Hier presenteren we een protocol voor een muismodel van lawaai-geïnduceerd gehoorverlies (NIHL). Om NIHL te induceren, ontwikkelden we een nieuw en eenvoudig apparaat met golfkarton, een rattenvangkooi en een luidspreker. Auditieve hersenstamrespons en immunofluorescentie beeldvorming werden gebruikt om respectievelijk de gehoorfunctie en de buitenste haarcelbeschadiging te beoordelen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Gewijzigde experimentele omstandigheden voor lawaai-geïnduceerd gehoorverlies bij muizen en beoordeling van de gehoorfunctie en schade aan de buitenste haarcellen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Een diermodel van lawaai-geïnduceerd gehoorverlies (NIHL) is nuttig voor pathologen, therapeuten, farmacologen en gehooronderzoekers om het mechanisme van NIHL grondig te begrijpen en vervolgens de bijbehorende behandelingsstrategieën te optimaliseren. Deze studie heeft tot doel een verbeterd protocol te creëren voor het ontwikkelen van een muismodel van NIHL. Mannelijke C57BL/6J muizen werden gebruikt in deze studie. Onverdoofde muizen werden blootgesteld aan harde geluiden (1 en 6 kHz, gelijktijdig gepresenteerd bij 115-125 dB SPL-A) continu gedurende 6 uur per dag gedurende 5 opeenvolgende dagen. De auditieve functie werd 1 dag en 1 week na blootstelling aan lawaai beoordeeld met behulp van auditieve hersenstamrespons (ABR). Na de ABR-meting werden de muizen opgeofferd en werden hun organen van Corti verzameld voor immunofluorescentiekleuring. Uit de metingen van de auditieve hersenstamrespons (ABR) werd 1 dag na blootstelling aan lawaai significant gehoorverlies waargenomen. Na 1 week daalden de gehoordrempels van de experimentele muizen tot ~80 dB SPL, wat nog steeds een significant hoger niveau was dan de controlemuizen (~40 dB SPL). Uit de resultaten van immunofluorescentiebeeldvorming bleek dat buitenste haarcellen (OHC's) beschadigd waren. Samenvattend hebben we een model van NIHL gemaakt met mannelijke C57BL / 6J-muizen. Een nieuw en eenvoudig apparaat voor het genereren en leveren van zuivere toonruis werd ontwikkeld en vervolgens gebruikt. Kwantitatieve metingen van gehoordrempels en morfologische bevestiging van OHC-schade toonden beide aan dat het toegepaste geluid met succes een verwacht gehoorverlies veroorzaakte.
Inleiding
Ongeveer 1,3 miljard mensen wereldwijd lijden aan gehoorverlies als gevolg van blootstelling aan lawaai1. In deze studie wilden we een duidelijk stapsgewijs proces opzetten voor het induceren en bevestigen van lawaaigeïnduceerd gehoorverlies (NIHL). NIHL is het gevolg van een degeneratie/vernietiging van de haarcellen (HC's) en spiraalvormige ganglionneuronen (SGN's), schade in de HC-stereocilia en/of verlies van synapsen tussen de cochleaire binnenste HC's en SGN's. Dergelijke afwijkingen kunnen naast NIHL ook tinnitus en verminderde spraakperceptie veroorzaken (vooral in een complexe akoestische omgeving). Sociale, psychologische en cognitieve functies kunnen achtereenvolgens worden beïnvloed door deze fysiologische tekortkomingen 2,3,4,5,6.
In NIHL-gerelateerde preklinische studies op basis van muizen zijn de meest populaire muizenstammen CBA / CaJ 2,3,6,7 en C57BL / 6 4,5,8. De mannelijke 3,4,7 muizen worden bovendien vaker gebruikt dan de vrouwelijke, omdat oestrogeen een beschermend effect heeft op het gehoor. Daarom gebruikten we in deze studie alleen mannelijke muizen9. Na verwijzing naar de literatuur kozen we 1 kHz en 6 kHz als de frequenties van de toegepaste ruis. De intensiteit van het toegepaste geluid was 115 dB SPL-A (rondom de kooi) tot 125 dB SPL-A (in het midden van de kooi). Na blootstelling van de experimentele muizen aan het geluid continu gedurende 6 uur per dag, gedurende 5 opeenvolgende dagen, gaf een optimale toename van de gehoordrempel aan dat een optimale mate van NIHL werd gegenereerd in de experimentele muizen. De handelingen voor het hanteren van de dieren, het bouwen van de experimentele opstelling en het induceren van geluid worden allemaal duidelijk stap voor stap beschreven in het meegeleverde protocol.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Dierproeven in deze studie werden goedgekeurd door de Animal Care Committee van Mackay Medical College. Acht weken oude mannelijke C57BL / 6J-muizen werden gekocht bij het National Laboratory Animal Center (New Taipei City, Taiwan). Alle muizen werden gefokt en gehuisvest volgens het standaard dierprotocol.
1. Inductie van NIHL bij muizen
- Bereid de kooi voor op de experimentele muizen
- Gebruik hiervoor een rattenvalkooi met afmetingen van 14 cm × 17 cm × 24 cm. Snijd vier stukken golfplaten in de juiste maten, zodat ze in de kooi passen (13 cm × 23 cm en 13 cm × 16 cm).
- Om te voorkomen dat de muizen hun voeten door het gaasrooster laten snijden, plaatst u twee van de stukken respectievelijk aan de onderkant en aan de achterkant. Plaats de andere twee stukken loodrecht op elkaar, om de ruimte in de kooi in vieren te verdelen.
- Voer dit onderzoek uit in een geluiddichte doos. Plaats een luidspreker 8,5 cm voor de kooi en plaats zowel de luidspreker als de kooi in een geluiddichte doos.
- Open de CLIO-toepassingssoftware
- Verplaats de cursor naar het luidsprekerpictogram en klik vervolgens op TwoSin. Voer de waarde van Freq 1 tot 1000 Hz, Freq 2 tot 6000 Hz in en wijzig deze en klik op OK om het geluid af te spelen.
- Wijzig op het tabblad Leq dBV in dBSPL. Nadat u de tijd op de software-interface hebt ingesteld, klikt u op de groene driehoekknop om het geluid af te spelen.
- Plaats een microfoon voor de luidspreker op een afstand van 8,5 cm om het geluidsniveau te kalibreren (zie Aanvullend dossier 1). Stel het geluidsniveau in op 125 dB SPL-A en monitor continu gedurende maar liefst 3 minuten om ervoor te zorgen dat het geluidsniveau voldoende stabiel is. Gebruik een generator, een analyzer en een versterker om de ruis te creëren en te regelen. (Figuur 1)
OPMERKING: Voer deze stap uit in een geluiddichte doos om schade aan het gehoor van de operator te voorkomen. - Plaats vier mannelijke C57BL/6J-muizen in de kooi (één voor elk kwartaal) voor blootstelling aan lawaai. Wijs de muizen willekeurig toe in elk kwartaal tijdens de blootstelling aan lawaai. Plaats een microfoon op de bovenkant van de kooi om het geluidsniveau tijdens de blootstelling aan lawaai te controleren (figuur 2).
OPMERKING: Voer deze stap uit in een geluiddichte doos om schade aan het gehoor van de operator te voorkomen. - Stel de muizen bloot aan het geluid met frequenties van 1 kHz en 6 kHz continu gedurende 6 uur per dag, gedurende 5 opeenvolgende dagen.
- Meet de gehoordrempels van de muizen 1 dag na de blootstelling aan lawaai (d.w.z. op de 6e dag) door de ABR te meten. Herhaal deze ABR-metingen opnieuw 1 week na de blootstelling aan lawaai (d.w.z. op de13e dag). Offer na de ABR-metingen alle betrokken muizen op en oogst hun slakkenhuis (figuur 3).
2. Auditieve hersenstamrespons (ABR)-gebaseerde beoordeling van de gehoordrempel
- Gebruik een commercieel ABR-testsysteem dat speciaal is ontworpen voor kleine dieren10.
- Injecteer intraperitoneaal een mengsel van tiletamine en zolazepam (40 mg / kg) en xylazine (9,3 mg / kg) in de muizen voor algemene anesthesie.
OPMERKING: ABR-beoordeling duurt ~ 2 uur. Zorg ervoor dat u thermische ondersteuning biedt via een verwarmingskussen en breng oogzalf aan om uitdroging te voorkomen terwijl de muis onder narcose is. - Meet de ABR in de muis onder algemene anesthesie. Plaats subdermale naaldelektroden (12 mm) op de hoekpunt, achter de pinna van het linkeroor en terug in de buurt van de staart om de gehoordrempel te meten.
- Presenteer akoestische stimuli met behulp van een luidspreker die op 1 cm van het linkeroor van het dier is geplaatst.
- Gebruik een oscilloscoop om de akoestische prikkels te regelen. Kies sinusgolf voor de prikkels en 10 k voor de vensterschaal. Draai aan de Frequentieknop om de gewenste frequentie van de akoestische prikkels te verkrijgen.
- Pas de stimulusintensiteit aan door aan de AMLP-knop op de functiegenerator te draaien. Verkrijg de gewenste stimulusintensiteit door de AMLP-knop op een geschikte spanning te draaien, berekend op basis van kalibratie.
- Verzamel de ABR-metingen onder een reeks stimulusintensiteiten, van 10 dB SPL tot 100 dB SPL, met een stapgrootte van 10 dB.
OPMERKING: Meet de gehoordrempel in een geluiddichte doos. Het minimale stimulusintensiteitsniveau dat aanleiding zou kunnen geven tot een waarneembare Golf V in het verzamelde signaal werd verondersteld de ABR-drempel10,11 te zijn (figuur 4). Controleer het dier na de ABR-beoordeling totdat het herstelt van de anesthesie (~ 1 uur).
3. Microscopisch onderzoek
- Fixeren van het geoogste weefsel
- Offer na de ABR-metingen de muis op door intraperitoneaal een mengsel van tiletamine en zolazepam (100 mg/kg) en xylazine (23,25 mg/kg) te injecteren voor het microscopisch onderzoek.
- Oogst de slakkenhuizen van de muis en dompel ze onmiddellijk onder in 10% formaldehyde (FA) voor fixatie (twee slakkenhuis/ml) gedurende ten minste 8 uur bij 4 °C.
- Vervang na fixatie de FA-oplossing door een 10% ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA)-oplossing voor ontkalking gedurende 3-4 dagen bij 4 °C. Controleer vervolgens elk slakkenhuis met een pincet om te bevestigen dat de slakkenhuizen voldoende zijn verzacht.
- Plaats het slakkenhuis in een petrischaaltje gevuld met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en snijd het spiraalvormige orgaan van Corti (OC) (elk ontkalkt slakkenhuis) in drie secties - de basale draai, middelste draai en apicale draai - voor weefselkleuring.
- Verwijder onder een ontleedmicroscoop (vergroting: 8x-35x) de benige structuren (scala vestibuli, scala tympani en modiolus) van het ontkalkte slakkenhuis en verkrijg het zachte weefsel, inclusief de OC (dikte: ongeveer 40 μm).
- Cochlea immunofluorescentie kleuring
- Bereiding van de blokkeringsbuffer: Bereid 2% runderserumalbumine (BSA) en 0,2% Triton X-100-oplossingen in PBS.
- Breng het te kleuren weefsel over van de petrischaal naar een microcentrifugebuis en dompel het weefsel gedurende 2 uur bij kamertemperatuur (RT) onder in 0,1 ml van de blokkerende buffer.
- Bereiding van de Myo7A primaire antilichaambuffer: Verdun het primaire myo7A-antilichaam in de blokkeringsbuffer met een volumeverhouding van 1:200.
- Behandel het weefsel in de microcentrifugebuis met 100 μL Myo7A primaire antilichaambuffer gedurende 2 uur bij RT.
- Spoel het weefsel drie keer in PBS gedurende 5 minuten elk.
- Bereiding van het Myo7A secundaire antilichaam (Myo7A-Rb-488) en falloïdine antilichaam (falloïdin-594) buffer: Verdun Myo7A secundair antilichaam (1:400) en falloidine antilichaam (1:200) in de blokkerende buffer.
- Behandel het weefsel met 100 μL Myo7A secundair antilichaam en falloidine antilichaambuffer gedurende 2 uur bij RT.
- Na behandeling met antilichaam + falloidine-antilichaam, spoel het weefsel in PBS drie keer, gedurende 5 minuten elk.
- Breng het gespoelde weefsel van de microcentrifugebuis over in een petrischaal gevuld met PBS met behulp van een plastic transferpipet van 1 ml met een gesneden punt.
- Om u voor te bereiden op het microscopisch onderzoek, vouwt u het weefsel open, plaatst u het op een glazen dia en voegt u 15 μL 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) fluoromount-medium toe aan het weefsel om het volledig te bedekken. Plaats een glazen afdekplaat voorzichtig over het weefsel. Laat de dia een nacht bij RT staan voordat je hem afsluit met nagellak.
- Beeldacquisitie
- Verkrijg 2D-beelden met behulp van een rechtopstaande fluorescentiemicroscoop en beeldacquisitiesoftware.
- Voordat u het microscopisch onderzoek uitvoert, centreert u het weefsel in het gezichtsveld en past u de gevoeligheid aan ISO 100 aan. Pas de belichtingstijd in eerste instantie aan door op de knop Automatische modus van de software te klikken en pas vervolgens handmatig af door op de knop Aanpassen te klikken om de signaal-ruisverhouding te optimaliseren.
- Pas de golflengte van het invallende licht aan om de fluoroforen te prikkelen door de fluorescentiekubus te draaien. Pseudokleuren werden gebruikt om de emissie van verschillende fluorescerende labels te markeren (blauw licht: DAPI; groen licht: Myo7A; rood licht: falloïdine).
- Door het weefselmonster te scannen, genereert en verzamelt u de beeldgegevens als .tif en .jpg beeldbestanden.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een verschuiving in de ABR-gehoordrempel
De gehoordrempel van de muizen werd gemeten met behulp van tone-burst ABR 1 dag of 1 week na de blootstelling aan lawaai. Een significante toename van de gehoordrempel bij alle drie de geteste frequenties werd waargenomen (12 kHz: 84,29 ± 2,77 dB SPL; 24 kHz: 91,43 ± 0,92 dB SPL; 32 kHz: 98,57 ± 1,43 dB SPL) 1 dag na de blootstelling aan lawaai (d.w.z. de6e dag). Gedeeltelijk gehoorherstel trad 1 week na de blootstelling aan lawaai op (d.w.z. de...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
NIHL kan worden onderverdeeld in twee typen: tijdelijke NIHL, die een tijdelijke verschuiving van de gehoordrempel laat zien, en permanente NIHL, die wordt gekenmerkt door een permanente gehoordrempelverschuiving. Het gehoorverlies dat we op de 6e dag (1 dag na de blootstelling aan lawaai) hebben waargenomen, wordt verondersteld een combinatie van deze twee typen te zijn. In dit geval zou de gehoordrempel in de loop van de tijd een geleidelijk herstel vertonen als gevolg van de temporele component van gehoorve...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenverstrengeling openbaar te maken.
Dankbetuigingen
We danken de subsidies van het ministerie van Wetenschap en Technologie (MOST) van de Taiwanese regering (MOST 110-2314-B-715-005, MOST 111-2314-B-715-009-MY3) en intramurale onderzoeksbeurzen van Mackay Medical College (MMC-RD-110-1B-P030, MMC-RD-111-CF-G002-03).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1/4" CCP Free-field Standard Microphone Set | GRAS | 428158 | Voor geluidsbelasting |
| Amplifier Input Module, AMI100D | BIOPAC | Voor auditieve stamhersenreactie | |
| Bio-amplifier, BIO100C | BIOPAC | Voor auditieve stamhersenreactie | |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A9647 | Immunofluorescencekleuring |
| Cellsens software | Olympus life science | Beeldverwerving | |
| Gegolfd plastic | |||
| DAPI fluoromount | SouthernBiotech | 0100-20 | Immunofluorescencekleuring |
| Ethyleendiaminetetraazijnzuur | SIGMA | E5134 | Decalcificatie |
| Evoked Response Amplifier, ERS100C | BIOPAC | Voor auditieve stamhersenreactie | |
| Formaldehyde | APLHA | F030410 | Fixatie van cochlea |
| High Performance Data Acquisition System, MP160 | BIOPAC | Voor auditieve stamhersenreactie | |
| Modular Extension Cable, MEC110C | BIOPAC | Voor auditieve stamhersenreactie | |
| Myo7A primaire antistof | Proteus | 25-6790 | Immunofluorescencekleuring |
| Myo7A secundaire antistof | Jackson immunoresearch | 711-545-152 | Immunofluorescencekleuring |
| Naaldelectroden, unipolaire 12 mmTp, EL452 | BIOPAC | Voor auditieve stamhersenreactie | |
| phalloidin antistof | Alexa Fluor | A12381 | Immunofluorescencekleuring |
| fosfaatgedempte zoutoplossing | SIGMA | P4417 | |
| Rattenval | 14 cm x 17 cm x 24cm | ||
| ROMPUN- xylazine-injectie, oplossing | Bayer HealthCare, LLC | ||
| Geluidsversterker, MT-1000 | unika | Voor geluidsbelasting | |
| Geluidsgenerator/analyser/divers, FW-02 | CLIO | 620300719 | Voor geluidsbelasting |
| Geluiddichte kamer | IEA Electro-Acoustic Technology | Voor geluidsbelasting en ABR | |
| Luidspreker | IEA Electro-Acoustic Technology | Voor geluidsbelasting | |
| Stimulator Module, STM100C | BIOPAC | Voor auditieve stamhersenreactie | |
| Triton X-100 | SIGMA | T8787 | Immunofluorescencekleuring |
| Tubephone Set, OUT101 | BIOPAC | Voor auditieve stamhersenreactie | |
| Staande microscoop, BX53 | Olympus | Beeldverwerving | |
| Zoletil | Virbac |
Referenties
- World Report on Hearing. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240020481 (2021).
- Fernandez, K. A., et al. Noise-induced cochlear synaptopathy with and without sensory cell loss. Neuroscience. 427, 43-57 (2020).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. The Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).
- Wang, J., et al. Overexpression of X-linked inhibitor of apoptosis protein protects against noise-induced hearing loss in mice. Gene Therapy. 18 (6), 560-568 (2011).
- Takeda, S., Mannström, P., Dash-Wagh, S., Yoshida, T., Ulfendahl, M. Effects of aging and noise exposure on auditory brainstem responses and number of presynaptic ribbons in inner hair cells of C57BL/6J mice. Neurophysiology. 49 (5), 316-326 (2017).
- Rouse, S. L., Matthews, I. R., Li, J., Sherr, E. H., Chan, D. K. Integrated stress response inhibition provides sex-dependent protection against noise-induced cochlear synaptopathy. Scientific Reports. 10 (1), 18063(2020).
- Amanipour, R. M., et al. Noise-induced hearing loss in mice: Effects of high and low levels of noise trauma in CBA mice. Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2018, 1210-1213 (2018).
- Edderkaoui, B., Sargsyan, L., Hetrick, A., Li, H. Deficiency of duffy antigen receptor for chemokines ameliorated cochlear damage from noise exposure. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 173(2018).
- Hultcrantz, M., Simonoska, R., Stenberg, A. E. Estrogen and hearing: a summary of recent investigations. Acta Oto-laryngologica. 126 (1), 10-14 (2006).
- Tsai, S. C. -S., et al. The intravenous administration of skin-derived mesenchymal stem cells ameliorates hearing loss and preserves cochlear hair cells in cisplatin-injected mice: SMSCs ameliorate hearing loss and preserve outer hair cells in mice. Hearing Research. 413, 108254(2022).
- Choi, M. Y., Yeo, S. W., Park, K. H. Hearing restoration in a deaf animal model with intravenous transplantation of mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord blood. Biochemical and Biophysical Research Communications. 427 (3), 629-636 (2012).
- Yu, S. -K., et al. Morphological and functional evaluation of ribbon synapses at specific frequency regions of the mouse cochlea. Journal of Visualized Experiments. (147), e59189(2019).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
