Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Fluorescerende in situ hybridisatie en 5-ethynyl-2'-deoxyuridine-etikettering voor stamachtige cellen in de hydrozoaire kwal Cladonema pacificum

2.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64285

⸱

3 augustus 2022

 ,  ,  , 
1Graduate School of Life Sciences, Tohoku University, 2Graduate School of Pharmaceutical Sciences, The University of Tokyo

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we een protocol voor het visualiseren van stamachtige prolifererende cellen in de kwal Cladonema. Whole-mount fluorescerende in situ hybridisatie met een stamcelmarker maakt de detectie van stamachtige cellen mogelijk, en 5-ethynyl-2'-deoxyuridine-etikettering maakt de identificatie van prolifererende cellen mogelijk. Samen kunnen actief prolifererende stamcellen worden gedetecteerd.

Samenvatting

Cnidarians, waaronder zeeanemonen, koralen en kwallen, vertonen diverse morfologie en levensstijlen die zich manifesteren in sessiele poliepen en vrijzwemmende medusae. Zoals geïllustreerd in gevestigde modellen zoals Hydra en Nematostella, dragen stamcellen en/of proliferatieve cellen bij aan de ontwikkeling en regeneratie van cnidarische poliepen. De onderliggende cellulaire mechanismen in de meeste kwallen, met name in het medusa-stadium, zijn echter grotendeels onduidelijk en daarom is het ontwikkelen van een robuuste methode voor het identificeren van specifieke celtypen van cruciaal belang. Dit artikel beschrijft een protocol voor het visualiseren van stamachtige prolifererende cellen in de hydrozoïsche kwal Cladonema pacificum. Cladonema medusae bezitten vertakte tentakels die voortdurend groeien en het regeneratieve vermogen behouden gedurende hun volwassen stadium, en bieden een uniek platform om de cellulaire mechanismen te bestuderen die worden georkestreerd door prolifererende en / of stamachtige cellen. Whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) met behulp van een stamcelmarker maakt de detectie van stamcellen mogelijk, terwijl pulsetikettering met 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU), een S-fasemarker, de identificatie van prolifererende cellen mogelijk maakt. Door zowel FISH- als EdU-etikettering te combineren, kunnen we actief prolifererende stamachtige cellen op vaste dieren detecteren, en deze techniek kan breed worden toegepast op andere dieren, inclusief niet-modelkwallensoorten.

Inleiding

Cnidaria wordt beschouwd als een basaal vertakkend metazoazuurphylum dat dieren met zenuwen en spieren bevat, waardoor ze in een unieke positie verkeren om de evolutie van de ontwikkeling en fysiologie van dierente begrijpen 1,2. Cnidarians zijn onderverdeeld in twee hoofdgroepen: Anthozoa (bijv. Zeeanemonen en koralen) bezitten alleen planulalarven en sessiele poliepstadia, terwijl Medusozoa (leden van Hydrozoa, Staurozoa, Scyphozoa en Cubozoa) meestal de vorm aannemen van vrijzwemmende medusae of kwallen, evenals planulalarven en poliepen. Cnidarians vertonen vaak een hoge regeneratieve capaciteit en hun onderliggende cellulaire mechanismen, met name hun bezit van volwassen stamcellen en proliferatieve cellen, hebben veel aandacht getrokken 3,4. Hydrozoaire stamcellen, die aanvankelijk in Hydra werden geïdentificeerd, bevinden zich in de interstitiële ruimtes tussen ectodermale epitheelcellen en worden gewoonlijk interstitiële cellen of i-cellengenoemd 3.

Hydrozoaire i-cellen delen gemeenschappelijke kenmerken, waaronder multipotentie, de expressie van breed geconserveerde stamcelmarkers (bijv. Nanos, Piwi, Vasa) en migratiepotentieel 3,5,6,7,8. Als functionele stamcellen zijn i-cellen uitgebreid betrokken bij de ontwikkeling, fysiologie en omgevingsreacties van hydrozoïsche dieren, wat getuigt van hun hoge regeneratieve capaciteit en plasticiteit3. Hoewel stamcellen, vergelijkbaar met i-cellen, niet buiten hydrozoën zijn geïdentificeerd, zijn zelfs in de gevestigde modelsoort Nematostella nog steeds proliferatieve cellen betrokken bij het onderhoud en de regeneratie van somatisch weefsel, evenals de kiembaan9. Aangezien studies in cnidarian ontwikkeling en regeneratie voornamelijk zijn uitgevoerd op poliepachtige dieren zoals Hydra, Hydractinia en Nematostella, blijven de cellulaire dynamiek en functies van stamcellen in kwallensoorten grotendeels onbesproken.

De hydrozoïsche kwal Clytia hemisphaerica, een kosmopolitische kwallensoort met verschillende habitats over de hele wereld, waaronder de Middellandse Zee en Noord-Amerika, is gebruikt als een experimenteel modeldier in verschillende ontwikkelings- en evolutionaire studies10. Met zijn kleine formaat, eenvoudige bediening en grote eieren is Clytia geschikt voor laboratoriumonderhoud, evenals voor de introductie van genetische hulpmiddelen zoals de onlangs gevestigde transgenese- en knock-outmethoden11, waardoor de mogelijkheid wordt geopend voor gedetailleerde analyse van de cellulaire en moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de kwallenbiologie. In de Clytia medusa-tentakel zijn i-cellen gelokaliseerd in het proximale gebied, de bol genaamd, en voorlopercellen zoals nematoblasten migreren naar de distale punt terwijl ze zich onderscheiden in verschillende celtypen, waaronder nematocyten12.

Tijdens regeneratie van het Clytia-manubrium migreren het orale orgaan van kwallen, Nanos1 + i-cellen die aanwezig zijn in de geslachtsklieren naar het gebied waar het manubrium verloren gaat als reactie op schade en nemen deel aan de regeneratie van het manubrium7. Deze bevindingen ondersteunen het idee dat i-cellen in Clytia zich ook gedragen als functionele stamcellen die betrokken zijn bij morfogenese en regeneratie. Aangezien de eigenschappen van i-cellen echter verschillen tussen representatieve poliepachtige dieren zoals Hydra en Hydractinia3, is het mogelijk dat de kenmerken en functies van stamcellen gediversifieerd zijn tussen kwallensoorten. Bovendien zijn, met uitzondering van Clytia, experimentele technieken beperkt voor andere kwallen en is de gedetailleerde dynamiek van proliferatieve cellen en stamcellen onbekend13.

De hydrozoïsche kwal Cladonema pacificum is een opkomend modelorganisme dat in een laboratoriumomgeving kan worden gehouden zonder waterpomp of filtratiesysteem. De Cladonema medusa heeft vertakte tentakels, een gemeenschappelijk kenmerk in de Cladonematidae-familie, en een fotoreceptororgaan genaamd de ocellus op de ectodermale laag bij de bol14. Het tentakelvertakkingsproces vindt plaats op een nieuwe vertakkingsplaats die langs de adaxiale kant van de tentakel verschijnt. Na verloop van tijd blijven de tentakels uitrekken en vertakken, waarbij de oudere takken naar de punt15 worden geduwd. Bovendien kunnen Cladonema-tentakels binnen enkele dagen na amputatie regenereren. Recente studies hebben de rol van prolifererende cellen en stamachtige cellen in tentakelvertakking en regeneratie in Cladonema 16,17 gesuggereerd. Hoewel conventionele in situ hybridisatie (ISH) is gebruikt om genexpressie in Cladonema te visualiseren, is het vanwege de lage resolutie momenteel moeilijk om stamceldynamica op cellulair niveau in detail te observeren.

Dit artikel beschrijft een methode voor het visualiseren van stamachtige cellen in Cladonema door FISH en co-kleuring met EdU, een marker van celproliferatie18. We visualiseren het expressiepatroon van Nanos1, een stamcelmarker 5,17, door FISH, die de identificatie van stamachtige celverdeling op het niveau van één cel mogelijk maakt. Bovendien maakt de co-kleuring van Nanos1-expressie met EdU-etikettering het mogelijk om actief prolifererende stamachtige cellen te onderscheiden. Deze methode voor het monitoren van zowel stamachtige cellen als proliferatieve cellen kan worden toegepast op een breed scala aan onderzoeksgebieden, waaronder tentakelvertakking, weefselhomeostase en orgaanregeneratie in Cladonema, en een vergelijkbare aanpak kan worden toegepast op andere kwallensoorten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: Zie de tabel met materialen voor meer informatie over alle materialen, reagentia en apparatuur die in dit protocol worden gebruikt.

1. Probe synthese

  1. RNA-extractie
    1. Plaats drie levende Cladonema medusae die zijn gekweekt in kunstmatig zeewater (ASW) in een buis van 1,5 ml met behulp van een transferpipet van 3,1 ml met de punt afgesneden en verwijder zoveel mogelijk ASW.
      OPMERKING: ASW wordt bereid door een mengsel van minerale zouten in leidingwater op te lossen met een chloorneutralisator; het uiteindelijke soortelijk gewicht (S.G.) is 1,018 of de delen per duizend (ppt) is ~27.
    2. Vries de buizen van 1,5 ml in vloeibare stikstof om de RNase-activiteit te remmen. Voeg 30 μL lysisbuffer toe uit de totale RNA-isolatiekit waarin 2-mercaptoethanol (1 μL/100 μL lysisbuffer) is toegevoegd en homogeniseer de monsters in de lysisbuffer met behulp van een homogenisator.
      OPMERKING: Om overloop van de buffer en het monster uit de buizen te voorkomen, wordt homogenisatie met een kleine hoeveelheid lysisbuffer aanbevolen.
    3. Voeg 570 μL lysisbuffer toe en extraheer het totale RNA volgens het protocol van de totale RNA-isolatiekit (figuur 1).
    4. Meet de concentratie van het geëxtraheerde RNA met behulp van een spectrofotometer en bewaar bij −80 °C tot gebruik.
  2. cDNA synthese
    1. Gebruik een kit om cDNA te synthetiseren met behulp van het totale RNA dat uit de medusae als sjabloon is geëxtraheerd (figuur 1 en tabel 1).
    2. Incubeer bij 65 °C gedurende 5 min.
    3. Snel afkoelen op ijs.
    4. Voer cDNA-synthese uit met het mengsel uit stap 1.2.1 (tabel 1). Meng grondig door te pipetteren en incubeer bij 42 °C gedurende 60 min.
    5. Incubeer bij 95 °C gedurende 5 min.
    6. Snel afkoelen op ijs.
    7. Meet de concentratie van het gesynthetiseerde cDNA met behulp van een spectrofotometer en bewaar bij of onder −20 °C tot gebruik.
  3. PCR-productsynthese
    1. Als u een PCR-sjabloon wilt maken, ontwerpt u de specifieke primer met Primer-BLAST. Haal de referentiesequentie uit NCBI-gegevens of RNA-seq-gegevens.
      OPMERKING: Zie de tabel met materialen voor de primers die in dit protocol worden gebruikt.
    2. Om de doelsequentie te versterken, voert u TA-klonen uit, waarvoor geen restrictie-enzymen nodig zijn. Om een PCR-product te verkrijgen waarin aan het einde van 3' een adenine wordt toegevoegd, gebruikt u de volgende instellingen: 98 °C gedurende 2 minuten; 35 cycli van 98 °C gedurende 10 s, 55-60 °C gedurende 30 s, 72 °C gedurende 1 min. Gebruik Taq DNA-polymerase voor de reacties (tabel 1).
      OPMERKING: Om de PCR-condities te bepalen, volgt u het protocol dat bij het te gebruiken DNA-polymerase hoort, dat over het algemeen een aanbevolen gloeitemperatuur en verlengingstijd biedt.
    3. Laat het PCR-product door een 1% agarose-gel lopen en knip de interesseband uit. Extraheer de PCR-producten uit de gesneden gels met behulp van een gelextractiekit.
  4. Afbinding
    1. Liteer het PCR-product aan de vector met 3' thymine-overhangen door de reagentia te mengen (tabel 1) en gedurende 30 minuten bij 37 °C te broeden (figuur 1).
      OPMERKING: De moleculaire verhouding van vector:PCR moet 1:>3 zijn. De pTA2-vectorgrootte is ongeveer 3 kb. Als het PCR-product (insert) A (kb) en B (ng/μL) is, kan het volume van de insert (X in tabel 1) worden berekend door ([50 ng vector × A kb insert])/(3 kb vector × [1/3]) = 50· Een ng van insert. Als de concentratie van de insert B ng/μL is, dan is het genomen volume 50· A/B μL insert.
  5. Transformatie en beplating
    1. Ontdooi voor transformatie de competente cellen op ijs en doseer ze elk in aliquots van 20 μL. Voeg 1 μL van de plasmiden die het PCR-product bevatten (minder dan 5% van het competente celvolume) en vortex toe gedurende 1 s. Incubeer op ijs gedurende 5 minuten en incubeer vervolgens bij 42 °C gedurende 45 s en vortex gedurende 1 s.
    2. Voeg 180 μL Super Optimal bouillon met Catabolite repression (SOC) medium (een voedingsrijk bacteriekweekmedium) toe aan de competente cellen en incubeer bij 37 °C gedurende 30 minuten. Verdeel na 30 minuten de competente cellen op een agarplaat met ampicilline, 5-broom-4-chloor-3-indolyl-bèta-D-galacto-pyranoside (X-gal) en isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) en incubeer bij 37 °C gedurende 12-16 uur (figuur 1).
      OPMERKING: X-gal en IPTG worden gebruikt voor het selecteren van blauwe en witte kolonies.
  6. Vloeibare cultuur
    1. Kies een witte kolonie uit de witte en blauwe kolonies op het bord. Voeg het toe aan 3-5 ml LB-medium met ampicilline en incubeer op een shaker gedurende 12-16 uur bij 37 °C (figuur 1).
  7. Miniprep
    1. Haal het plasmide uit het LB-medium met behulp van een plasmide miniprep (figuur 1).
    2. Kwantificeer de plasmideconcentratie met behulp van een spectrofotometer.
  8. Lees de reeks.
    1. Om de DNA-sequentie van het plasmide te lezen, stuurt u het plasmide voor Sanger-sequencing en gebruikt u vervolgens software om het uit te lijnen met de genoom / transcriptoomsequentie om te bevestigen of de doelsequentie correct is gesynthetiseerd en te beoordelen in welke richting de doelsequentie in het plasmide wordt ingebracht (5 'tot 3' of 3 ' tot 5 ').
      OPMERKING: Als de doelsequentie in het plasmide wordt ingebracht in de richting van 5' tot 3' vanaf de RNA-polymerasebindingsplaats nabij het 3'-uiteinde, kan een antisense-sonde worden gegenereerd door in vitro transcriptie. Als de doelvolgorde in de omgekeerde richting van 3' tot 5' wordt ingevoegd, kan een sensorsonde (negatieve controle) worden gegenereerd. Als vectoren zoals pTA2 worden gebruikt, kunnen twee transcriptiebindingsplaatsen worden gebruikt, afhankelijk van het doel.
  9. In vitro transcriptie
    1. Bereid het DNA-sjabloon voor op basis van het gemaakte plasmide door PCR uit te voeren met primers buiten de RNA-polymerasebindingsplaats (bijv. T7/T3-bindingsplaatsen) in het plasmide (figuur 1).
      OPMERKING: Universele primers zoals de M13-20 forward primer en de M13 reverse primer kunnen worden gebruikt om een DNA-sjabloon voor te bereiden dat RNA-polymerasebindingsplaatsen bevat.
    2. Zuiver de sjabloon na PCR-versterking met behulp van een gel/PCR-extractiekit.
    3. Meng de onderstaande reagentia en voer de transcriptiereactie uit bij 37 °C gedurende 3 uur (figuur 1 en tabel 1).
    4. Voeg 1,5 μL DNase toe en incubeer bij 37 °C gedurende 30 min.
    5. Voeg 10 μL RNase-vrij water toe en zuiver de sonde uit de transcriptiereactieoplossing met behulp van een opruimkolom.
    6. Controleer de grootte van het gesynthetiseerde RNA door 1 μL op een 1% agarose gel te laden en bepaal de concentratie met behulp van een spectrofotometer.
      OPMERKING: Gesynthetiseerde RNA-sondes moeten een concentratie van ten minste 100 ng / μL hebben.
    7. Voeg 30 μL formamide toe voor opslag bij of onder −20 °C.

2. EdU-opname en -fixatie

  1. Breng Cladonema medusae (5-10 dieren per buis) in buisjes van 1,5 ml met behulp van een transferpipet van 3,5 ml en voeg ASW toe tot een totaal volume van 500 μL. Voeg 7,5 μL 10 mM EdU-stamoplossing toe en incubeer de monsters gedurende 1 uur bij 22 °C (figuur 2). De EdU-eindconcentratie is 150 μM.
    OPMERKING: Gebruik 5-7 dagen oude medusae om de vorming van de derde tak te controleren (figuur 3A). De dag dat de medusae loskomt van de poliep wordt geteld als dag 1, en op dag 5 beginnen medusae meestal een derde tak op hun hoofdtentakels te vertonen.
  2. Verwijder na 1 uur zoveel mogelijk ASW met EdU.
  3. Om de medusae te verdoven, voegt u 7% MgCl2 toe in H2O en incubeert u gedurende 5 minuten.
  4. Verwijder de 7% MgCl2 in H2O en fixeer de medusae een nacht (O.N.) bij 4 °C met 4% paraformaldehyde (PFA) in ASW (figuur 2).
    OPMERKING: Bij het uitvoeren van FISH zonder EdU-opname kunnen monsters op dezelfde manier worden gefixeerd als monsters die met EdU zijn behandeld na verdoving (stappen 2.3-2.4).

3. Fluorescerende in situ hybridisatie

  1. Proteïnase behandeling en post fixatie
    1. Verwijder de PFA en was de monsters met PBS met 0,1% Tween-20 (PBST) gedurende 3 x 10 minuten. Gebruik 300-500 μL PBST per wasbeurt.
      OPMERKING: Vanaf deze stap tot het einde van de hybridisatie moet het experiment worden uitgevoerd in een RNase-vrije omgeving, met handschoenen en een masker. De 1x PBS in deze stap moet worden gemaakt met DEPC-behandeld water. Na hybridisatie kan 1x PBS gemaakt met water zonder DEPC-behandeling worden gebruikt. Sommige ISH- en FISH-protocollen drogen monsters uit met behulp van methanolstappen, waardoor het mogelijk is om de vaste monsters bij −20 °C te bewaren tot gebruik. Om overbodig werk te voorkomen, wordt het uitdrogingsproces in dit protocol weggelaten, vooral omdat de monsters tot een paar dagen in PBST kunnen worden bewaard.
    2. Plaats het monster na fixatie in buisjes van 1,5 ml op een shaker, met uitzondering van de incubatiestap anti-DIG-POD-antilichaam O.N. (stap 3.4.2). Voeg na het wassen 10 mg/ml proteïnase K-stamoplossing toe aan PBST en incubeer de medusae met proteïnase K (eindconcentratie: 10 μg/ml) bij 37 °C gedurende 10 minuten.
    3. Verwijder de Proteïnase K-oplossing en was de monsters gedurende 2 x 1 min met PBST.
    4. Om de medusae te postfixeren, voeg 4% PFA toe in 1x PBS en incubeer bij 37 °C gedurende 15 minuten.
    5. Verwijder de PFA-oplossing en was de monsters gedurende 2 x 10 minuten met PBST.
      OPMERKING: Als het doelgen sterk tot expressie is gebracht met een laag achtergrondsignaal, kunnen stappen 3.1.2-3.1.5 worden overgeslagen.
  2. Kruising
    1. Verwijder de PBST en voeg hybridisatiebuffer toe (HB-buffer, tabel 1). Incubeer de monsters in HB Buffer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (RT). Gebruik 300-400 μL HB Buffer, wat voldoende volume biedt voor succesvolle hybridisatie.
      OPMERKING: HB Buffer, Wash Buffer 1 en Wash Buffer 2 worden bereid met 20x SSC voorraad. HB Buffer wordt bewaard bij of onder −20 °C en moet voor gebruik naar RT worden gebracht.
    2. Verwijder de HB-buffer en voeg een nieuwe HB-buffer toe. Prehybridiseren bij 55 °C gedurende ten minste 2 uur in een hybridisatie-incubator.
    3. Verwijder de HB-buffer en incubeer met HB-buffer die de sondes bevat die zijn opgeslagen in stap 1.9.7 (uiteindelijke sondeconcentratie: 0,5-1 ng/μL in HB-buffer). Hybridiseer bij 55 °C gedurende 18-24 uur (figuur 2) in een hybridisatie-incubator.
      OPMERKING: De intensiteit en specificiteit van het FISH-signaal kunnen variëren als gevolg van de genexpressie van het doel, evenals de lengte en specificiteit van de sonde. Om de intensiteit te verhogen, kunnen parameters zoals hybridisatieduur (18-72 uur) en temperatuur (50-65 °C) worden aangepast en kunnen verschillende sondes worden getest. Om niet-specifieke signalen te voorkomen, kan de behandeling met Proteïnase K (concentratie en duur) worden gewijzigd19.
  3. Sonde verwijderen
    1. Verwijder de HB-buffer met sondes en voeg vervolgens wasbuffer 1 toe (tabel 1). Was de monsters met Wash Buffer 1 gedurende 2 x 15 min op 55 °C. Gebruik 300-400 μL wasbuffer.
      OPMERKING: HB Buffer bevattende sondes kunnen herhaaldelijk worden gebruikt, tot ongeveer tien keer. Bewaar in plaats van weg te gooien de gebruikte HB-buffer met sondes bij of onder −20 °C. Verwarm wash buffer 1, wash buffer 2, 2x SSC en PBST voor gebruik voor op 55 °C.
    2. Verwijder Wash Buffer 1 en voeg vervolgens Wash Buffer 2 toe (tabel 1). Was de monsters met Wash Buffer 2 gedurende 2 x 15 min op 55 °C.
    3. Verwijder Wash Buffer 2 en voeg vervolgens 2x SSC toe. Was de monsters met 2x SSC gedurende 2 x 15 min op 55 °C.
    4. Verwijder 2x SSC en voeg vervolgens voorverwarmde PBST toe. Was de monsters gedurende 1 x 15 min met PBST op RT.
  4. Anti-DIG antilichaam incubatie
    1. Verwijder PBST en voeg vervolgens 1% blokkeringsbuffer toe. Incubeer de monsters gedurende ten minste 1 uur bij RT terwijl u langzaam schudt op een rocker.
      OPMERKING: Bereid 1% blokkeringsbuffer vers voor door 5% blokkerende buffervoorraad te verdunnen (tabel 1). Controleer de monsters voor de volgende antilichaamreactie omdat het monster de neiging heeft om aan de achterkant van het deksel of de muur te blijven plakken als gevolg van schudden.
    2. Verwijder na het blokkeren de 1% blokkeringsbuffer, voeg anti-DIG-POD-oplossing toe (1:500, in 1% blokkeringsbuffer) en incubeer de monsters O.N. bij 4 °C (figuur 2).
      OPMERKING: Zorg ervoor dat u de incubatietijd binnen 12-16 uur houdt om de detectie van niet-specifieke signalen te voorkomen.
  5. Detectie van DIG-gelabelde sonde
    1. Verwijder de anti-DIG-POD-oplossing en voeg vervolgens Tris-NaCl-Tween Buffer (TNT, tabel 1) toe. Was de monsters met TNT gedurende 3 x 10 min op RT.
      OPMERKING: Het gebruik van de tyramide signaalversterking (TSA) techniek zorgt voor een betere resolutie beeld tegen mierikswortel peroxidase-gelabelde reagentia (bijv. Anti-DIG-POD).
    2. Verdun fluorescerende kleurstof-geconjugeerde tyramide (Cy5-tyramide) stamoplossing (1:50) in de amplificatieverdunningsbuffer om de actieve Cy5-tyramide-oplossing te maken (figuur 2).
    3. Verwijder zoveel mogelijk TNT en voeg vervolgens de actieve Cy5-tyramide-oplossing toe. Incubeer de monsters gedurende 10 minuten in het donker.
    4. Was de monsters met PBST gedurende 3 x 10 minuten in het donker.
  6. Detectie van EdU
    OPMERKING: De EdU-kit detecteert geïntegreerde EdU als fluorescerende signalen (figuur 2).
    1. Om de EdU-detectiecocktail te bereiden, mengt u de componenten zoals aangegeven in tabel 1. Gebruik 100 μL EdU-detectiecocktail voor elk monster.
      OPMERKING: Bereid 1x reactiebufferadditief door 10x reactiebufferadditief te verdunnen met ultrapuur water.
    2. Verwijder PBST en voeg vervolgens de EdU-detectiecocktail toe. Incubeer in het donker gedurende 30 min.
    3. Wassen met PBST gedurende 3 x 10 min in het donker.
  7. DNA-kleuring
    1. Verdun Hoechst 33342 (1:500) in PBST om de Hoechst-oplossing te bereiden. Verwijder de PBST en voeg de Hoechst-oplossing toe. Incubeer de monsters gedurende 30 minuten in het donker (figuur 2).
    2. Was de monsters met PBST gedurende 3-4 x 10 minuten in het donker.
  8. Montage
    1. Maak een bank op de glasschuif om te voorkomen dat het monster wordt verpletterd. Breng vinyltape aan op de glasplaat en hol het midden uit.
    2. Breng de medusae over naar de bank op het schuifglas met behulp van een transferpipet van 3,1 ml met de punt afgesneden.
      OPMERKING: Pas op dat u de tentakels niet laat overlappen.
    3. Verwijder elke PBST met een P200-pipet en voeg vervolgens langzaam 70% glycerol toe als montagemedium (figuur 2).
      OPMERKING: In plaats van 70% glycerol kan anti-vervagend montagemedium worden gebruikt om te voorkomen dat de fluorescentie vervaagt.
    4. Plaats voorzichtig een coverslip op de medusae met een tang en sluit de zijkant van de coverslip af met heldere nagellak.
    5. Houd de dia's op 4 °C in het donker als u niet onmiddellijk microscopiewaarneming uitvoert.
  9. Beeldvorming
    1. Gebruik een laserscan confocale microscoop om beelden te verkrijgen. Gebruik voor een eencellige resolutie een 40x olielens of een lens voor een hogere vergroting.
    2. Open na het verkrijgen van afbeeldingen de afbeeldingen met imageJ/FIJI-software en tel cellen die positief zijn voor EdU+ en/of Nanos1+ door de multipoint tool20.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Cladonema tentakels zijn gebruikt als model om de cellulaire processen van morfogenese en regeneratie te bestuderen 15,16,17. De tentakelstructuur bestaat uit een epitheelbuis waarbij stamachtige cellen, of i-cellen, zich in het proximale gebied bevinden, de tentakelbol genoemd, en nieuwe takken worden sequentieel toegevoegd aan de achterkant van het distale gebied van de bol langs de adaxiale zijde (

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Prolifererende cellen en stamcellen zijn belangrijke cellulaire bronnen in verschillende processen zoals morfogenese, groei en regeneratie21,22. Dit artikel beschrijft een methode voor het co-kleuren van de stamcelmarker Nanos1 door FISH en EdU-etikettering in Cladonema medusae. Eerder werk met behulp van EdU- of BrdU-etikettering heeft gesuggereerd dat proliferatieve cellen lokaliseren naar de tentakelbollen 16,17

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door AMED onder grantnummer JP22gm6110025 (naar Y.N.) en door de JSPS KAKENHI Grant Number 22H02762 (naar Y.N.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2-Mercaptoethanol Wako137-06862
3.1 mL transfer pipetteThermo Scientific233-20S
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal)Wako029-15043
anti-DIG-PODRoche11207733910
Cladonema pacificum Nanos1 forward primer5’-AAGAGACACAGTCATTATCAAGC
GA-3’
Cladonema pacificum Nanos1 reverse primer5’-CGACGTGTCCAATTTTACGTGCT -3’
Cladonema pacificum Piwi forward primer5’- AAAAGAGCAGCGGCCAGAAAGA
AGGC -3’
Cladonema pacificum Piwi reverse primer5’- GCGGGTCGCATACTTGTTGGTA
CTGGC -3’
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dyeInvitrogen C10337EdU kit
Coroline offGEX Co. ltdN/Achlorine neutralizer
DIG Nucleic Acid Detection Kit Blocking ReagentRoche11175041910blocking buffer 
DIG RNA labeling mix Roche11277073910
DTT PromegaP117B
ECOS competent cell DH5αNIPPON GENE316-06233competent cell
Fast gene Gel/PCR Extraction kitFast geneFG-91302gel extraction kit
Fast gene plasmid mini kitFast geneFG-90502plasmid miniprep
FormamideWako 068-00426
Heparin sodium salt from porcineSIGMA-ALDRICH H3393-10KU
Isopropyl-β-D(-)-thiogalactopyranoside (IPTG)Wako096-05143
LB AgarInvitrogen22700-025agar plate
LB Broth BaseInvitrogen12780-052LB medium
Maleic acidWako134-00495
mini Quick spin RNA columnsRoche11814427001clean-up column
NaClWako 191-01665
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-FiThermo ScientificND-ONEC-Wspectrophotometer
Polyoxyethlene (20) Sorbitan Monolaurate (Tween-20)Wako 166-21115
PowerMasher 2nippi 891300homogenizer
Proteinase KNacarai Tesque 29442-14
RNase InhibitorTaKaRa2313A
RNeasy Mini kitQiagen 74004total RNA isolation kit
RQ1 RNase-Free DnasePromegaM6101
Saline Sodium Citrate Buffer 20x powder (20x SSC)TaKaRaT9172
SEA LIFEMarin TechN/Amixture of mineral salts
T3 RNA polymerase Roche11031163001
T7 RNA polymerase Roche10881767001
TAITEC HB-100TAITEC0040534-000Hybridization incuvator
TaKaRa Ex Taq TaKaRaRR001ATaq DNA polymerase
TaKaRa PrimeScript 2 1st strand cDNA Synthesis KitTaKaRa6210AcDNA synthesis kit
Target CloneTOYOBO TAK101pTA2 Vector
tRNARoche10109541001
TSA Plus Cyanine 5AKOYA BiosciencesNEL745001KTtyramide signal amplification (TSA) technique
Zeiss LSM 880ZEISSN/Alaser scanning confocal microscope

Referenties

  1. Leclère, L., Röttinger, E. Diversity of cnidarian muscles: Function, anatomy, development and regeneration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 157(2017).
  2. Bosch, T. C. G., et al. Back to the basics: Cnidarians start to fire. Trends in Neurosciences. 40 (2), 92-105 (2017).
  3. Gold, D. A., Jacobs, D. K. Stem cell dynamics in Cnidaria: Are there unifying principles. Development Genes and Evolution. 223 (1-2), 53-66 (2013).
  4. Technau, U., Steele, R. E. Evolutionary crossroads in developmental biology: Cnidaria. Development. 138 (8), 1447-1458 (2011).
  5. Leclère, L., et al. Maternally localized germ plasm mRNAs and germ cell/stem cell formation in the cnidarian Clytia. Developmental Biology. 364 (2), 236-248 (2012).
  6. Bradshaw, B., Thompson, K., Frank, U. Distinct mechanisms underlie oral vs aboral regeneration in the cnidarian Hydractinia echinata. eLife. 4, 05506(2015).
  7. Sinigaglia, C., et al. Pattern regulation in a regenerating jellyfish. eLife. 9, 54868(2020).
  8. David, C. N. Interstitial stem cells in Hydra: Multipotency and decision-making. The International Journal of Developmental Biology. 56 (6-7-8), 489-497 (2012).
  9. Röttinger, E. Nematostella vectensis, an emerging model for deciphering the molecular and cellular mechanisms underlying whole-body regeneration. Cells. 10 (10), 2692(2021).
  10. Houliston, E., Momose, T., Manuel, M. Clytia hemisphaerica: A jellyfish cousin joins the laboratory. Trends in Genetics. 26 (4), 159-167 (2010).
  11. Peron, S., Houliston, E., Leclère, L. The Marine Jellyfish Model, Clytia hemisphaerica. Handbook of Marine Model Organisms in Experimental Biology. Boutet, A., Shierwater, B. , CRC Press. Boca. Raton, FL. 129-147 (2021).
  12. Denker, E., Manuel, M., Leclère, L., Le Guyader, H., Rabet, N. Ordered progression of nematogenesis from stem cells through differentiation stages in the tentacle bulb of Clytia hemisphaerica (Hydrozoa, Cnidaria). Developmental Biology. 315 (1), 99-113 (2008).
  13. Fujita, S., Kuranaga, E., Nakajima, Y. Regeneration potential of jellyfish: Cellular mechanisms and molecular insights. Genes. 12 (5), 758(2021).
  14. Suga, H., et al. Flexibly deployed Pax genes in eye development at the early evolution of animals demonstrated by studies on a hydrozoan jellyfish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (32), 14263-14268 (2010).
  15. Fujiki, A. Branching pattern and morphogenesis of medusa tentacles in the jellyfish Cladonema pacificum (Hydrozoa, Cnidaria). Zoological Letters. 5 (12), 13(2019).
  16. Fujita, S., Kuranaga, E., Nakajima, Y. Cell proliferation controls body size growth, tentacle morphogenesis, and regeneration in hydrozoan jellyfish Cladonema pacificum. PeerJ. 7, 7579(2019).
  17. Hou, S., Zhu, J., Shibata, S., Nakamoto, A., Kumano, G. Repetitive accumulation of interstitial cells generates the branched structure of Cladonema medusa tentacles. Development. 148 (23), (2021).
  18. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  19. Angerer, L. M., Angerer, R. C. Detection of poly A + RNA in sea urchin eggs and embryos by quantitative in situ hybridization. Nucleic Acids Research. 9 (12), 2819-2840 (1981).
  20. Rakotomamonjy, J., Guemez-Gamboa, A. Purkinje cell survival in organotypic cerebellar slice cultures. Journal of Visualized Experiments. (154), e60353(2019).
  21. Tanaka, E. M., Reddien, P. W. The cellular basis for animal regeneration. Developmental Cell. 21 (1), 172-185 (2011).
  22. Penzo-Méndez, A. I., Stanger, B. Z. Organ-size regulation in mammals. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 019240(2015).
  23. Sinigaglia, C., Thiel, D., Hejnol, A., Houliston, E., Leclère, L. A safer, urea-based in situ hybridization method improves detection of gene expression in diverse animal species. Developmental Biology. 434 (1), 15-23 (2018).
  24. King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Developmental Biology. 13 (1), 8(2013).
  25. Flici, H., et al. An evolutionarily conserved SoxB-Hdac2 crosstalk regulates neurogenesis in a cnidarian. Cell Reports. 18 (6), 1395-1409 (2017).
  26. He, S., et al. An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis. Science. 361 (6409), 1377-1380 (2018).
  27. Govindasamy, N., Murthy, S., Ghanekar, Y. Slow-cycling stem cells in hydra contribute to head regeneration. Biology Open. 3 (12), 1236-1244 (2014).
  28. Passamaneck, Y. J., Martindale, M. Q. Cell proliferation is necessary for the regeneration of oral structures in the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis. BMC Developmental Biology. 12 (1), 34(2012).
  29. Gold, D. A., et al. Structural and developmental disparity in the tentacles of the moon jellyfish Aurelia sp.1. PLoS One. 10 (8), 0134741(2015).
  30. Gold, D. A., Nakanishi, N., Hensley, N. M., Hartenstein, V., Jacobs, D. K. Cell tracking supports secondary gastrulation in the moon jellyfish Aurelia. Development Genes and Evolution. 226 (6), 383-387 (2016).
  31. Cheng, L. -C., Alvarado, A. S. Whole-mount BrdU staining with fluorescence in situ hybridization in planarians. Planarian Regeneration. 1774, 423-434 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

EdU labelingstamcelmarkerprolifererende cellententakelregeneratieNanos1 expressiewhole mount FISH
Fluorescerende in situ hybridisatie en 5-ethynyl-2'-deoxyuridine-etikettering voor stamachtige cellen in de hydrozoaire kwal Cladonema pacificum
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.