Methodenartikel

Efficiënte transfectie van in vitro getranscribeerd mRNA in gekweekte cellen met behulp van peptide-poloxamine nanodeeltjes

DOI:

10.3791/64288

⸱

17 augustus 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1National Engineering Research Center of Immunological Products, Department of Microbiology and Biochemical Pharmacy, Third Military Medical University, 2Department of Pediatrics, Ludwig-Maximilians University of Munich, 3Department of Pharmacy, Southwest Hospital, Third Military Medical University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een zelfgeassembleerd peptide-poloxamine nanodeeltje (PP-sNp) wordt ontwikkeld met behulp van een microfluïdisch mengapparaat om in vitro getranscribeerd boodschapper-RNA in te kapselen en af te leveren. Het beschreven mRNA/PP-sNp kon in vitro efficiënt gekweekte cellen transfecteren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In vitro getranscribeerde messenger RNA (mRNA) vaccins hebben een enorm potentieel getoond in de strijd tegen de coronavirusziekte 2019 (COVID-19) pandemie. Efficiënte en veilige toedieningssystemen moeten worden opgenomen in de mRNA-vaccins vanwege de fragiele eigenschappen van mRNA. Een zelfgeassembleerd peptide-poloxamine nanodeeltje (PP-sNp) genafgiftesysteem is specifiek ontworpen voor de pulmonale afgifte van nucleïnezuren en vertoont veelbelovende mogelijkheden bij het bemiddelen van succesvolle mRNA-transfectie. Hier wordt een verbeterde methode voor het bereiden van PP-sNp beschreven om uit te werken hoe de PP-sNp Metridia luciferase (MetLuc) mRNA inkapselt en met succes gekweekte cellen transfecteert. MetLuc-mRNA wordt verkregen door een in vitro transcriptieproces van een lineair DNA-sjabloon. Een PP-sNp wordt geproduceerd door synthetische peptide/poloxamine te mengen met mRNA-oplossing met behulp van een microfluïdische mixer, waardoor de zelfassemblage van PP-sNp mogelijk is. De lading van PP-sNp wordt vervolgens geëvalueerd door het zetapotentiaal te meten. Ondertussen worden de polydispersiteit en hydrodynamische grootte van PP-sNp nanodeeltjes gemeten met behulp van dynamische lichtverstrooiing. De mRNA/PP-sNp nanodeeltjes worden getransfecteerd in gekweekte cellen en supernatanten uit de celcultuur worden getest op luciferase-activiteit. De representatieve resultaten tonen hun vermogen tot in vitro transfectie aan. Dit protocol kan licht werpen op de ontwikkeling van mRNA-vaccinafgiftesystemen van de volgende generatie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vaccinatie is aangekondigd als een van de meest efficiënte medische interventies voor het verminderen van de morbiditeit en mortaliteit veroorzaakt door infectieziekten1. Het belang van vaccins is aangetoond sinds de uitbraak van coronavirusziekte 2019 (COVID-19). In tegenstelling tot het traditionele concept van het injecteren van geïnactiveerde of levend verzwakte pathogenen, concentreren state-of-the-art vaccinbenaderingen, zoals vaccins op basis van nucleïnezuur, zich op het behoud van de immuunstimulerende eigenschappen van de doelpathogenen, terwijl de potentiële veiligheidsproblemen in verband met het conventionele geheel-microbiële virus- of in op bacteriën gebaseerde vaccins worden vermeden. Zowel DNA- als RNA (d.w.z. in vitro getranscribeerd boodschapper-RNA, IVT-mRNA) -gebaseerde vaccins vertonen profylactisch tot therapeutisch potentieel tegen een verscheidenheid aan ziekten, waaronder infectieziekten en kankers 2,3. In principe heeft het potentieel van op nucleïnezuur gebaseerde vaccins betrekking op hun productie, werkzaamheid en veiligheid4. Deze vaccins kunnen op een celvrije manier worden vervaardigd om kosteneffectieve, schaalbare en snelle productie mogelijk te maken.

Een enkel vaccin op basis van nucleïnezuur kan coderen voor meerdere antigenen, waardoor het doelwit van talrijke virale varianten of bacteriën met een verminderd aantal inentingen mogelijk wordt en de immuunrespons tegen veerkrachtige pathogenen wordt versterkt 5,6. Bovendien kunnen op nucleïnezuur gebaseerde vaccins het natuurlijke invasieproces van virus- of bacteriële infectie nabootsen, waardoor zowel B-cel- als T-celgemedieerde immuunresponsen worden gebracht. In tegenstelling tot sommige virus- of DNA-gebaseerde vaccins, bieden IVT-mRNA-gebaseerde vaccins een enorm voordeel in termen van veiligheid. Ze kunnen snel het gewenste antigeen in het cytosol tot expressie brengen en zijn niet geïntegreerd in het gastheergenoom, waardoor zorgen over insertionele mutageneseworden weggenomen 7. IVT-mRNA wordt automatisch afgebroken na succesvolle translatie, zodat de kinetiek van de eiwitexpressie gemakkelijk kan worden gecontroleerd 8,9. Gekatalyseerd door de pandemie van het severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2), hebben inspanningen van bedrijven / instellingen over de hele wereld de introductie van vele soorten vaccins op de markt mogelijk gemaakt. Ivt-mRNA-gebaseerde vaccintechnologie toont een groot potentieel en heeft voor het eerst zijn eerder verwachte succes aangetoond, dankzij het snelle ontwerp en het flexibele vermogen om zich binnen enkele maanden aan te passen aan doelantigenen. Het succes van IVT-mRNA-vaccins tegen COVID-19 in klinische toepassingen opende niet alleen een nieuw tijdperk van onderzoek en ontwikkeling van IVT-mRNA-vaccins, maar heeft ook waardevolle ervaring opgedaan voor de snelle ontwikkeling van effectieve vaccins voor het omgaan met uitbraken van infectieziekten10,11.

Ondanks het veelbelovende potentieel van IVT-mRNA-vaccins, blijft de efficiënte intracellulaire afgifte van IVT-mRNA op de plaats van actie (d.w.z. cytoplasma) een belangrijke hindernis vormen12, vooral voor degenen die via de luchtwegen worden toegediend4. IVT-mRNA is inherent een onstabiel molecuul met een extreem korte halfwaardetijd (~ 7 h)13, waardoor IVT-mRNA zeer gevoelig is voor afbraak door het alomtegenwoordige RNase14. De lymfocyten van het aangeboren immuunsysteem hebben de neiging om het erkende IVT-mRNA te verzwelgen in gevallen van in vivo toepassing. Bovendien schaden de hoge negatieve ladingsdichtheid en het grote molecuulgewicht (1 x 104-1 x 106 Da) van IVT-mRNA de effectieve permeatie ervan over de anionische lipide-bilaag van cellulaire membranen15. Daarom is een afgiftesysteem met bepaalde bio-functionele materialen nodig om de afbraak van de IVT-mRNA-moleculen te remmen en cellulaire opnamete vergemakkelijken 16.

Afgezien van een paar uitzonderlijke gevallen waarin naakt IVT-mRNA direct werd gebruikt voor in vivo onderzoek, worden verschillende toedieningssystemen gebruikt om IVT-mRNA naar de therapeutische plaats van actie te brengen17,18. Eerdere studies hebben aangetoond dat slechts enkele IVT mRNA's worden gedetecteerd in cytosol zonder de hulp van een toedieningssysteem19. Er zijn talloze strategieën ontwikkeld om de RNA-afgifte te verbeteren met voortdurende inspanningen in het veld, variërend van protaminecondensatie tot lipideninkapseling20. Lipide nanodeeltjes (LNP's) zijn de meest klinisch geavanceerde onder de mRNA-toedieningsvoertuigen, zoals blijkt uit het feit dat alle goedgekeurde mRNA COVID-19-vaccins voor klinisch gebruik gebruik maken van op LNP gebaseerde toedieningssystemen21. LNP's kunnen echter geen effectieve mRNA-transfectie bemiddelen wanneer de formuleringen worden toegediend via de ademhalingsroute22, wat de toepassing van deze formuleringen opmerkelijk beperkt bij het induceren van mucosale immuunresponsen of het aanpakken van longgerelateerde ziekten zoals cystische fibrose of α1-antitrypsinedeficiëntie. Daarom is het ontwikkelen van een nieuw toedieningssysteem nodig om de efficiënte levering en transfectie van IVT-mRNA in luchtweggerelateerde cellen te vergemakkelijken om deze onvervulde behoefte op te lossen.

Het is bevestigd dat het peptide-poloxamine zelfgeassembleerde nanodeeltjes (PP-sNp) afgiftesysteem de efficiënte transfectie van nucleïnezuren in de luchtwegen van muizen kan bemiddelen23. De PP-sNp hanteert een multifunctionele modulaire ontwerpbenadering, die verschillende functionele modules in de nanodeeltjes kan integreren voor snelle screening en optimalisatie23. De synthetische peptiden en elektrisch neutrale amfifiele blokcopolymeren (poloxamine) in de PP-sNp kunnen spontaan interageren met IVT-mRNA om uniform verdeelde nanodeeltjes te genereren met een compacte structuur en een glad oppervlak23. PP-sNp kan het gentransfectie-effect van IVT-mRNA-moleculen in gekweekte cellen en de luchtwegen van muizen verbeteren23. De huidige studie beschrijft een protocol voor het genereren van PP-sNp bevattend IVT-mRNA dat codeert voor Metridia luciferase (MetLuc-mRNA) (Figuur 1). Gecontroleerd en snel mengen via een microfluïdisch mengapparaat, dat gebruik maakt van het gespreide visgraatmengontwerp, wordt in dit protocol gebruikt. De procedure is eenvoudig uit te voeren en maakt het genereren van PP-sNp met meer uniforme maten mogelijk. Het algemene doel van PP-sNp-productie met behulp van de microfluïdische mixer is om PP-sNp voor mRNA-complexatie op een goed gecontroleerde manier te creëren, waardoor efficiënte en reproduceerbare celtransfectie in vitro mogelijk is. Het huidige protocol beschrijft de voorbereiding, assemblage en karakterisering van PP-sNp met MetLuc-mRNA.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. In vitro transcriptie van chemisch gemodificeerd mRNA

OPMERKING: Het is vereist om nucleasevrije buizen, reagentia, glaswerk, pipetpunten, enz. Te gebruiken, omdat RNases alomtegenwoordig zijn in het milieu, zoals laboratoriumoplossingen, instrumentoppervlakken, haar, huid, stof, enz. Reinig de bankoppervlakken en pipetten grondig voor gebruik en draag handschoenen om RNase-besmetting te voorkomen.

  1. Voer linearisatie van het DNA-sjabloon uit.
    1. Synthetiseer het open leesframe (ORF) van Metridia luciferase (MetLuc) geflankeerd door een T7-polymerasepromotor, 5 'onvertaald gebied (UTR), 3'UTR en poly (A) staarten en kloon het in de PUC57-vector, die tot expressie komt in bacteriën (zie Materiaaltabel).
      OPMERKING: De coderende sequentie van het DNA-sjabloon is opgenomen in aanvullend bestand 1.
    2. Kweek bacteriën, lyseer de bacteriën en zuiver het plasmide-DNA door de bijbehorende kolom (zie plasmide-DNA-extractiekit in de materiaaltabel).
    3. Voer een enkele reactie van 50 μL uit die 2 μL BamHI, 2 μL KpnI (zie Tabel van materialen) en 2 μg plasmide-DNA bij 37 °C gedurende 1 uur bevat, en bereik linearisatie van het DNA-sjabloon.
  2. Voer in vitro transcriptie uit om uncapped-IVT mRNA te genereren.
    1. Voer mRNA-synthese uit door een enkele reactie van 20 μL met behulp van een T7-transcriptiekit en pseudouridine (zie materiaaltabel): 10 μL (0,8-1 μg) gelineariseerd DNA-sjabloon, 1,5 μL (150 mM) ATP, pseudo-UTP, GTP en CTP, 2 μL 10x transcriptiebuffer, 1 μL T7-enzym en 1 μL nucleasevrij water (NF-water). Meng de bovengenoemde componenten grondig en incubeer gedurende 3 uur bij 37 °C.
  3. Verwijder het sjabloon-DNA.
    1. Voeg na het transcriptieproces 1 μL (1 U) DNase (RNase-vrij) toe en incubeer bij 37 °C gedurende 15 min.
  4. Voer uncapped-IVT mRNA-zuivering uit met behulp van lithiumchlorideprecipitatie.
    1. Zuiver het niet-afgedekte IVT-mRNA met behulp van lithiumchloride (zie Materiaaltabel) met een werkconcentratie van 10 mM. Voeg 50 μL 10 mM lithiumchloride toe aan 20 μL niet-afgedekte IVT-mRNA-oplossing.
    2. Meng het volledige volume grondig en koel gedurende 1 uur af op −20 °C. Verzamel het niet-afgetopte IVT-mRNA gedurende 12 minuten bij 12.000 x g, dat routinematig 80-120 μg niet-afgetopt IVT-mRNA produceert uit elke afzonderlijke 20 μL-reactie.
  5. Voer IVT-mRNA-afdekking uit.
    1. Voer de IVT-mRNA-afdekking uit met behulp van het dop 1-afdeksysteem (zie Materiaaltabel). Verwijder in het kort de secundaire structuur van 50 μg uncapped-IVT-mRNA door gedurende 10 minuten op 65 °C te verwarmen en koppel vervolgens het 5'-uiteinde van uncapped-IVT-mRNA aan dop 1, die wordt bereid door de m7G-dopstructuur te wijzigen met behulp van 2,5 μL s-adenosylmethionine (SAM) (20 mM) en 4 μL 2'-O-methyltransferase (100 U) in een reactie van 100 μL bij 37 °C gedurende 30-60 min.
    2. Zuiver 100 μL van het afgedekte IVT-mRNA met behulp van 250 μL lithiumchloride en verdun in 50 μL NF-water.
  6. Bepaal de zuiverheid en moleculaire grootte van capped-IVT mRNA.
    1. Meet de concentratie van capped-IVT mRNA met een UV-zichtbare spectrofotometer. Analyseer met behulp van een RNA-marker (zie Tabel van materialen) de moleculaire grootte van capped-IVT-mRNA in een 1% formaldehyde denaturerende agarose-gel die 18% formaldehyde bevat (spanning is 120 V). Zorg ervoor dat het uncapped-IVT-mRNA en capped-IVT-mRNA worden opgeslagen bij −80 °C.
      OPMERKING: Het IVT-mRNA werd geacht een goede zuiverheid te hebben in een A260/A280-verhouding van 1,8-2,1 en een A260/A230-verhouding van 2,0 of iets hoger.

2. Generatie van IVT mRNA/PP-sNp

  1. Bereid poloxamine 704 (T704) stockoplossing door de T704 (zie materiaaltabel) in NF-water op te lossen om een voorraadoplossing van 10 mg / ml te verkrijgen. Bewaar de bereide oplossing bij 4 °C.
    OPMERKING: T704 bevat een X-vormige structuur gemaakt van een centrale groep van ethyleendiamine gebonden aan vier ketens van poly (propyleenoxide) (PPO) blokken en poly (ethyleenoxide) (PEO) blokken24. Het molecuulgewicht (Mw) van T704 is 5500.
  2. Bereid de synthetische peptide (sPep, zie Tabel van materialen) stockoplossing door de sPep op te lossen (sequentie: KETWWETWWTEWWTEWKKKKRRRRRKKKKGACSE
    RSMNFCG) in NF-water om een 2 mg/ml stamoplossing te verkrijgen en te bewaren bij 4 °C.
  3. Bereid de IVT-mRNA-oplossing door het IVT-mRNA (stap 1) op ijs te ontdooien en kort gedurende 3 s bij 300 x g bij kamertemperatuur te centrifugeren voordat de buis wordt geopend. Verdun de IVT-mRNA-oplossing tot 0,04 μg/μL met NF-water.
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om waar mogelijk in een bioveiligheidskast te werken met het IVT-mRNA.
  4. Bereid T704 en sPep mengoplossing door de sPep-oplossing te verdunnen tot 0,555 μg/μL en de T704-oplossing tot 8 μg/μL met NF-water. Incubeer de gemengde oplossing gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur voordat u deze verder gebruikt.
    OPMERKING: Bereken de vereiste sPep-component op basis van de gewenste N/P-verhouding. De N/P-verhouding is het totale aantal stikstofresiduen (N) binnen de sPep tot het totale aantal negatief geladen fosfaatgroepen (P) binnen het IVT-mRNA. Bereken de vereiste T704 op basis van de verhouding gewicht/gewicht (g/w) tussen T704 en IVT-mRNA. Het is noodzakelijk dat de N/P-verhouding 5 is en de w/w-verhouding 100.
  5. Bereid de IVT-mRNA/PP-sNp-formulering voor volgens de onderstaande stappen.
    1. Zuig de IVT-mRNA-oplossing (stap 3) in een spuit van 1 ml, zodat er geen luchtspleten of bellen in de punt van de spuit zitten. Plaats de spuit in één zijde van de patroon naast het roterende blok.
    2. Vul een spuit van 1 ml met de T704 en sPep mix oplossing (stap 4). Verwijder eventuele luchtbellen of luchtspleten aan de punt van de spuit en plaats de spuit in de andere inlaat van de pomp (zie materiaaltabel).
    3. Stel de pomp in met een debietverhouding van 1:1 en een totaal debiet van 4-10 ml/min.
      OPMERKING: Een totaal debiet van 6 ml/min is optimaal in de hier gepresenteerde onderzoeken.
    4. Plaats een 10 ml RNase-vrije conische buis (zie materiaaltabel) om de gemengde IVT-mRNA/PP-sNp-oplossing aan het einde van het stroompad van het mengapparaat te verzamelen.
    5. Laat de pomp draaien om het mengen te starten en zorg ervoor dat de parameters correct worden ingevoerd. Nadat de pomp klaar is met draaien gedurende 6 s, verzamelt u het IVT-mRNA / PP-sNp-monster uit de conische buis.
      OPMERKING: PP-sNp werden gegenereerd met behulp van een microfluïdische mixer (aanvullende figuur 1). Het apparaat bestaat uit een constante stroompomp, linkapparaat, chip en vast apparaat. In het mengproces levert de constante stroompomp die op de chip is aangesloten vloeistof aan de chip volgens het vooraf ingestelde debiet. De aangesloten constante stroompomp kan worden aangesloten op meerdere ingangskanalen van de chip met een enkel uitgangskanaal. De componenten van het apparaat, inclusief de chip, werden verkregen uit commerciële bronnen en rationeel geassembleerd (zie materiaaltabel). De parameters, zoals het debiet en het volume van de IVT-mRNA-oplossing en de gemengde T704-sPep-oplossing, kunnen verschillen van de parameters die in het huidige protocol worden weergegeven als een andere opstelling wordt gebruikt en dienovereenkomstig moeten worden geoptimaliseerd.

3. Meting van de hydrodynamische diameter en polydispersiteit van IVT-mRNA/PP-sNp

  1. Verdun een aliquot van de IVT mRNA/PP-sNp oplossing (stap 2) met NF-water om een eindvolume van 1 ml te verkrijgen.
  2. Meet de hydrodynamische grootte en polydispersiteitsindex (PDI) met behulp van een semi-micro cuvette25. Voeg de IVT-mRNA/PP-sNp-oplossing toe aan het cuvet en plaats deze in de deeltjesgroottemeter (zie Materiaaltabel). Stel een standaard operationele procedure in en klik op Start om de gegevensverzameling te starten.

4. Voorbereiding van de cellen voor transfectie

  1. Plaat menselijke bronchiale epitheelcellen (16HBE) en een dendritische cellijn (DC2.4) in 96-well-platen met een dichtheid van 3,5 x 104 cellen/put 24 uur voorafgaand aan transfectie. Kweek de cellen in een kweekmedium aangevuld met 10% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum en 1% penicilline/streptomycine.
    OPMERKING: De cellen zijn verkregen uit een commerciële bron (zie materiaaltabel).
  2. Incubeer de cellen in een incubator (37 °C en 5% CO2 atmosfeer) gedurende 24 uur om ervoor te zorgen dat de cellen 60% -80% confluent zijn vóór de transfectie.

5. Transfectie van de gekweekte cellen

  1. Was na het verwijderen van het groeimedium de vergulde cellen met 0,2 ml/put 1x PBS.
  2. Voeg 170 μL serumvrij kweekmedium toe aan elk putje dat de vergulde celculturen bevat.
  3. Voeg de IVT-mRNA/PP-sNp-formulering met 0,4 μg MetLuc-mRNA (bereid in stap 2) druppelsgewijs toe met een hoeveelheid van 30 μL/put.
  4. Incubeer de cellen met de IVT mRNA/PP-sNp formulering bij 37 °C in een bevochtigde 5% CO2-verrijkte atmosfeer gedurende 4 uur.
  5. Vervang het transfectiemedium door 0,2 ml vers kweekmedium aangevuld met 10% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum en 1% (v/v) penicilline/streptomycine.
    OPMERKING: Het foetale runderserum werd gedurende 30 minuten verwarmd bij 56 °C voor inactivering.
  6. Incubeer de getransfecteerde cellen bij 37 °C en in een 5% CO2-verrijkte atmosfeer gedurende 24 uur en verzamel de supernatanten die uit elke put moeten worden gedetecteerd.

6. Analyse van de werkzaamheid van celtransfectie met behulp van metridia luciferase (MetLuc) assay

  1. Test het supernatant uit elke put voor MetLuc-activiteit met behulp van coelenterazinesubstraat (zie Tabel met materialen) volgens de onderstaande stappen.
    1. Bereid een verse testoplossing door 1x PBS toe te voegen aan het coelenterazine-substraat (de concentratie coelenterazine is 15 mM).
    2. Vortex de coelenterazine oplossing voor 10 s voor grondig mengen.
    3. Voeg 50 μL supernatant (verzameld in stap 5) toe aan een plaat met 96 putten.
    4. Stel de microplaatlezer (zie Materiaaltabel) in met een leestijd van 1.000 ms voordat u handmatig of via geautomatiseerde injectie 30 μL coelenterazine-oplossing (15 mM) aan elke put toevoegt.
    5. Klik op Start om het luminescentiesignaal te meten onmiddellijk na het toevoegen van de coelenterazine-oplossing aan het supernatant.
      OPMERKING: Het luminescentiesignaal wordt gemeten met behulp van een microplaatlezer en de activiteit ervan wordt uitgedrukt in relatieve lichteenheden. De waarden die worden verkregen uit PBS-getransfecteerde putten worden gebruikt als blanco controles.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het recombinante plasmide werd verteerd om het gelineariseerde DNA-sjabloon te produceren (figuur 2A). Met behulp van het beschreven protocol kan de T7 in vitro transcriptiekit tot 80-120 μg ongecapituleerd MetLuc-mRNA per 20 μL-reactie en 50-60 μg afgetopt MetLuc-mRNA per 100 μL-reactie produceren. Bij analyse met elektroforese moet intact MetLuc-mRNA met hoge kwaliteit een enkele en duidelijke band vertonen, zoals weergegeven in figuur 2B. Verontreini...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het hier beschreven protocol maakt niet alleen de kosteneffectieve en snelle productie van IVT-mRNA-vaccinformuleringen met gedefinieerde eigenschappen mogelijk, maar biedt ook de mogelijkheid om de PP-sNp-formulering aan te passen aan specifieke therapeutische doeleinden, zoals gentherapie. Om de succesvolle generatie van IVT-mRNA/PP-sNp te garanderen, wordt voorgesteld om extra aandacht te besteden aan enkele kritieke stappen. Wanneer u met mRNA werkt, moet u altijd onthouden dat RNase-vrije omstandigheden gedurende he...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (NSFC, Grant No. 82041045 and 82173764), het grote project van Study on Pathogenesis and Epidemic Prevention Technology System (2021YFC2302500) door het Ministerie van Wetenschap en Technologie van China, het Chongqing Talents: Exceptional Young Talents Project (CQYC202005027) en de Natural Science Foundation of Chongqing (cstc2021jcyj-msxmX0136). De auteurs zijn Dr. Xiaoyan Ding dankbaar voor het meten van de hydrodynamische diameter (nm) en polydispersiteitsindex (PDI).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
BamHITakara1010
cap 1 capping systemJinanM082
Dendritische cel-lijnSigmaSCC142
DNA-sequentieGenescript
Menselijke bronchiale epitheliale cellenSigmaSCC150
KpnITakara1068
LPBeyotimeC0533
LitiumchlorideAPEXBioB6083
Malvern Zetasizer Nano ZS90MalvernNB007605
Microfluidische chipZHONGXINQIHENGStandaard PDMS-chip
Microplate readersThermoFisherVarioskan lux
NanoDrop OneThermoFisherND-ONE-W (A30221)
Nuclease-vrij waterThermoFisherAM9932
OptiMEMGibco31985070
Penicilline-streptomycineGibco15140122
PseudouridineAPE×BioB7972
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106
Quanti-LucInvivoGenRep-qlc2
RiboRuler High Range RNA LadderThermoFisherSM1821
RNase-vrije conische buisBiosharpBS-100-M
RPMI Medium 1640ThermoFisherC11875500BT
SpuitpompChemyxFusion 101
T7 transcriptiekitJinanE131

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fehervari, Z., Minton, K., Duarte, J. H. Nature milestones in vaccines. Springer Nature. , Available from: https://www.nature.com/collections/hcajdiajij (2020).
  2. Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies. Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).
  3. Mulligan, M. J., et al. Phase I/II study of COVID-19 RNA vaccine BNT162b1 in adults. Nature. 586 (7830), 589-593 (2020).
  4. Tang, J., et al. Nanotechnologies in delivery of DNA and mRNA vaccines to the nasal and pulmonary mucosa. Nanomaterials. 12 (2), 226(2022).
  5. Freyn, A. W., et al. A multi-targeting, nucleoside-modified mRNA influenza virus vaccine provides broad protection in mice. Molecular Therapy. 28 (7), 1569-1584 (2020).
  6. Wu, K., et al. Variant SARS-CoV-2 mRNA vaccines confer broad neutralization as primary or booster series in mice. Vaccine. 39 (51), 7394-7400 (2021).
  7. Chaudhary, N., Weissman, D., Whitehead, K. A. mRNA vaccines for infectious diseases: Principles, delivery and clinical translation. Nature Reviews Drug Discovery. 20, 817-838 (2021).
  8. Kormann, M. S. D., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).
  9. Tavernier, G., et al. mRNA as gene therapeutic: How to control protein expression. Journal of Controlled Release. 150 (3), 238-247 (2011).
  10. Walsh, E. E., et al. Safety and immunogenicity of two RNA-based Covid-19 vaccine candidates. The New England Journal of Medicine. 383 (25), 2439-2450 (2020).
  11. Baden, L. R., et al. Efficacy and safety of the mRNA-1273 SARS-CoV-2 vaccine. The New England Journal of Medicine. 384 (5), 403-416 (2021).
  12. Guan, S., Rosenecker, J. Nanotechnologies in delivery of mRNA therapeutics using nonviral vector-based delivery systems. Gene Therapy. 24 (3), 133-143 (2017).
  13. Sharova, L. V., et al. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Research. 16 (1), 45-58 (2009).
  14. Houseley, J., Tollervey, D. The many pathways of RNA degradation. Cell. 136 (4), 763-776 (2009).
  15. Kowalski, P. S., Rudra, A., Miao, L., Anderson, D. G. Delivering the messenger: Advances in technologies for therapeutic mRNA delivery. Molecular Therapy. 27 (4), 710-728 (2019).
  16. Sahin, U., Karikó, K., Türeci, Ö MRNA-based therapeutics-developing a new class of drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 13, 359-380 (2014).
  17. Hajj, K. A., Whitehead, K. A. Tools for translation: Non-viral materials for therapeutic mRNA delivery. Nature Reviews Materials. 2, 17056(2017).
  18. Deering, R. P., Kommareddy, S., Ulmer, J. B., Brito, L. A., Geall, A. J. Nucleic acid vaccines: Prospects for non-viral delivery of mRNA vaccines. Expert Opinion on Drug Delivery. 11 (6), 885-899 (2014).
  19. Wadhwa, A., Aljabbari, A., Lokras, A., Foged, C., Thakur, A. Opportunities and challenges in the delivery of mRNA-based vaccines. Pharmaceutics. 12 (2), 102(2020).
  20. Hou, X., Zaks, T., Langer, R., Dong, Y. Lipid nanoparticles for mRNA delivery. Nature Reviews Materials. 6 (12), 1078-1094 (2021).
  21. Sahin, U., et al. COVID-19 vaccine BNT162b1 elicits human antibody and T(H)1 T cell responses. Nature. 586 (7830), 594-599 (2020).
  22. Azzi, L., et al. Mucosal immune response in BNT162b2 COVID-19 vaccine recipients. EBioMedicine. 75, 103788(2022).
  23. Guan, S., et al. Self-assembled peptide-poloxamine nanoparticles enable in vitro and in vivo genome restoration for cystic fibrosis. Nature Nanotechnology. 14 (3), 287-297 (2019).
  24. Pitard, B., et al. Negatively charged self-assembling DNA/poloxamine nanospheres for in vivo gene transfer. Nucleic Acids Research. 32 (20), 159(2004).
  25. Hiroi, T., Shibayama, M. Measurement of particle size distribution in turbid solutions by dynamic light scattering microscopy. Journal of Visualized Experiments. (119), e54885(2017).
  26. Hassett, K. J., et al. Impact of lipid nanoparticle size on mRNA vaccine immunogenicity. Journal of Controlled Release. 335, 237-246 (2021).
  27. Suk, J. S., et al. The penetration of fresh undiluted sputum expectorated by cystic fibrosis patients by non-adhesive polymer nanoparticles. Biomaterials. 30 (13), 2591-2597 (2009).
  28. Kim, N., Duncan, G. A., Hanes, J., Suk, J. S. Barriers to inhaled gene therapy of obstructive lung diseases: A review. Journal of Controlled Release. 240, 465-488 (2016).
  29. Liu, Z., Fontana, F., Python, A., Hirvonen, J. T., Santos, H. A. Microfluidics for production of particles: Mechanism, methodology, and applications. Small. 16 (9), 1904673(2020).
  30. Guan, S., Darmstädter, M., Xu, C., Rosenecker, J. In vitro investigations on optimizing and nebulization of IVT-mRNA formulations for potential pulmonary-based alpha-1-antitrypsin deficiency treatment. Pharmaceutics. 13 (8), 1281(2021).
  31. Shepherd, S. J., Issadore, D., Mitchell, M. J. Microfluidic formulation of nanoparticles for biomedical applications. Biomaterials. 274, 120826(2021).
  32. Han, J., et al. A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 101 (10), 4018-4023 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

mRNA transfectiein vitro transcriptiepulmonale mRNA afleveringMetridia luciferase mRNAmicroflu dische mengingdynamische lichtverstrooiingmenselijke bronchiale cellentransmissie elektronenmicroscopieaflevering van mRNA vaccins

Gerelateerde artikelen