Vormen, beperken en observeren van op microtubule gebaseerde actieve nematica

Samenvatting

Hier worden methoden gepresenteerd voor het bereiden van actieve nematica uit microtubuli en kinesinemotoren, inclusief eiwitvoorbereiding en -constructie en het gebruik van putten voor actieve nematische opsluiting.

Samenvatting

De vorming van op biopolymeer gebaseerde actieve fasen is een belangrijke techniek geworden voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het verkennen van het opkomende veld van actieve vloeibare kristallen en hun mogelijke rol in de celbiologie. Deze nieuwe systemen bestaan uit zelfgestuurde subeenheden die lokaal energie verbruiken en een dynamische vloeistof uit evenwicht produceren. Om de actieve vloeibare kristalfase te vormen die in dit rapport wordt beschreven, worden gezuiverde eiwitcomponenten, waaronder biopolymeren en moleculaire motoren, gecombineerd en vormt de actieve nematische fase zich spontaan in aanwezigheid van adenosinetrifosfaat (ATP). Om de nematische toestand waar te nemen, moet het materiaal worden opgesloten in een geschikte geometrie voor microscopie bij een voldoende hoge dichtheid. Dit artikel beschrijft twee verschillende methoden voor de vorming van een actieve nematische fase met behulp van microtubuli en kinesinemotoren: assemblage van een tweedimensionale actieve laag op een olie- en waterinterface en assemblage onder een olielaag met behulp van een elastomeerbron. Technieken om het actieve materiaal in kleine putjes van verschillende vormen te steken worden ook beschreven.

Inleiding

Actieve vloeistoffen zijn samengesteld uit energiegedreven deeltjes of elementen die brandstof uit hun lokale omgeving halen. Onder de juiste omstandigheden kunnen deze beweeglijke actieve elementen collectief werken om emergente vloeistofdynamica over lange lengteschalen te produceren. Er zijn verschillende voorbeelden van dergelijk gedrag uit evenwichtsfasen in de literatuur en actieve fasen zijn te vinden in het hele spectrum van levende systemen. Enkele opmerkelijke voorbeelden zijn kolonies van bacteriën¹, celbladen ^2,3 en het zwermen of zwermen van organismen ^4,5. Actieve fasen zijn ook uitgebreid bestudeerd in gecondenseerde fasen van cytoskeletale filamenten, hetzij als onderdeel van de cel⁶ of in synthetische systemen die zijn ontworpen om gebruik te maken van biologisch geëxtraheerde componenten ^7,8,9. Vloeibare kristallijne ordening en de vorming van topologische defecten in zowel natuurlijk voorkomende als synthetische systemen samengesteld uit biologische extracten zijn van bijzonder belang voor de onderzoeksgemeenschap. In de afgelopen jaren hebben onderzoeksgroepen dergelijke systemen, hun fundamentele fysische eigenschappen en hun relevantie voor de biologie onderzocht 2,3,10,11.

Dit artikel richt zich op de vorming van de actieve nematische toestand uit een combinatie van microtubuli en kinesinemotoreiwitten. Het traditionele nematische vloeibare kristal is een evenwichtsfase van materie waarin de samenstellende moleculen een oriëntatievolgorde vertonen. Een vloeistof bestaande uit relatief stijve staafachtige moleculen kan bijvoorbeeld zowel de nematische fase als, bij hogere temperaturen, een onortiriënteerde isotrope vloeistof fase¹² vertonen. Het eerste experimentele voorbeeld van een actieve nematische fase werd ontwikkeld door Sanchez et ^al.13, waarbij een eerder in vitro experiment¹⁴ werd aangepast waarin clusters van motoreiwitten werden gebruikt om een schuifbeweging tussen naburige microtubulibundels te produceren. Toen dit microtubulisysteem beperkt was tot een dunne laag, ontstond er spontane nematische ordening. In de afgelopen jaren is de actieve nematische toestand intensief bestudeerd door verschillende experimentele^15,16 en theoretische^17,18 onderzoeksgroepen, met de nadruk op fenomenen zoals actieve turbulentie - een toestand waarin de vloeistof zelfgestuurde chaotische stromen produceert¹⁹ - en mobiele topologische defecten. Dit artikel beschrijft methoden om de actieve nematische toestand van microtubuli en kinesinemotoren in verschillende experimentele geometrieën te bereiden en te vormen. Eerst worden bereidingsmethoden voor de verschillende componentoplossingen beschreven, gevolgd door methoden voor het vormen van de actieve nematic met behulp van twee verschillende stromingskamergeometrieën. Typische beeldvormingsresultaten worden getoond. Ten slotte worden methoden beschreven voor het beperken van de actieve nematic in putten en kanalen.

Protocol

1. Voorbereiding van het actieve materiaal

OPMERKING: De 2D actieve nematic wordt geassembleerd in een proces van drie stappen. Eerst worden twee afzonderlijke oplossingen bereid: a) gepolymeriseerde, gestabiliseerde microtubuli en b) MIX (een oplossing die kinesinemotoren bevat). Deze worden gecombineerd en de activiteit wordt gestart bij het toevoegen van adenosinetrifosfaat (ATP). Het materiaal wordt dan opgesloten in een geschikte geometrie, zodat de dichtheid hoog genoeg is om een nematische orde te laten ontstaan. Protocollen zijn opgenomen voor de voorbereiding van alle benodigde componenten en hoe de actieve fase te assembleren.

1. Kinesine motoreiwit clustervoorbereiding
   1. Expresseer en zuiver recombinante K401-BIO motoreiwitten (K401 motoren) uit Escherichia coli volgens het protocol van Edgar C. Young²⁰.
      OPMERKING: K401-BIO motoreiwitten zijn dimeerachtig en bestaan uit twee koppen verbonden met een spiraalvormige stengel. De motoren werden geleverd door de Brandeis Biomaterials Facility en gebruikt zoals eerder gemeld¹⁶. Met het oog op het vormen van een actieve nematic worden de kinesinemoleculen gebiotinyleerd en vervolgens verbonden via een streptavidin-koppeling om kinesineclusters van maximaal vier motoren ^13,15,21,22 te vormen. Het is nuttig om de kinesine uit te drukken met een groene fluorescerende eiwit (GFP) tag.
   2. Na zuivering en incubatie van streptavidin en motoren op ijs gedurende 40 minuten, flash-freeze de K401 motoren in vloeibare stikstof in 5 μL aliquots bij een eindconcentratie van 0,7 mg/ml, en bewaren bij -80 °C.
      OPMERKING: Het experiment kan hier worden onderbroken. Ontdooi de kinesine voorzichtig wanneer dat nodig is en vries niet opnieuw in.
   3. Bereid clusters van biotine-gelabelde kinesine (KSA) door 24 vol% van 0,7 mg / ml K401-motoren, 27 vol% 0,325 mg / ml streptavidin en 3 vol% 5 mM dithiothreitol (DTT) te mengen (om aggregatie te voorkomen) bij 4 ° C in 46 vol% M2B-buffer (80 mM PIPES [1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, pH 6,8], 2 mM MgCl₂ en 1 mM EGTA [ethyleenglycol-bis (β-aminoethylether)-N, N,N′,N′-tetraazijnzuur]). Laat de KSA 40 min op ijs incuberen.
2. Bereiding van microtubuli-oplossingen
   OPMERKING: Guanosine-5'-[(α,β)-methyleno]trifosfaat, natriumzout (GMPCPP) is een langzaam hydrolyseerbaar analoog van Guanosinetrifosfaat (GTP), en microtubuli gevormd in aanwezigheid van GMPCPP zijn drie keer stijver dan GTP-microtubuli²³ en korter. Het gebruik van korte, stijve microtubuli is gunstig voor de vorming van de actieve nematische fase, omdat deze factoren samen de vloeibare kristallijne ordening bevorderen.
   1. Polymeriseer ongelabelde gefietste tubuline (99%, zie Tabel van materialen) met behulp van 0,6 mM GMPCPP bij een tubulineconcentratie van 6 mg / ml.
      OPMERKING: Tubuline van hoge kwaliteit kan ook worden gezuiverd uit runder- of varkenshersenen volgens vastgestelde protocollen of worden verkregen uit een andere betrouwbare bron zoals de Brandeis Biomaterials Facility, waar materialen bevroren kunnen worden verzonden om schade te voorkomen. Voor tubulinezuivering uit runderhersenen verwijzen wij u naar het gepubliceerde protocol van Bate et ^al.24. Voor tubulinezuivering uit varkenshersenen verwijzen we naar de gepubliceerde protocollen van Castoldi et ^al.25 en Tayar et ^al.26.
   2. Bereid ter voorbereiding op polymerisatie een warmtebad bij 37 °C voor en koel de centrifuge voor tot 4 °C. Combineer de ongelabelde tubuline-oplossing in M2B-buffer (stap 1.1.3) in een ultracentrifugebuis van 500 μL met 4 mol% rhodamine-gelabelde tubuline (zie materiaaltabel) om 4% gelabelde microtubuli te produceren na polymerisatie.
   3. Controleer de tubulineconcentratie met behulp van een Bradford-test²⁷. De totale tubulineconcentratie in de centrifugebuis moet 6,5-6,9 mg/ml zijn.
   4. Incubeer het tubulinemengsel op ijs gedurende 10 minuten en ultracentrifugeer gedurende 10 minuten bij 352.700 x g bij 4 °C. Deze stap verwijdert disfunctionele tubuline, die in de pellet zal zitten.
   5. Gebruik een pipet om het supernatant met functionele tubuline voorzichtig in een microcentrifugebuis te extraheren. Voeg GMPCPP toe aan een eindconcentratie van 0,6 mM om tubulinepolymerisatie te induceren en DTT tot een eindconcentratie van 1 mM om eiwitaggregatie te voorkomen.
   6. Incubeer het mengsel in het warmtebad bij 37 °C gedurende 30 minuten en centrifugeer het vervolgens opnieuw gedurende 10 minuten bij 14.000 x g bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en verdun de pellet vervolgens met M2B-buffer om een uiteindelijke microtubuliconcentratie van 6 mg / ml te bereiken.
      OPMERKING: Deze oplossing kan voor gebruik ten minste 4 uur bij kamertemperatuur worden bewaard.
   7. Om te controleren of de microtubuli met succes zijn gepolymeriseerd, verdunt u 1 μL van de microtubulioplossing 100:1 met M2B-buffer en pipet op een microscoopglaasje. Bedek met een afdekslip voor beeldvorming met behulp van een fluorescentiemicroscoop (zie Materiaaltabel) met een 40x objectieflens.
      OPMERKING: Excitatie- en emissiegolflengten worden gekozen op basis van de fluorescentielabels die op de microtubuli worden gebruikt. In dit protocol wordt rhodamine-etikettering gebruikt (zie stap 1.2.2), dus beeldvorming wordt uitgevoerd met behulp van een excitatieband van 515-560 nm en een 590 nm langdoorlaatfilter. Figuur 1 toont een representatief voorbeeld.
   8. Nadat de polymerisatie is voltooid, bevriest u de microtubuli als 2 μL-aliquots in vloeibare stikstof en bewaart u deze bij -80 °C (indien nodig).
3. Bereiding van MIX
   OPMERKING: MIX is een waterige oplossing die de kinesine-streptavidin clusters (KSA) omvat. Bereide MIX moet voorafgaand aan het experiment bij -80 °C in aliquots van 4 μL worden bewaard. Wanneer MIX wordt gecombineerd met ATP en de in stap 1.2 beschreven microtubule-oplossing bij kamertemperatuur, wordt de activiteit gestart. MIX wordt als volgt bereid ^13,19.
   1. Bereid een oplossing voor om fluorescentievervaging (ANTIFADE) te voorkomen door twee antioxiderende oplossingen te mengen. Combineer AO1 (250 mM DTT, 65 mM catalase) en AO2 (750 μM catalase, 3 mM glucoseoxidase) in een volumeverhouding van 1:1. Inclusief 20 mM Trolox, een andere antioxidant die wordt gebruikt om schade veroorzaakt door fluorescentiemicroscopie te verminderen.
   2. Bereid MIX voor door een oplossing van KSA te maken (beschreven in stap 1.1.3) die 6 wt% 20 kDa polyethyleenglycol (PEG) bevat om bundeling van de microtubuli, 3 vol% ANTIFADE en 5 vol% pyruvaatkinase/melkzuurdehydrogenase (PKLDH) bij 70 mg/ml voor ATP-regeneratie te induceren.

2. Het creëren van de actieve nematic

OPMERKING: Activiteit in het materiaal wordt geïnitieerd door ATP-toevoeging. Het actieve netwerk wordt voor elk experiment vers bereid door ATP toe te voegen in een concentratie die hoog genoeg is om motorische activiteit te induceren. Om een uniforme, volledig ontwikkelde actieve nematische fase te vormen, moeten de microtubuli een voldoende hoge dichtheid hebben. Dit kan worden bereikt door de microtubuli tussen twee onmengbare vloeistoffen te beperken om een tweedimensionale (2D) actieve nematische laag te vormen. Deze methode werd oorspronkelijk ontwikkeld aan de Brandeis University¹³ en blijft een populaire techniek voor het produceren van een homogene, hoogwaardige, actieve nematische fase.

1. Flowcelmethode voor actieve nematische vorming
   1. Bereid hydrofiele coverslips voor met een acrylamidecoating.
      1. Reinig de coverslips grondig met zeepsop, ethanol en 0,1 M NaOH met afwisselende spoelingen met nanopoerwater. Na het spoelen, bedekt u de coverslips met een silaanoplossing bestaande uit 100 ml ethanol, 1 ml azijnzuur en 500 μL 3-(trimethoxysilyl)propylmethacrylaat gedurende 15 minuten en spoel vervolgens af met nanopoerwater.
      2. Bereid een acrylamide-oplossing uit 95 ml nanopure water en 5 ml 40 wt% acrylamide en ontgas de oplossing gedurende 30 minuten in een vacuümoven.
      3. Voeg 35 μL tetramethylethyleendiamine (TEMED) toe voor een eindconcentratie van 2,3 mM en vervolgens 0,07 g ammoniumpersulfaat. Giet de acrylamide-oplossing over de deklapjes terwijl je naar boven kijkt en incubeer een nacht bij kamertemperatuur.
   2. Bereid hydrofobe microscoopglaasjes voor. Pipetteer 100 μL van een waterafstotende oplossing (zie Materiaaltabel) op een schoon glazen microscoopglaasje en plaats er vervolgens nog een schone glasplaat op. Dit zorgt voor een gelijkmatige coating van de waterafstotende oplossing op het oppervlak waar het 2 minuten zit. Verwijder na 2 minuten de tweede glasglaas en spoel de eerste dia grondig af met nanozuiver water en droog vervolgens met stikstofgas. Reinig het gebied waar de tape zal worden geplaatst (rond het patroon) voorzichtig met aceton om ervoor te zorgen dat de waterafstotende oplossing hechting aan het glas niet voorkomt.
   3. Bereid een mengsel van gemanipuleerde olie met 1,8% (v/v) 008-FluoroSurfactant (zie Materiaaltabel).
   4. Monteer de glasschuif en afdekplaat met de hydrofobe glasschuif op de bodem van de stroomcel en de hydrofiele afdekplaat als het bovenoppervlak in een sandwichgeometrie met behulp van dubbelzijdige zelfklevende afstandhouders van 40 μm. Plaats de afstandhouders 1,5 mm uit elkaar op de hydrofobe microscoopglaasjes. Plaats vervolgens de met acrylamide gecoate coverslip bovenop de afstandhouders met de behandelde kant naar beneden om te hechten. Zorg ervoor dat de hechting compleet is met druk van een stomp voorwerp.
      OPMERKING: Het doel is om een stroomcel samen te stellen met een platte olie/water-interface erin (figuur 2A, B). Dit is waar de actieve laag zich zal vormen. Alternatieve spacer tapes en films kunnen ook worden gebruikt om een vergelijkbare celdikte te produceren.
   5. Nadat de stroomcel is geconstrueerd, pipetteert u het oliemengsel onmiddellijk in de stroomcel en vult u de afgesloten ruimte.
   6. Gebruik een pipet om in een afzonderlijke injectieflacon voorzichtig 6 μL actief materiaal te mengen met 3,73 μL MIX, 1 μL microtubulioplossing, 0,6 μL ATP-oplossing (de concentratie kan worden gevarieerd om de microtubulisnelheid te variëren) en 0,67 μL M2B-buffer.
   7. Pipetteer vers gemengd actief materiaal in één open uiteinde van de stroomcel, volumes zullen variëren maar moeten het volume van de stroomcel overschrijden (ongeveer 3-6 μL). Sommige olie zal worden verplaatst door de waterige oplossing als deze in het kanaal wordt geïnjecteerd; dit kan aan de andere kant van het stroomkanaal worden afgebroken met behulp van een klein stukje tissuepapier.
   8. Sluit na het vullen beide zijden van de stromingscel af met een epoxylijm (zie Materiaaltabel) die uithardt bij blootstelling aan UV-licht gedurende 20 s.
      OPMERKING: Op dit punt vormt het actieve materiaal een 3D-netwerk dat in de waterlaag blijft hangen.
   9. Om de actieve laag tussen de twee onmengbare vloeistoffen in een quasi-2D-laag te beperken, plaatst u de stroomcel in een zwaaiende emmercentrifuge (zie Materiaaltabel) met de waterige fase bovenop en de dichtere olielaag eronder. Centrifugeer bij 212 x g gedurende 10 min. Nadat deze stap is voltooid, kan de stroomcel naar een epifluorescentiemicroscoop worden gebracht voor beeldvorming met een vergrotingsobjectief van 10x of 20x. Figuur 2C,D toont typische beelden voor en na deze stap.
2. Omgekeerde methode voor actieve nematische vorming
   OPMERKING: Een alternatieve methode dan beschreven in stap 2.1 is om de actieve nematische laag samen te voegen onder een dikke olielaag die beperkt is tot een diepe PDMS-put²⁸. Deze methode levert vergelijkbare resultaten op en is iets gemakkelijker te beheersen; de beeldkwaliteit met deze methode is echter meestal niet zo goed als de stroomcelmethode.
   1. Bereid het polydimethylsiloxaan (PDMS) met behulp van een elastomeeruithardingsmiddel en een elastomeerbasis (zie Materiaaltabel). Meng de twee componenten in een verhouding van 1:10 met behulp van een metalen spatel. Tijdens het mengen verschijnen kleine belletjes die moeilijk te verwijderen zijn en het mengsel lijkt melkachtig. Om deze belletjes te verwijderen, plaatst u het mengsel onder een vacuüm om gedurende 1 uur te ontgassen, waarna het niet-uitgeharde PDMS transparant moet lijken.
      OPMERKING: Het PDMS is nu klaar om elke vorm te vormen met behulp van een mal, of het kan uitharden in de container en vervolgens worden gesneden of geponst in het gewenste patroon.
   2. Giet het PDMS in een geschikte mal en laat een nacht uitharden bij 60 °C.
      OPMERKING: Onbehandeld is het oppervlak van uitgehard PDMS hydrofoob, maar met oppervlaktebehandeling kan het hydrofiel worden gemaakt.
   3. Om een hydrofiel PDMS-oppervlak te bereiden, bedekt u het PDMS met een acrylamidepolymeerborstel²⁹. Deze stap voorkomt ook dat eiwitten aan het oppervlak blijven plakken.
      1. Begin met het reinigen van de PDMS gedurende 10 minuten met zowel ethanol als isopropanol, spoel vervolgens grondig af met gedeïoniseerd water 3x en droog. Gebruik een plasmareiniger gedurende 5 minuten om het droge, uitgeharde PDMS schoon te maken. Deze stap maakt het oppervlak meer hydrofiel.
      2. Bereid vervolgens een silaanoplossing (98,5 wt% ethanol, 1 wt% azijnzuur en 0,5 wt% Trimethoxysilylpropylmethacrylaat) en dompel het substraat gedurende 15 minuten in die oplossing om zich voor te bereiden op de acrylamidecoating. Spoel het substraat grondig af met gedeïoniseerd water en dompel onder in acrylamide-oplossing (2 wt% acrylamide/bis-oplossing, 2,3 mM TEMED en 3 mM ammoniumpersulfaat).
         OPMERKING: Deze substraten kunnen worden bewaard bij kamertemperatuur bedekt met acrylamide-oplossing in een glazen petrischaal en moeten binnen 2 weken worden gebruikt.
   4. Wanneer klaar voor gebruik, spoel het oppervlak met gedeïoniseerd water en droog met stikstof voor onmiddellijk gebruik. Voeg het actieve mengsel (beschreven in stap 2.1.6) toe aan de putjes en voeg onmiddellijk siliconenolie toe tot een dikte van ongeveer 2 mm.
      OPMERKING: In dit stadium zal het actieve mengsel worden ingeklemd tussen de olie en de hydrofiele coating op het PDMS, maar het zal nog steeds enigszins driedimensionaal zijn.
   5. Om het materiaal verder in een 2D-laag te duwen, lijmt u het PDMS-apparaat op een glazen glijbaan, plaatst u het in een zwaaiende emmercentrifuge en draait u gedurende 12 minuten bij 212 x g. Het apparaat moet zo worden geplaatst dat de siliconenolie zich op de bovenkant van de waterige laag bevindt. De representatieve resultaten zijn weergegeven in figuur 3.

3. Voorbereiding van actieve nematica in besloten geometrieën

OPMERKING: Actieve nematica zoals dit quasi-tweedimensionale systeem kunnen een uitdaging zijn om te beperken tot kleine microfluïdische geometrieën zoals putten of kanalen. Hier wordt een betrouwbare methode beschreven om het materiaal in verschillend gevormde PDMS-putten te beperken.

1. Ontwerp eerst een hoofdmal voor het PDMS. Dit kan worden bereikt door pilaren op een substraat te 3D-printen. Na het 3D-printen van de harsmastermal, reinigt u met isopropanol en hardt u de mal vervolgens uit onder een UV-lamp gedurende 45 minuten en in de oven bij 120 °C gedurende 2 uur (figuur 4).
   OPMERKING: Uitharden onder UV en thermische uitharding verbetert de kwaliteit van de replicatie in PDMS door monomeren en fotoremmerresiduen uit de hars^{te verwijderen 30}.
2. Gebruik de hoofdmal om putten te maken van PDMS. Bereid het PDMS voor zoals beschreven in stap 2.2.1. Dompel de hoofdmal onder in ongehard PDMS en laat een nacht uitharden in een oven op 60 °C.
3. Nadat het uitharden van PDMS is voltooid, verwijdert u voorzichtig de hoofdmal en snijdt u het PDMS naar wens om met de putten te werken (figuur 4). Behandel het PDMS-oppervlak zoals beschreven in stap 2.2.3. Vóór het experiment kan het oppervlak worden bevestigd aan een glasplaat met epoxylijm om beeldvorming gemakkelijker te maken.
4. Pipetteer 1 μL van het actieve mengsel beschreven in stap 2.1.6 op het PDMS-substraat en voeg onmiddellijk siliconenolie met 100-1000 cSt viscositeit²⁸ toe bovenop de actieve netwerkdruppel. Het actieve netwerk zal zich in de put verplaatsen; dit proces duurt maximaal 60 minuten (figuur 4). Zoals beschreven in stap 2.2.5 kan het 2D-netwerk worden verbeterd door de PDMS-put in de zwenkbakcentrifuge gedurende 12 minuten bij 212 x g naar beneden te draaien.

Resultaten

Figuur 1 toont een representatief beeld van enkele microtubuli bereid uit GMPCPP-tubuline. De afbeelding toont korte microtubuli van vergelijkbare lengtes (met enige dispersie aanwezig). Voldoende verdunning van de microtubule-oplossing moet een beeld van goed gescheiden microtubuli opleveren voor lengteverificatie. De individuele microtubuli kunnen een uitdaging zijn om in beeld te brengen vanwege hun kleine formaat. Het gebruik van een camera met hoge gevoeligheid die is ontworpen voor fluorescentiemicroscopie is het beste voor deze toepassing. Figuur 2 en figuur 3 tonen voorbeeldfluorescentiemicroscopiebeelden van succesvolle experimenten die zijn uitgevoerd met respectievelijk de flowcelmethode (punt 2.1) en de omgekeerde methode (punt 2.2). Een goed gevormde actieve nematische laag is homogeen van textuur, zonder significante holtegebieden en mobiele topologische defecten aanwezig. Houd er echter rekening mee dat er enkele acceptabele kleine holtes in de defecte kernen kunnen zijn. Naast de voorbeelden in figuur 2 en figuur 3 zijn drie aanvullende films (film 1, film 2 en film 3) opgenomen om aan te tonen hoe de actieve nematic in een succesvol experiment moet verschijnen. Alle films tonen de vloeiende continue beweging van de actieve nematische fase. Er zijn geen variaties in de microtubuliconcentratie zichtbaar nadat het materiaal zijn steady state heeft bereikt. Zolang er voldoende ATP in het systeem aanwezig is, zal het materiaal gelijkmatig blijven bewegen.

Figuur 1: Fluorescentiemicroscoopbeeld van GMPCPP-microtubuli. De GMPCPP-microtubuli werden gelabeld op 4% met rhodamine tubuline en gepolymeriseerd gedurende 20 minuten bij 37 °C. Beeldvorming werd uitgevoerd bij kamertemperatuur. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Microtubule nematica in een flowcel. (A) Cross sectioneel schema van de flowcel, 1 mm x 18 mm geometrie. (B) Bovenaanzicht schema van de stroomcel. (C) Fluorescentiemicroscopiebeeld dat het typische uiterlijk van de actieve oplossing aantoont voordat het op het olie/water-grensvlak wordt gemonteerd. (D) Fluorescentiemicroscopiebeeld van de actieve nematische fase geassembleerd op het olie/water-raakvlak in de stroomcel. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: Fluorescentiemicroscoopafbeelding met een actieve nematic die is bereid met behulp van de omgekeerde methode. Schaalbalk = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: Stromingsdiagram ter illustratie van de methode voor actieve nematische opsluiting in een PDMS-put, inclusief matrijsfabricage en oppervlaktebehandeling. Schaalbalk op de rechter afbeelding (beperkt actief materiaal) = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Film 1: Representatief resultaat voor actieve nematic bereid met behulp van de flow cell methode. Klik hier om deze film te downloaden.

Film 2: Representatief resultaat voor actieve nematic bereid met behulp van de omgekeerde methode. Klik hier om deze film te downloaden.

Film 3: Representatief resultaat voor actieve nematic bereid met behulp van de omgekeerde methode beperkt tot een elliptische put. Klik hier om deze film te downloaden.

Discussie

Er zijn een paar punten in de protocollen waarop de experimentator enkele belangrijke controles kan uitvoeren. Alvorens een van de apparaten met actief materiaal te vullen, moet fluorescentiemicroscopie (zie figuur 1) worden gebruikt om te controleren of de microtubuli gepolymeriseerd zijn en idealiter ~ 2-3 μm lang. Als microtubuli niet zichtbaar zijn onder de microscoop, kunnen ze zijn gedepolymeriseerd en zal de actieve nematic zich niet vormen. Omdat individuele microtubuli erg klein zijn, kan het een uitdaging zijn om ze rechtstreeks door de microscoop te observeren. In deze studie werd een hoogwaardige fluorescentiecamera gebruikt die is ontworpen voor uitdagende toepassingen bij weinig licht met de bijbehorende software om de groei van filamenten te verifiëren. Significante fluorescerende aggregaten mogen in dit stadium niet aanwezig zijn, omdat dit kan wijzen op depolymerisatie of de aanwezigheid van gedenatureerd eiwit. Het is ook een goed idee om een eenvoudige microscooptest te maken door microtubuli, MIX en ATP te combineren in dezelfde verhoudingen als beschreven in de protocollen. De activiteit moet beginnen bij het combineren van de componenten en het materiaal moet vergelijkbaar zijn met het materiaal in figuur 2C met bundels aanwezig en merkbare filamentbewegingen die overal zichtbaar zijn.

Bij gebruik van de flowcelmethode zijn de centrifugetijd en oriëntatie van de flowcel belangrijk voor de vorming van een uniforme actieve laag. Deze stap kan enige fijnafstelling vereisen, afhankelijk van het gebruikte centrifugetype. Het centrifugeren van de stroomcel met het actieve vlak loodrecht op het rotatievlak georiënteerd geeft de beste resultaten omdat materiaal uniform op de vloeistofinterface kan worden geduwd. Controleer nogmaals of de stroomcel zorgvuldig is afgesloten voordat deze wordt gecentrifugeerd.

Bij het gebruik van de omgekeerde methode om beperkte actieve nematica te produceren, zijn er verschillende stappen om te optimaliseren. Ten eerste is het belangrijk om een 3D-printmethode te gebruiken die structuren met een hoge resolutie produceert. Ongelijke zijwanden kunnen ervoor zorgen dat de microtubuli vangen, wat de stromen zal verstoren. De putten mogen niet te diep zijn (in dit onderzoek is gebruik gemaakt van 150-200 μm diepe putten met een 2 mm dikke bovenliggende olielaag). Experimentatoren moeten deze parameters mogelijk enigszins aanpassen met vallen en opstaan om het beste resultaat te krijgen.

De flowcelmethode en de omgekeerde methode zijn door verschillende auteurs gebruikt om te kijken naar een verscheidenheid aan effecten die van invloed zijn op de actieve stromen, waaronder verschillende oliën¹² en ondergedompelde structuren¹³. De keuze van de methode hangt af van het experimentele doel. Met behulp van de flow cell-methode is optische beeldvorming van boven de actieve laag duidelijker dan voor de omgekeerde methode vanwege de verschillende bovenliggende vloeistoffen. In de flow cell-methode wordt beeldvorming uitgevoerd door middel van een glazen afdekslip en een dunne laag water, terwijl de omgekeerde methode is ontworpen om de olielaag bovenop te hebben. Dit betekent dat er een lange werkafstandsdoelstelling nodig is voor de omgekeerde methode en dat de beeldkwaliteit wordt verminderd. Verschillen in beeldkwaliteit kunnen worden gezien door figuur 2D (stroomcelmethode) en figuur 3 (omgekeerde methode) en respectievelijk film 1 en film 2 te vergelijken. Voor figuur 3 was een lens met een lagere vergroting met een langere werkafstand vereist dan voor figuur 2. Deze beeldvormende nadelen voor de omgekeerde methode kunnen worden vermeden als er een geschikte omgekeerde microscoop beschikbaar is, gecombineerd met objectieven met een passende werkafstand voor de microscoopglaassubstraten. Dunner glas kan worden gebruikt als substraat om het gebruik van standaard werkafstandsdoelen mogelijk te maken.

Als voordeel is dat de omgekeerde geometrie het gebruik van een breder scala aan olieviscositeiten mogelijk maakt, niet noodzakelijkerwijs zwenkende emmercentrifugatie vereist (als dit niet beschikbaar is) en de voorbereiding van het systeem is relatief eenvoudiger zodra de mal is voorbereid. Voor opsluiting in putten met behulp van de omgekeerde methode kan enige centrifugatie echter belangrijk zijn om het materiaal in een goed gedefinieerde 2D-laag te krijgen.

De flow cell methode is recent zeer succesvol toegepast in experimenten waarbij een continue actieve laag nodig is. Ons recente werk heeft gekeken naar de dynamiek van topologische defecten in de actieve laag, waar hoogwaardige beeldvorming en textuuranalyse belangrijk is¹⁹. Daarnaast is de flow cell methode gebruikt om de effecten van olie-ondergedompelde microstructuren op actieve stromen¹⁶ en pijlers te onderzoeken om defecten in de actieve stromen op te vangen³¹. Deze methode werkt heel goed voor de vorming van een continue actieve laag en de beeldkwaliteit is uitstekend. De centrifugatiestap die wordt gebruikt om de laatste actieve 2D-laag te produceren, kan echter moeilijk uit te voeren zijn en de stroomcellen zijn gevoelig voor lekken en luchtbellen. De omgekeerde methode is een zeer nuttig alternatief met een hoog slagingspercentage, is gemakkelijk te construeren en kan worden gebruikt voor elk substraatpatroon of geometrie, op voorwaarde dat een 3D-geprinte hoofdmal met hoge resolutie kan worden gemaakt. Deze methode is ook nuttig om te kijken naar de effecten van geometrische opsluiting op actieve nematische dynamica, omdat het het vullen van putten relatief eenvoudig maakt.

In dit artikel worden twee manieren beschreven om een actieve nematic te vormen uit microtubuli en kinesinemotoren, plus een techniek om de materialen in putten op te sluiten. Het gepresenteerde systeem is het schoonste voorbeeld van een actieve nematische fase die momenteel in de literatuur is en is gereproduceerd door verschillende groepen over de hele wereld. De betekenis van dit materiaal ligt niet alleen in de biologische oorsprong van zijn componenten, maar ook omdat het een geheel nieuwe richting opent in actieve geordende vloeistoffen. Door met dit systeem te werken en de fundamentele eigenschappen ervan op te helderen, kunnen wetenschappers evolueren naar het ontwerp van volledig synthetische actieve fasen.

De experimenten gericht op de effecten van opsluiting op actieve nematica hebben het potentieel om fundamentele vragen te beantwoorden met betrekking tot het gedrag van actieve stromen en topologische defectdynamica onder topologische opsluiting. De hier gepresenteerde methode zal helpen bij het uitvoeren van een verscheidenheid aan op geometrie gerichte experimenten en hun analyse, waaronder microfluïdica en actief mengen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
20 kD PEG (polyethylene glycol))	Sigma Aldrich	1419109	Depletiemiddel CAS-nummer: 125061-88-3
3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate	Sigma Aldrich	M6514-50ML	CAS-nummer: 2530-85-0
3D printer & Resin	Phrozen		Phrozen sonic mini 8K 3D printer - Aqua Gray 8K resin
40% Acrylamide Oplossing	BIO-RAD	1610140	CAS-nummer: 7732-18-5, 79-06-1
Azijnzuur	Fisher		CAS-nummer: 64-19-7
Aceton	Sigma Aldrich		CAS-nummer: 67-64-1
Kleefvellen (OPMERKING: "Parafilm" is een alternatief)	Grace Bio-Labs	620001	SecureSeal
Ammoniumpersulfaat	Sigma Aldrich	A3678	CAS-nummer: 7727-54-0
Aquapel (OPMERKING: "RainX" is een alternatief)	Aquapel Glass Treatment		hydrofobe glasbehandeling
ATP (Adenosine trifosfaat)	Sigma Aldrich	A1852	CAS-nummer: 34369-07-8
Bekers	VWR
Catalase	Sigma Aldrich	C9322	CAS-nummer: "9001-05-2"
Exsiccator	Bel-art
Digitale CMOS-camera	Hamamatsu	ORCA - Flash4.0 LT+
DTT (Dithiothreitol)	Sigma Aldrich	D9779	CAS-nummer: "3483-12-3"
EGTA (3,12-bis(carboxymethyl)-6,9-dioxa-3,12-diazatetradecaan-1,14-dionzuur)	Sigma Aldrich	MFCD00004291	CAS-nummer: 67-42-5
Ethanol	Sigma Aldrich		CAS-nummer: 64-17-5
Fluorescentiemicroscoop	Leica	DM 2500P
Glasplakjes	VWR	48368-040
Glaskijkplaten	VWR	16004-430
Glucose	Sigma Aldrich	G7021	CAS-nummer: 50-99-7
Glucose Oxidase	Sigma Aldrich	345386	CAS-nummer: 9001-37-0
GMPCPP (guanylyl 5'-α,β-methyleen-difosfonaat)	Jena Bioscience	NU-405S	CAS-nummer: 14997-54-7
HFE7500 Olie	3M
Verwarmde plaat	Fisher Scientific	Thermix verwarmde plaat model 100M
Isopropylalcohol	VWR
KCl (kaliumchloride)	Sigma Aldrich	P5405	CAS-nummer: 7447-40-7
Methanol	Sigma Aldrich		CAS-nummer: 67-56-1
MgCl2 (Magnesiumchloride)	Sigma Aldrich	208337	CAS-nummer: 7786-30-3
Microcentrifugebuisjes	Eppendorf - Thermo Fisher	1,5 mL
Nanopure waterreiniger	Sartorius	arium mini
NaOH (Natriumhydroxide)	Sigma Aldrich	SX0603	CAS-nummer: 1310-73-2
Petrischalen	VWR
PH-meter	Thermo Scientist	Orion 3 STAR
Fosfoenolpyruvaat (PEP)	Sigma Aldrich	MFCD00044476	CAS-nummer: 4265-07-0
PIPES (1,4-Piperazinedieetaansulfonzuur)	Sigma Aldrich		CAS-nummer: 5625-37-6
Pipetten (0,2 - 1000 µl)	VWR
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	2594628
RAN-oppervlakteactieve stof (OPMERKING: "FluoSurf" van Emulso is een alternatief)	Ran Biotechnologies	008-FluoroSurfactant-2wtH-50G
Silicoonoliën (100mpa s-1000 mpa s)	Sigma Aldrich		CAS-nummer: 63148-52-7
Streptavidine	Thermofisher	S888
Zwaaiende emmercentrifuge	Thermo Scientist	Sorvall legend RT+
Sylgard 184 Elastomerbasis	World Precision Instruments	SYLG184
Sylgard 184 Elastomerharder	World Precision Instruments	SYLG184
Centrifuge voor op tafel	Eppendorf	MiniSpin Plus
TEMED (Tetramethyleendiamine)	BIO-RAD	1610800	CAS-nummer: 110-18-9
Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromaan-2-carbonzuur)	Sigma Aldrich	MFCD00006846	CAS-nummer: 53188-07-1
Tubuline	Cytoskeleton	T240-B
Tubuline (met rodamine gelabeld)	Cytoskeleton	TL590M-A
Ultracentrifuge	Beckman	Optima Max-TL
UV-licht	RapidFix
UV-uithardbare lijm (OPMERKING: "Norland NO81" is een alternatief)	RapidFix
Waterbad	Thelco
Whatman-filterpapier	Sigma Aldrich	WHA1001325