltstammen, kan toegang tot genetisch gemodificeerde stammen en therapeutische modaliteiten krachtige nieuwe preklinische inzichten bieden. Fundamenteel is de chirurgische methodologie voor deze techniek niet veranderd sinds de ontwikkeling ervan, vooral met betrekking tot belangrijke factoren zoals aseptische techniek, anesthesie en analgesie, die materiële gevolgen hebben voor postoperatieve morbiditeit en mortaliteit. Bovendien wordt verwacht dat verbeteringen in perioperatief management zullen leiden tot verbeteringen in zowel dierenwelzijn als experimentele resultaten. Dit artikel rapporteert over een protocol dat is ontwikkeld in samenwerking met een materiedeskundige in veterinaire anesthesie en beschrijft de chirurgische techniek met de nadruk op perioperatief management. Daarnaast bespreken we de implicaties van deze verfijningen en geven we details over het oplossen van kritieke chirurgische stappen voor deze procedure.
Inleiding
We hebben veel van ons begrip van immunologie en transplantatie te danken aan onderzoek op basis van experimentele modellen van solide orgaantransplantatie met behulp van dierlijke proefpersonen. Sinds de eerste beschrijving van gevasculariseerde harttransplantatie bij zoogdieren1 hebben dergelijke modellen bijgedragen aan kennis in uiteenlopende domeinen, waaronder de therapeutische toepassing van hypothermie2, de voordelen van het gebruik van gespecialiseerde hechtingen3 en technieken voor totale long- en harthomotransplantaties4. De ontwikkeling van harttransplantatiemodellen bij ratten 5,6 bood bredere mogelijkheden voor immunologische experimenten vanwege de beschikbaarheid van verschillende foklijnen. Het aanzienlijk bredere scala aan beschikbare inteelt- en mutante muizenstammen bracht Corry et al.7 ertoe een techniek van murine heterotope harttransplantatie te ontwikkelen vanwege de aanzienlijke voordelen die dit bereik biedt voor transplantatieonderzoek. Dit model is op grote schaal gebruikt en heeft bijgedragen aan een beter begrip van transplantaatafstoting8 en therapeutica9. Sinds de eerste beschrijving is de techniek echter grotendeels ongewijzigd gebleven, afgezien van enkele kleine technische details zoals aanpassingen aan de positie van anastomotische sites10,11.
Sinds de integratie van de techniek van Corry et al.7 in onze experimenten, hebben we veelbelovende gebieden geïdentificeerd voor het verbeteren van het protocol, namelijk die van aseptische techniek, anesthesie en analgesie. Verwacht werd dat verbeteringen op deze gebieden een positief effect zouden hebben op de experimentele resultaten en het dierenwelzijn zouden verbeteren. Dit is eerder aangetoond wanneer aseptische techniek wordt gebruikt bij operaties met kleine dieren, omdat het helpt bij het verminderen van postoperatieve infecties12, wat niet alleen van invloed is op morbiditeit en mortaliteit, maar ook experimenten kan compromitteren die zijn ontworpen om de immuunrespons na transplantatiechirurgie te beoordelen. Vanuit een anesthesie- en analgetisch oogpunt helpt het gebruik van een verfijnd regime om de kosten voor dieren te verlagen en het ethische argument van dit chirurgische model in evenwicht te brengen door de pijn en het lijden van proefpersonen te verzachten. Verder beperken geschikte anesthesie en analgesie de pijngerelateerde stressrespons, waardoor de kwaliteit van postoperatief herstel wordt verbeterd en uiteindelijk het chirurgische succespercentage wordt verhoogd13.
Met als doel zowel het dierenwelzijn als de experimentele uitkomsten te verbeteren, is een protocol ontwikkeld met aanpassingen om deze hiaten te overbruggen. Dit protocol is aangepast aan het oorspronkelijk beschreven door Corry et al.7 met raadpleging van een veterinaire anesthesist en met inachtneming van zowel de effecten als de duur van de effecten van de farmacologische interventies die worden gebruikt in het anesthesie- en analgetische regime. De aanpak was gebaseerd op de principes van evenwichtige anesthesie en multimodale analgesie om passende perioperatieve zorg te garanderen14. Naast de toepassing van aseptische techniek werden de opioïde buprenorfine en het lokale verdovingsmiddel bupivacaïne preventief toegediend. Algemene anesthesie werd uitgevoerd met behulp van het inhalatie-anestheticum isofluraan.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Dit onderzoek werd uitgevoerd in overeenstemming met de Code of Practice for the Care and Use of Animals for Scientific Purposes15 en goedgekeurd onder animal ethics protocols RA/3/100/1568 en AE173 (respectievelijk de Animal Ethics Committee van de University of Western Australia en de Harry Perkins Institute of Medical Research Animal Ethics Committee). Zie de Tabel met materialen voor details over alle materialen, instrumenten en dieren die in dit protocol worden gebruikt.
1. Voorbereiding van het dier op een operatie
OPMERKING: Het personeel is toegewijd aan de rol van het uitvoeren van een operatie of het bewaken van de anesthesie tijdens de procedure.
- Voor preoperatieve analgesie, dien een dosis buprenorfine (0,05-0,1 mg / kg, verdund tot 0,03 mg / ml met natriumchloride 0,9%) subcutaan toe aan de ontvangende muis ten minste 1 uur voorafgaand aan de start van de ontvangende operatie. Voer alle details in met betrekking tot de toediening van geneesmiddelen, hun dosis, het tijdstip van toediening en hun effecten in het anesthesiedossier.
OPMERKING: Deze aanpak is niet noodzakelijkerwijs vereist voor de donor, omdat het een niet-hersteloperatie is, waarbij de donor onmiddellijk na de oogst van het orgaan onder algemene verdoving wordt geëuthanaseerd. - Inductie van anesthesie
- Plaats de muis in de inductiekamer van het verdovingsademhalingssysteem met een zuurstofstroom van 1-2 L·min−1 met 4% isofluraan. Bevestig adequate anesthesie door lighouding, verlies van de rechtrichtreflex en een verminderde ademhalingsfrequentie te observeren.
- Eenmaal voldoende verdoofd, verwijdert u de muis uit de inductiekamer en scheert u de ventrale buik dicht met tondeuse om haar te verwijderen. In het geval van de donor, scheer het gebied dat zich uitstrekt van de genitaliën tot de bovenste rand van de ventrale thorax. In het geval van de ontvanger, scheer het gebied dat zich uitstrekt van de genitaliën tot de ribbenrand. Zorg er in beide gevallen voor dat het geschoren gebied de midaxillaire lijn zijdelings bereikt.
- Om de anesthesie te behouden, plaatst u de muis in dorsale lighouding om verdoving en zuurstof te ontvangen van de neuskegel van het ademhalingssysteem (niet-rebreathing), die zuurstof levert met een snelheid van 1 L ·min−1 en isofluraan (1,5% -2,5%).
OPMERKING: Het chirurgische werkoppervlak is een chirurgisch bord over een verwarmingskussen en elke ledemaat van de muis is beveiligd met microporiëntape. - Gezien de moeilijkheid om de fysiologische veranderingen die gepaard gaan met anesthesie bij muizen uitgebreid te volgen, moet u beperkte parameters controleren en registreren. Controleer de temperatuur, diepte van de anesthesie en ademhalingsfrequentie ten minste elke 5 minuten voor de duur van de anesthesie.
- Om ernstige onderkoeling en hyperthermie (door actieve opwarming door het warmtekussen) te voorkomen, controleert u de lichaamstemperatuur tijdens de procedure. Breng een schone, gesmeerde rectale sonde in het rectum van het dier en bevestig deze vervolgens aan de operatieplaat met microporiëntape.
OPMERKING: Deze sonde wordt teruggevoerd naar een dynamisch systeem (een kenmerk van het anesthesiesysteem), dat de temperatuur van het verwarmingskussen wijzigt om de lichaamstemperatuur te regelen. - Laat de persoon die verantwoordelijk is voor anesthesie de anesthesiediepte beoordelen door reacties op stimulatie van de poot of staart te observeren door druk uitgeoefend door een atraumatische tang, de palpebrale reflex en spiertonus.
- Meet de ademhalingsfrequentie door de beweging van de borstwand te observeren terwijl de ademhalingsinspanning subjectief wordt geobserveerd om het getijdenvolume te beoordelen. Bereken de ademhalingsfrequentie door ademhalingen over een periode van 10-15 s te tellen en te vermenigvuldigen met respectievelijk 6 of 4 om een ademfrequentie / min te bepalen.
- Om ernstige onderkoeling en hyperthermie (door actieve opwarming door het warmtekussen) te voorkomen, controleert u de lichaamstemperatuur tijdens de procedure. Breng een schone, gesmeerde rectale sonde in het rectum van het dier en bevestig deze vervolgens aan de operatieplaat met microporiëntape.
- Om de huid voor te bereiden, desinfecteert u de operatieplaats met steriele applicatoren met katoenpunt. Breng chloorhexidine aan in een cirkelvormige, uitdijende beweging die werkt vanuit het midden van de chirurgische site naar de randen. Herhaal dit proces 3x (met elke keer een nieuwe applicator met katoenpunt) voordat u een combinatie van chloorhexidine en ethanol met een nieuwe steriele applicator met katoenpunt in hetzelfde patroon aanbrengt, die van het midden van de chirurgische plaats naar de rand gaat.
- Laat de chirurg een handgel op basis van ethanol aanbrengen voordat hij een steriele operatiejas en steriele chirurgische handschoenen aantrekt.
- Om het chirurgische veld voor te bereiden, plaatst u steriele chirurgische gordijnen (voorgesneden tot 25 cm x 25 cm) aan weerszijden van de chirurgische plaat, die dienen als de plaats om steriele instrumenten te plaatsen. Gebruik een steriele schaar om een breder steriel gordijn van 25 cm x 40 cm te schermen om een kleine (iets langer dan de incisieplaats), ovaalvormige opening te knippen. Leg dit gordijn over de bovenkant van het dier, zodat de fenestratie zich op de voorgestelde incisieplaats bevindt. Zorg ervoor dat de laterale uiteinden van dit derde gordijn de twee kleinere gordijnen aan weerszijden overlappen om een doorlopend chirurgisch veld te creëren.
2. Donorchirurgie
OPMERKING: Zie aanvullende figuur S1 voor de belangrijkste aspecten van donorchirurgie.
- Voer de donoroperatie uit met behulp van een chirurgische binoculaire microscoop. Gebruik om te beginnen een vergroting van 8x en voer een ventrale middellijn huidincisie uit met behulp van een chirurgisch scalpelmes (# 23). Zorg ervoor dat de incisie zich uitstrekt van het caudale uiteinde van het geschoren gebied tot de ribbenrand met een intacte marge van de voorbereide huid aan beide uiteinden.
OPMERKING: De beginvergroting van 8x is gekozen om voldoende visualisatie van de macrostructuur van het onderwerp aan het begin van de operatie mogelijk te maken. Vanaf dit punt is de vergroting naar goeddunken van de operator en moet deze worden geselecteerd om een passend evenwicht te bieden tussen het situationele bewustzijn dat wordt geboden door een lagere vergroting en de fijne details die kunnen worden gevisualiseerd met een hogere vergroting. - Gebruik twee steriele applicatoren met katoenpunt, bevochtigd met verwarmde normale zoutoplossing, verschuif de dunne darm om de abdominale aorta en inferieure vena cava (IVC) bloot te leggen. Gebruik de applicatoren om deze vaten botweg te ontleden van het omliggende weefsel.
- Gebruik een spuit van 3,0 ml met een naald van 30 G, 0,5 inch om 2,5 ml 100 IE−ml−1 gehepariniseerde natriumchloride 0,9% oplossing op te zuigen (op 4 °C gehouden totdat deze tijdens de operatie nodig is). Gebruik een rechte, ronde hechttang met de niet-dominante hand om de abdominale aorta in het infra-diafragmatische gebied vast te zetten, gebruik de dominante hand om 1,5 ml oplossing in de aorta in de richting van het hart te injecteren. Sluit de resulterende aortotomie af met druk van een applicator met katoenpunt.
- Gebruik een microchirurgische schaar met rechte punt om de IVC te transecteren om exsanguinatie mogelijk te maken.
- Voer een thoracotomie uit met een chirurgische schaar om twee incisies in de bilaterale midaxillaire lijnen te maken. Bevestig op dit punt de dood van het dier en schakel de isofluraan vaporizer uit.
- Bevestig het resulterende mediane segment van de thoracale wand met behulp van een micro-bulldogklem. Geef dit door aan de niet-steriele chirurgische assistent die dit met microporiën chirurgische tape aan de neuskegel kan bevestigen.
OPMERKING: Het doel is om tractie te bieden op dit segment van thorax, dat helpt bij de blootstelling van de hartweefsels. - Gebruik een ronde lichaamshechttang om de intra-thoracale IVC te identificeren en te mobiliseren.
OPMERKING: Idealiter bevindt de tang met rechte punt zich in de niet-dominante hand en de gebogen tang in de dominante hand. - Gebruik de dominante hand om de resterende 1,5 ml 100 IE·ml−1 gehepariniseerde natriumchloride 0,9% oplossing in het hart te injecteren met de IVC in de tang van de niet-dominante hand.
- Gebruik beide sets tangen om de IVC te ligaten met 7/0 gevlochten zijde van 2 cm lengte. Gebruik de knoop van een instrumentbinder met twee extra worpen voor de veiligheid. Maak deze knoop zo proximaal mogelijk langs het vat naar het hart.
- Zet de twee uiteinden van deze knoop vast met een slagadertang. Plaats deze tangen zo dat ze een zachte tractie van het hart in de caudale richting bieden om een optimale vaatpositionering voor daaropvolgende dissectie te vergemakkelijken.
- Identificeer de thymus bij het anterosuperior aspect van het hart. Gebruik een tang om dit orgaan van de donor te ontleden om de superieure vena cava (SVC) te identificeren.
- Verwijder de adventitia en bijbehorende weefsels van de SVC met behulp van een tang. Gebruik een gebogen tang om bot te ontleden en een klein kanaal achter het vat te maken. Zorg ervoor dat dit kanaal zo proximaal mogelijk is ten opzichte van het hart.
- Haal een stuk 7/0 gevlochten zijde van 2 cm lengte door dit kanaal met een tang en bind het vervolgens vast met behulp van de bovengenoemde techniek.
- Op een punt ongeveer 2 mm van deze ligatie (aan de kant tegenover het hart), verdeel de SVC met behulp van een gebogen microchirurgische schaar.
- Gebruik applicatoren met katoenpunt om het hart naar rechts te draaien.
- Identificeer de azygote ader aan de anatomische linkerkant van het hart. Gebruik een tang om het botweg te ontleden van omliggende structuren. Gebruik net als voorheen een tang met gebogen punt om een klein kanaal achter dit vat te creëren.
- Gebruik een derde stuk 7/0 gevlochten zijde gesneden tot 2 cm om de azygote ader op maximale nabijheid van het hart te brengen met behulp van dezelfde knoopbindtechniek. Snijd het vat 2 mm van de ligatie aan de zijkant weg van het hart.
- Draai met behulp van katoenen applicators de top van het hart terug naar de anatomische linkerkant. Gebruik een tang om de opgaande aorta te identificeren en te mobiliseren. Passeer de gebogen tang onder de aortaboog om een kanaal te creëren tussen de opgaande en dalende aorta.
- Met een microchirurgische schaar met rechte punt, transect de aortaboog proximaal naar zijn takken.
- Met behulp van een tang, identificeren en mobiliseren van de longslagader. Maak met een gebogen tang een kanaal achter het vat.
- Met behulp van een microchirurgische schaar met rechte punt, transect de slagader op een punt net proximaal van de bifurcatie.
- Gebruik een Rycroft irrigerende canule om voorzichtig 2 ml 10 IE· ml−1 gehepariniseerd natriumchloride 0,9% door de longslagader en opgaande aorta te injecteren om het resterende bloed uit het hart te spoelen.
OPMERKING: Een adequate spoeling wordt aangegeven door de klaring van zichtbaar bloed uit de kransslagaders. - Gebruik een stuk van 3 cm 7/0 gevlochten zijde om de resterende achterste vaten (de longaders) en bloc te ligaten met behulp van een chirurgenknoop met twee opeenvolgende worpen. Scheid het hart van de achterste thoracale wand door voorzichtig te knippen met een chirurgische schaar.
- Verwijder het hart voorzichtig uit de thorax, dompel het onder in de University of Wisconsin Solution (UWS) en plaats het vervolgens op ijs voor opslag (bij 4 ° C).
3. Operatie van de ontvanger
- Breng na de bereiding van het dier zoals beschreven in rubriek 1 oogglijmiddel aan. Injecteer een op gewicht gebaseerde dosis (8 mg / kg) bupivacaïne (0,25% verdund tot 0,625 mg / ml in natriumchloride 0,9% oplossing) in het onderhuidse weefsel van de ventrale buik langs de geplande incisieplaats. Gebruik een insulinespuit van 29 G voor deze injectie en zoek naar een rechte lijn van zichtbare blebbing die de omvang van de geplande incisie bedekt (aanvullende figuur S2A-C).
OPMERKING: Vijf-zeven minuten moeten worden gegeven om tijd te geven voor het piekeffect van de lokale verdoving. - Met de microscoop ingesteld op 8x vergroting, maak een ventrale middellijn huidincisie met behulp van een steriel chirurgisch scalpelmes (# 23). Zorg ervoor dat de laparotomie zich uitstrekt van de onderbuik tot de ribbenmarge. Plaats een oprolmechanisme om het chirurgische veld te maximaliseren (aanvullende figuur S2D).
- Bevochtig een segment van 5 cm x 5 cm steriel gaas met verwarmde 0,9% natriumchlorideoplossing en plaats het op het superieure aspect van de chirurgische plaats. Gebruik bevochtigde steriele wattenstaafjes, verwijder de darmen voorzichtig, plaats ze op dit gaas en wikkel het gaas rond het orgaan (aanvullende figuur S3A).
OPMERKING: Deze procedure helpt ongevoelig vochtverlies tijdens de operatie te verminderen en helpt bij het terugtrekken. - Bevrijd en mobiliseer de abdominale aorta en IVC uit omliggende weefsels met behulp van een stompe dissectietechniek. Gebruik voor deze stap een combinatie van applicators met katoenen punt en een hechttang met ronde romp. Zorg ervoor dat het klaringsgebied zich tussen het infra-renale aspect van de vaten en net boven de bifurcatie van de aorta bevindt (aanvullende figuur S3B).
OPMERKING: Geschikte visualisatie op dit punt zal vasculaire anastomosen van hoge kwaliteit vergemakkelijken. - Identificeer de achterste buikvaten. Trek met behulp van een tang de aorta voorzichtig in een richting weg van de wervelkolom (d.w.z. longitudinaal naar de as van de buikvaten).
OPMERKING: Het is belangrijk dat alleen de aorta en niet de IVC op een dergelijke manier wordt behandeld vanwege de brokkeligheid van de laatste. - Ligate elk abdominaal vat geïdentificeerd in de geplande anastomotische zone. Maak cefacalcaal een kanaal aan weerszijden van deze vaten door de gebogen tang achteraan naar de buikvaten aan weerszijden te laten gaan. Ligate elk vat dat op deze manier wordt geïdentificeerd en gemobiliseerd met behulp van lengtes van 10/0 nylon die met instrumenten in de knopen van de chirurg zijn gebonden met één extra worp (aanvullende figuur S3C).
- Isoleer de anastomotische plaats van circulatie. Om dit te doen, installeert u een chirurgische klem zowel op het hoofd als vervolgens op de caudale uiteinden van de buikvaten (belangrijk, in die precieze volgorde). Zorg ervoor dat de klemmen beide vaten in voldoende mate kruisen om volledige occlusie te garanderen.
- Gebruik een tang in de niet-dominante hand om de aorta stabiel te houden en voer een aortotomie uit met behulp van een naald van 30 G aan het voorste aspect van de aorta. Verleng het met een microchirurgische schaar met rechte punt (aanvullende figuur S3D).
- Voer een venotomie uit. Gebruik een rechte tang om zachte anterieure tractie toe te passen op de IVC op het punt in lijn met het midden van de aortotomie. Gebruik een gebogen microchirurgische schaar met de concave kant naar buiten gericht om een segment IVC van gelijke lengte als de aorthotomie te verwijderen (aanvullende figuur S4A).
- Was met behulp van 10 IE·ml−1 gehepariniseerde natriumchlorideoplossing de binnenkant van de geopende bloedvaten met achtergebleven bloed.
- Plaats het donorhart in de buik. Zorg ervoor dat de positionering zodanig is dat de opgaande aorta direct naast de abdominale aortomie ligt en het hart wordt gedraaid zodat de longslagader kan worden overgetrokken voor de tweede anastomose.
- Plaats met behulp van 10/0 nylon een verblijfhechting tussen de 12 uur positie van de aorthotomie en het overeenkomstige uiteinde van het lumen van de opgaande aorta. Voer dit uit met een tang met een rechte punt en een microchirurgische naaldhouder en bind deze met behulp van een chirurgenknoop met drie opeenvolgende worpen. Snijd de uiteinden af om ongeveer 2 mm hechtdraad achter te laten.
- Plaats een tweede verblijfhechting tussen de 6 uur positie van de aorthotomie en het overeenkomstige aspect van de opgaande aorta. Aangezien deze hechting ook als basis zal dienen voor volgende lopende hechtingen, laat u ten minste 10 mm van de staart over voor de ultieme tie-off.
- Plaats een doorlopende hechting van 10/0 nylon op een oplopende manier om de anatomische rechterrand van de aortotomie en de overeenkomstige vrije rand van de opgaande aorta tegen te werken. Gebruik ongeveer vier worpen voor deze lijn.
- Passeer het vrije uiteinde van de hechting rond de distale verblijfhechting voordat u een tweede doorlopende lopende hechting langs de anatomische linkerkant plaatst om de appositie met de resterende vrije rand van de aortomie te beïnvloeden. Bind de hechting aan de staart af met behulp van een chirurgenknoop met twee extra worpen.
- Plaats een verblijfhechting tussen de 12 uur-positie van de IVC-venotomie en de overeenkomstige extremiteit van het lumen van de longslagader.
- Plaats vanaf dit ankerpunt een doorlopende lopende hechting op een dalende manier tussen de anatomische linkerrand van de longslagader en de overeenkomstige rand van de venotomie. Gebruik een gemiddelde van vier worpen voor deze lijn gevolgd door één tussen de 6 uur positie van de venotomie en de overeenkomstige extremiteit van het lumen van de longslagader. Maak nog vier worpen om de laatste vrije randen van de longslagader en venotomie samen te trekken.
- Bind het vrije uiteinde van de hechting af aan het ankeruiteinde met behulp van een knoop van een instrumentbinder met twee extra worpen.
- Verplaats het hart om centraal in de buik te zitten met behulp van wattenstaafjes. Controleer de bloedvaten op draaien, wat de bloedstroom zou verstoren.
- Plaats gelschuim over alle hechtlijnen (aanvullende figuur S4B). Plaats en vorm er twee stukken van elk ongeveer 2 mm omheen, zodat alle zichtbare hechtlijnen bedekt zijn.
- Laat de vaatklemmen los: eerst de caudale klem en dan de cefalo-klem. Aangezien een kleine hoeveelheid bloeding te verwachten is, plaatst u preventief katoenen applicators over de anastomotische plaatsen om druk uit te oefenen.
- Eenmaal vrij van waarneembare lekken, beoordeelt u het hart op pulsatie (aanvullende figuur S4C). Als dit niet gebeurt, controleer dan of er geen verdraaiing van de hartvaten is opgetreden (vooral voor het IVC).
- Herpositioneer de darmen nu over en rond het hart. Als het droog lijkt, bevochtig dan de peritoneale holte met behulp van een verwarmde natriumchlorideoplossing.
- Sluit de buikholte met behulp van niet-absorbeerbare 6/0 prolene monofilament door lagen:
eerst de spierlaag en dan de huid (Supplemental Figure S4D). Gebruik de continue niet-onderbroken techniek. - Verwijder de ontvanger voorzichtig van de operatieplaat en haal deze uit de verdoving.
- Dien 1 ml warme zoutoplossing subcutaan toe en plaats de ontvanger in een vooraf voorbereide kooi met opwarming voor observatie volgens postoperatieve herstelprotocollen (aanvullende figuur S4E).
4. Postoperatieve zorg
- Plaats de ontvanger onmiddellijk na de operatie in een schone kooi op een verwarmingskussen onder nauwkeurige observatie gedurende ten minste 3 uur. Controleer tijdens deze periode verschillende parameters (activiteit, lichaamshouding, vachtconditie, gezichtsuitdrukking, gang, ventilatie, uiterlijk van de operatieplaats, aanwezigheid van een voelbare buikhartslag) ten minste elke 30 minuten. Ken een score toe aan elke parameter (0 = normaal, 1 = licht of met tussenpozen abnormaal, 2 = matig of consistent abnormaal).
OPMERKING: Interventies worden geactiveerd door de som van de bewaakte parameters die de welzijnsscores overschrijden die zijn gespecificeerd in het ethische protocol met betrekking tot dit model. - Verplaats de ontvangers naar een verwarmde kast die op 25 °C wordt bewaard, waar ze tot na dag 7 blijven. Controleer ze de eerste 3 dagen minstens 2x per dag. Controleer ze gedurende de resterende 4 dagen minstens 1x per dag. Voor postoperatieve analgesie, dien een dosis buprenorfine (0,5-0,1 mg / kg, verdund tot 0,03 mg / ml met natriumchloride 0,9%) subcutaan toe aan de ontvangende muis op de avond na de operatie en tweemaal daags gedurende de volgende 3 postoperatieve dagen.
- Eenmaal uit de verwarmde kast verwijderd, controleert u de ontvangers ten minste 2x per week tot het juiste experimentele eindpunt.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Om de effectiviteit van de chirurgische techniek te bepalen bij het bevorderen van goede resultaten van wondgenezing en muisherstel, bepaalden vroege experimenten in het laboratorium de overlevingskenmerken van een reeks harttransplantaten met variabele immunogeniciteit voor de ontvanger. Deze omvatten congene (n = 5) en syngene (n = 5) grafts, die dezelfde major histocompatibility complex (MHC) markers delen als de ontvanger, en major mismatch grafts (n = 9), waarbij het transplantaat en de ontvanger verschillende MHC-m...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het murine orthotopische harttransplantatiemodel is een robuust preklinisch model dat voornamelijk wordt gebruikt om de effecten van MHC-mismatch op het niveau en de aard van immunologische afstoting en, meer recent, het effect van transplantatie op het behoud van immuniteit van transplantaatweefsel te onderzoeken16. Hoewel we in eerste instantie het Corry et al.7-protocol op de voet volgden, hebben we het protocol verfijnd om best-practice normen voor aseptische techniek, ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.
Dankbetuigingen
De auteurs willen graag de uitstekende inspanningen erkennen van het dierenverzorgingspersoneel van de Universiteit van West-Australië en van het Harry Perkins Institute of Medical Research, wiens toewijding en expertise hebben bijgedragen aan de haalbaarheid en het succes van deze operaties.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 2030 Rycroft irrigating cannula 30 G | McFarlane | 56005HU | |
| Braided surgical silk 7-0 | |||
| Bulldog clamp curved - 35 mm | Roboz | RS-7441-5 | |
| Bupivacaine 0.25% | |||
| Buprenorphine | |||
| Castroviejo needle holder catch curved - 145 mm | Haag-Streit | 11.62.15 | |
| Chlorhexidine 5% solution | Ebos | JJ61371 | |
| Cotton-tipped applicator - 7.5 cm | Dove | SN109510 | |
| Ethanol 70% solution | Ebos | WH130192EE | |
| Gauze 5 x 5 cm white | Aero | AGS50 | |
| Gelfoam 80 mm x 125 mm | Pfizer | 7481D | |
| Hair clipper | Wahl | 9860L | |
| Heparin 1,000 IU in 1 mL | |||
| Iris SuperCut scissors straight - 11.5 cm | Inka Surgical | 11550.11 | |
| Isoflurane vaporiser | Darvall | 9176 | |
| Micro bulldog clamp - 3.7 cm | Greman | 14119-G | |
| Micro scissors curved 105 mm | |||
| Micropore plain paper surgical tape - 2.5 cm wide | Ebos | 7810L | |
| Microsurgical scissors - curved tip | |||
| Monofilament polyprolene suture - 5/0 | Surgipro | P-205-X | |
| Myweigh i101 Precision Scale 100 g x 0.005 g | Myweigh | Kit00053 | |
| Needle - 30 G x 0.5 inch | BD | BD304000 | |
| Needleholder 15 cm curved "super fine" | Surgical Specialists | ST-B-15-8.2 | |
| Nylene 10/0 x 15 cm on 3.8 mm 3/8 circle round bodied taper (diam 0.07mm) CV300 | |||
| Round body suture forceps curved 0.3 mm 120 mm | B. Braun | FD281R | |
| Round body suture forceps straight 0.3 mm 120 mm | B. Braun | FD280R | |
| Round handled vannas spring scissors-str/12.5 cm | 15400-12 | ||
| Spring scissors-Cvd Sm blades | 15001-08 | ||
| Stevens scissors blunt straight 110 mm | |||
| Surgical backboard | Rigid laminated cardboard. 15 x 15 cm | ||
| Surgical drapes | Cut into two sizes. 25 cm x 25 cm, and 25 cm x 40 cm | ||
| Surgical microscope | |||
| Syringe - 1 mL | BD | 592696 | |
| Syringe - 3 mL | Leica | M651 | |
| Toothed forceps | BD | 309657 | |
| University of Wisconsin Solution | |||
| Warming pad | Far infrared warming pad 20 x 25 cm | ||
| Westcott spring scissors | |||
| Yasargil clip applier bayonet | Aesculap | FE582K | |
| Yasargil titanium clip perm 6.6 mm | Aesculap | A19FT222T | |
| Mouse usage | |||
| Strain/SEX/Weight | Donor | Recipent | |
| BALB/c, female, 19-23 g | 7 | 21 | |
| C57BL/6, female, 17-20 g | 7 | ||
| CD45.1 BALB/c, female, 17-21 g | 5 |
Referenties
- Mann, F. C., Priestley, J. T., Markowitz, J., Yater, W. M. Transplantation of the intact mammalian heart. Archives of Surgery. 26 (2), 219-224 (1933).
- Neptune, W. B., Cookson, B. A., Bailey, C. P., Appler, R., Rajkowski, F. Complete homologous heart transplantation. A.M.A. Archives of Surgery. 66 (2), 174-178 (1953).
- Downie, H. G. Homotransplantation of the dog heart. A.M.A. Archives of Surgery. 66 (5), 624-636 (1953).
- Blanco, G., Adam, A., Rodriguezperez, D., Fernandez, A. Complete homotransplantation of canine heart and lungs. A.M.A. Archives of Surgery. 76 (1), 20-23 (1958).
- Abbott, C. P., Lindsey, E. S., Creech, O., Dewitt, C. W. A technique for heart transplantation in the rat. Archives of Surgery. 89, 645-652 (1964).
- Ono, K., Lindsey, E. S. Improved technique of heart transplantation in rats. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 57 (2), 225-229 (1969).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16 (4), 343-350 (1973).
- Joffre, O., et al. Prevention of acute and chronic allograft rejection with CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T lymphocytes. Nature Medicine. 14 (1), 88-92 (2008).
- Gregori, S., et al. Regulatory T cells induced by 1 alpha,25-dihydroxyvitamin D3 and mycophenolate mofetil treatment mediate transplantation tolerance. The Journal of Immunology. 167 (4), 1945-1953 (2001).
- Niimi, M. The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice: Experience of 3000 operations by one surgeon. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 20 (10), 1123-1128 (2001).
- Hasegawa, T., Visovatti, S. H., Hyman, M. C., Hayasaki, T., Pinsky, D. J. Heterotopic vascularized murine cardiac transplantation to study graft arteriopathy. Nature Protocols. 2 (3), 471-480 (2007).
- Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A. Techniques in aseptic rodent surgery. Current Protocols in Immunology. 82, 1-14 (2008).
- Navarro, K. L., et al. Mouse anesthesia: The art and science. ILAR Journal. , (2021).
- Adams, S., Pacharinsak, C. Mouse anesthesia and analgesia. Current Protocols in Mouse Biology. 5 (1), 51-63 (2015).
- Australian code for the care and use of animals for scientific purposes. NHMRC. , Available from: https://www.nhmrc.gov.au/about-us/publications/australian-code-care-and-use-animals-scientific-purposes (2013).
- Prosser, A., et al. Dynamic changes to tissue-resident immunity after MHC-matched and MHC-mismatched solid organ transplantation. Cell Reports. 35 (7), 109141(2021).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
