Proximity ligation assay maakt de detectie, lokalisatie en kwantificering van eiwitargininemethylering in gefixeerd weefsel mogelijk

Summary

Proximity ligation assay is een zeer nuttige techniek om argininemethylering van een bepaald eiwit te lokaliseren en te kwantificeren wanneer het gemodificeerde arginineresidu onbekend is en/of als er geen specifiek antilichaam beschikbaar is.

Abstract

Argininemethylering is in opkomst als een belangrijke posttranslationele modificatie die betrokken is bij een groot aantal biologische processen. De studie ervan in weefsel wordt vaak beperkt door het ontbreken van een specifiek antilichaam dat het doelwitresidu van arginine herkent. Proximity ligation assay (PLA) is oorspronkelijk ontwikkeld om eiwit/eiwit-interacties te bestuderen. Hier beschrijven we in detail een PLA-protocol voor de detectie van argininemethylering dat we hebben toegepast op de glucocorticoïdreceptor (GR). Nadat we eerder hadden aangetoond dat PRMT5 GR's in cellen dimethyleert, gebruikten we PLA met een pansymmetrisch dimethylantilichaam en een anti-GR-antilichaam om GR-methylering in borsttumoren te meten. We tonen aan dat PLA een unieke benadering biedt om argininemethylering van een doeleiwit te meten, zelfs wanneer de plaats van methylering niet is geïdentificeerd. Deze techniek zou kunnen worden uitgebreid naar andere posttranslationele modificaties waar effectieve pan-antilichamen beschikbaar zijn. Daarom beschrijven we de PLA-technologie die wordt gebruikt om argininemethylering in gefixeerd weefsel te detecteren met GR als voorbeeld.

Introduction

Argininemethylering door eiwit argininemethyltransferasen (PRMT's) is een overvloedige posttranslationele modificatie (PTM) die betrokken is bij tal van biologische processen. PRMT's katalyseren de overdracht van methylgroepen van het S-adenosylmethionine naar arginineresiduen. De PRMT-familie bestaat uit negen leden die zijn geclassificeerd op basis van het type methylering dat ze uitvoeren. Alle leden voeren monomethylering (MMA) uit. Type 1 (PRMT1, 2, 3, 4, 6 en 8) PRMT's katalyseren asymmetrische dimethylering (ADMA), terwijl type 2 (PRMT5 en 9) symmetrische dimethylering (SDMA) katalyseren en type 3 (PRMT7) alleen MMA¹ genereren. Door talrijke substraten te methyleren, reguleren de verschillende PRMT's een breed scala aan belangrijke cellulaire processen, zoals DNA-herstel, transcriptieregulatie, immuunrespons, RNA-verwerking en signaaltransductie ^2,3. Dit geldt met name voor steroïde hormoonsignalering, waarbij PRMT's de activiteit van steroïde receptoren wijzigen door niet alleen de receptoren zelf te methyleren, maar ook hun regulatoren of histonen².

Argininemethylering wordt grotendeels bestudeerd bij kanker, aangezien werd aangetoond dat de meerderheid van de PRMT's tot overexpressie werd gebracht bij kanker in vergelijking met normale weefsels, en hun expressie wordt vaak geassocieerd met een slechte prognose ^4,5. Detectie van argininemethylering in vivo is essentieel voor het begrijpen van cellulaire functies die verband houden met deze modificatie. Dit wordt conventioneel bereikt door immunohistochemie (IHC) uit te voeren met een specifiek antilichaam dat het gemethyleerde arginineresidu herkent. Deze methode is echter zeer beperkt omdat deze is gebaseerd op de identificatie van het gemodificeerde arginineresidu en afhankelijk is van de werkzaamheid van het gebruikte antilichaam. In situ proximity ligation assay (PLA) werd oorspronkelijk ontwikkeld om eiwit/eiwitinteracties in gefixeerde cellen of weefsels te bestuderen⁶. Interessant is dat deze technologie ook kan worden gebruikt om PTM's te detecteren met behulp van een pan-antilichaam tegen de wijziging van interesse, evenals een antilichaam dat het beoogde eiwit herkent. Ons team heeft deze techniek eerder aangepast om oestrogeenreceptor-alfa (ERα) methylering te bestuderen, met behulp van een anti-ERα-antilichaam en een antilichaam dat specifiek de methyleringsplaats op arginine 260⁷ herkent. Merk op dat deze techniek kan worden uitgebreid tot antilichamen die een speciaal type methylering herkennen, zelfs als het gemethyleerde residu onbekend is. Verschillende bedrijven leveren inderdaad pan-antilichamen die specifiek MMA, ADMA of SDMA herkennen en die met succes kunnen worden gebruikt om eiwitmethylering in vivo te bestuderen.

Hier presenteren we, als proof-of-concept, een gedetailleerde analyse van GR-methylering met behulp van SDMA-antilichamen in menselijke borsttumoren, van experimenteel ontwerp tot data-analyse.

Protocol

Van elke patiënt werd schriftelijke geïnformeerde toestemming verkregen. Het studieprotocol werd goedgekeurd door de institutionele ethische commissie van het Cancer Research Center van Lyon.

1. Keuze van de antilichamen

1. Gebruik primaire antilichamen gevalideerd door IHC of immunofluorescentie (IF).
   OPMERKING: De primaire antilichamen die voor de studie zijn geselecteerd, zijn cruciaal voor het succes van PLA en meer in het bijzonder in gefixeerd weefsel. Het gebruik van een door IHC of IF gevalideerd antilichaam zal het slagingspercentage van het experiment verhogen. Optimalisatie en specificiteit van antilichamen zijn vereist voordat experimenten worden uitgevoerd, idealiter door controle-experimenten uit te voeren in cellen die ongeldig zijn voor de expressie van het betreffende eiwit en door een remmer te gebruiken die specifiek is voor de enzymatische activiteit van de betrokken methyltransferase. Hier zijn de omstandigheden eerder geoptimaliseerd¹⁰.

2. In paraffine ingebedde cellijnpelletbereiding

OPMERKING: De monsters worden ingebed in een gel en vervolgens in een geautomatiseerde weefselverwerker geplaatst voor uitdroging van het monster en inbedding van paraffine.

1. Bereid de celpellet in een microcentrifugebuisje van 1,5 ml met behulp van trypsinedissociatie.
   OPMERKING: Schraap niet om cellen te oogsten.
2. Resuspendeer de celpellet in 1,5 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
3. Centrifugeer de cellen bij kamertemperatuur (RT) bij 200 x g. Aspireer de PBS-supernatant.
4. Resuspendeer de pellet in 1 ml 4% formaline en bewaar de buisjes gedurende 3 uur bij 4 °C.
5. Was de cellen in 1X Tris-gebufferde-zoutoplossing (TBS).
   OPMERKING: Gebruik geen oplossing op basis van fosfaat, omdat deze de gel depolymeriseert.
6. Voeg 1 ml TBS toe en homogeniseer gedurende 30 s door vortex. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 200 x g en verwijder het supernatant.
7. Herhaal stap 2.5 tot en met 2.7 twee keer.
8. Voer de opname van het weefsel in de geautomatiseerde weefselverwerker uit volgens het specifieke programma:
   Formaline 1 uur 37 °C
   Gedestilleerd water 2 min RT
   EtOH 70% 40 min 45 °C
   EtOH 80% 40 min 45 °C
   EtOH 95% 40 min 45 °C
   EtOH 100% 40 min 45 °C
   EtOH 100% 40 min 45 °C
   EtOH 100% 40 min 45 °C
   Xyleen 40 min 45 °C
   Xyleen 40 min 45 °C
   Xyleen 40 min 45 °C
   Paraffine 1 h 60 °C
   Paraffine 1 h 60 °C
   Paraffine 1 uur 30 min 60 °C

3. Weefselfixatie en voorbereiding van objectglaasjes

1. Fixeer de tissues 24 uur in 4% formaline voordat u ze opneemt.
2. Snijd 3 μm dikke seriële secties van de blokken met weefsels met een microtoom.
3. Voer deparaffinisatie uit met de autokleurer door objectglaasjes achtereenvolgens twee keer in xyleen (10 min), 100% ethanol (5 min), 95% ethanol (5 min) en water (5 min) uit te broeden.
4. Voer door warmte geïnduceerde epitoopextractie uit in een citraatbuffer van 10 mM met behulp van een waterbad bij 98 °C gedurende 40 minuten bij de juiste pH (meestal 6-9).
   OPMERKING: De twee antilichamen moeten bij dezelfde pH werken om de methode succesvol te laten zijn. Er werden verschillende tests uitgevoerd voordat de optimale pH werd vastgesteld die hierin werd gebruikt. De antilichamen die in dit onderzoek zijn gebruikt, zijn SDMA-antilichamen en het GR-antilichaam.
5. Laat de dia's 20 minuten afkoelen en was ze vervolgens 20 minuten in 1x PBS.

4. IHC-experiment

OPMERKING: IHC-experimenten worden uitgevoerd met behulp van het Discovery XT-onderzoeksinstrument (Table of Materials) voor automatisering en reproduceerbaarheid.

1. Om afschrikking door peroxidase te voorkomen, gebruikt u de remmer die in de diaminobenzidine (DAB)-kit zit.
2. Incubeer de objectglaasjes met de twee primaire antilichamen verdund in het antilichaamverdunningsmiddel gedurende 60 minuten.
3. Incubeer de objectglaasjes met het secundaire anti-konijn mierikswortelperoxidase (HRP)-antilichaam gedurende 16 minuten of het anti-muizenantilichaam gedurende 30 minuten.
   OPMERKING: Het wordt aanbevolen om een in de handel verkrijgbare diaminobenzidine (DAB)-kit (materiaaltabel) te gebruiken voor IHC-detectie.
4. Breng hematoxyline (100 μL/dia gedurende 8 min) en blauwing (100 μL/dia gedurende 4 min) aan op de monsters om de kernen te kleuren.
5. Was de dia's in warm zeepsop, droog ze vervolgens uit met een autostainer en monteer ze op een geautomatiseerde overvaller met behulp van een montagemedium.

5. Reacties van de nabijheidsligatietest

OPMERKING: Alle gebruikte reagentia zijn opgenomen in de PLA-kits (Materiaaltabel). Het wordt aanbevolen om 40 μL reagens te gebruiken voor 1 cm² weefsel. Alle incubaties moeten worden uitgevoerd in een vochtige omgeving om overmatige verdamping te voorkomen. Laat het monster niet uitdrogen, dit kan leiden tot achtergrondgeluid. Het wordt aanbevolen om 1x buffer A (in situ wasbuffer, Materiaaltabel) te gebruiken voor de wasbeurten in de potten. Er moet een minimumvolume van 70 ml in de potten zijn wanneer de monsters onder roering worden geïncubeerd. Monsters moeten voor gebruik bij RT worden bewaard.

1. Peroxidase afschrikken
   1. Beperk het reactiegebied met behulp van een hydrofobe pen om overmatige verdamping van de oplossing tijdens het experiment te voorkomen. Voeg een druppel waterstofperoxideoplossing toe per 1 cm² van elk monster. Incubeer gedurende 5 minuten bij RT.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de incubatietijd te optimaliseren op basis van de gebruikte monsters/antilichamen.
2. Blokkeren
   1. Druppel voorzichtig buffer A op de monsters en was in buffer A bij 50 tpm onder roeren gedurende 5 minuten bij RT.
   2. Tik de resterende buffer A af en voeg één druppel per 1 cm² blokkeeroplossing toe (inbegrepen in de PLA-kit). Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C.
3. Incubatie van primaire antilichamen
   1. Verdun de twee primaire antilichamen in geschikte concentraties in het antilichaamverdunningsmiddel.
   2. Verwijder de blokkeeroplossing van de objectglaasjes en voeg onmiddellijk de primaire antilichaamoplossing toe (meegeleverd in de PLA-kit). Incubeer gedurende 1 uur in een vochtigheidskamer bij 37 °C.
4. Incubatie van PLA-sonde
   1. Verdun de PLA-sonde PLUS (1:5) met PLA-sonde minus (1:5) in het antilichaamverdunningsmiddel.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om 8 μL PLA-sonde minus voorraad (5x), 8 μL PLA-sonde plus voorraad (5x) en 24 μL antilichaamverdunningsmiddel te gebruiken voor een reactie van 40 μL.
   2. Druppel buffer A voorzichtig op de monsters en was in buffer A op 50 tpm gedurende 5 minuten bij RT.
   3. Tik de resterende buffer A af en breng de PLA-sondeoplossing (meegeleverd in de PLA-kit) aan op de monsters. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C.
5. Afbinding
   1. Ontdooi de ligatiebuffer (meegeleverd in de PLA-kit) voorafgaand aan de volgende stappen.
   2. Druppel buffer A voorzichtig op de monsters en was in buffer A op 50 tpm gedurende 5 minuten bij RT.
   3. Verdun de 5x ligatiebuffer (1:5) (inbegrepen in de PLA-kit) in zeer zuiver water. Voeg de ligase (1:40) (meegeleverd in de PLA-kit) toe direct voordat u deze aan het monster toevoegt.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om 8 μL van de 5x ligatiebuffer toe te voegen aan 31 μL water met een hoge zuiverheid voor een reactie van 40 μL. Voeg vervolgens 1 μL ligase toe.
   4. Tik de resterende buffer A af en breng de ligaseoplossing aan op de monsters. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C.
6. Amplificatie
   1. Ontdooi de versterkingsbuffer voordat u de volgende stappen uitvoert.
   2. Druppel buffer A voorzichtig op de monsters en was buffer A gedurende 2 minuten in op 50 tpm bij RT.
   3. Verdun de 5x versterkingsbuffer (1:5) (inbegrepen in de PLA-kit) in zeer zuiver water. Voeg het polymerase (1:80) (meegeleverd in de PLA-kit) toe onmiddellijk voordat u het voorzichtig op het monster druppelt.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om 8 μL van de 5x ligatiebuffer toe te voegen aan 31,5 μL water met een hoge zuiverheid voor een reactie van 40 μL. Voeg vervolgens 0,5 μL ligase toe.
   4. Tik de resterende buffer A af en breng de versterkingsoplossing aan op de monsters. Incubeer gedurende 2 uur bij 37 °C.
7. Opsporing
   1. Druppel buffer A voorzichtig op de monsters en was buffer A gedurende 2 minuten in op 50 tpm bij RT.
   2. Verdun de 5x detectie helderveldbuffer (1:5) (inbegrepen in de PLA-kit) in zeer zuiver water.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om 8 μL van de 5-voudige detectiebuffer toe te voegen aan 32 μL water met een hoge zuiverheidsgraad voor een reactie van 40 μL.
   3. Tik de resterende buffer A af en breng de detectieoplossing aan op de monsters. Incubeer gedurende 1 uur bij RT.
8. Ontwikkeling van substraat
   1. Druppel buffer A voorzichtig op de monsters en was buffer A gedurende 2 minuten in op 50 tpm bij RT.
   2. Verdun de substraatoplossing door de substraatreagentia A (1:70), B (1:100), C (1:100) en D (1:50) (inbegrepen in de PLA-kit) te verdunnen in zeer zuiver water.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om 0.6 μL substraat A, 0.4 μL substraat B, 0.4 μL substraat C en 0.8 μL substraat D toe te voegen in 37.8 μL zeer zuiver water voor een reactie van 40 μL.
   3. Tik de resterende buffer A af en breng de versterkingsoplossing aan op de monsters. Incubeer gedurende 10 minuten bij RT.
9. Nucleaire kleuring
   1. Druppel voorzichtig gedestilleerd water op de monsters en was het gedurende 50 minuten in gedestilleerd water bij 2 tpm bij RT.
   2. Tap het resterende gedestilleerde water eraf. Voeg een druppel nucleaire kleuring (meegeleverd in de PLA-kit) toe aan elk monster van 1 cm² en incubeer gedurende 2 minuten bij RT.
   3. Spoel de glaasjes 10 minuten af onder stromend kraanwater om de vlek te laten rijpen en een blauwe kleur te krijgen. Gebruik geen staand kraanwater.
10. Dehydratie
    1. Incubeer de objectglaasjes tweemaal gedurende 2 minuten in een oplossing met 96% ethanol. Incubeer de objectglaasjes vervolgens twee keer gedurende 2 minuten in een oplossing met 99,7% ethanol.
    2. Incubeer de objectglaasjes gedurende 10 minuten in xyleen. Breng de objectglaasjes vervolgens over op vers xyleen.
11. Montage van de geleiders
    1. Gebruik een minimale hoeveelheid niet-waterig montagemedium en breng een dekglaasje aan op het monster, zorg ervoor dat er geen luchtbellen onder de dekglaasjes vast komen te zitten.
    2. Laat de objectglaasjes drogen voordat u ze analyseert met een helderveldmicroscoop.

6. Beeldvorming voor lokalisatie

1. Maak afbeeldingen met behulp van een rechtopstaande microscoop.
   OPMERKING: In dit onderzoek werd beeldvorming van objectglaasjes uitgevoerd onder een rechtopstaande helderveldmicroscoop (Materiaaltabel). Beelden werden op een geautomatiseerde manier verkregen onder identieke omstandigheden met een vergroting van 40x voor ten minste 10 willekeurig gekozen gezichtsvelden. Het wordt aanbevolen om minimaal 500 cellen per aandoening te analyseren.

7. Analyse voor kwantificering

OPMERKING: Kwantificering van monsters is uitgevoerd met behulp van ImageJ-software⁸. FIJI, een ImageJ-distributie inclusief ImageJ en andere vooraf geïnstalleerde plug-ins, werd gebruikt voor de daaropvolgende analyses ^9,10.

1. Om het aantal stippen te bepalen:
   1. Open de afbeelding.
   2. Voer kleurdeconvolutie uit. Klik hiervoor op Afbeelding > Kleuren > Kleurdeconvolutie.
   3. Selecteer afbeelding: - (color_1) in de bestandsnaam.
   4. Gebruik de opdracht Maxima zoeken om het aantal stippen te bepalen (Proces > Maxima zoeken).
2. Het aantal cellen bepalen:
   1. Open de afbeelding.
   2. Voer kleurdeconvolutie uit. Klik hiervoor op Afbeelding > Kleuren > Kleurdeconvolutie.
   3. Selecteer afbeelding: - (color_1) in de bestandsnaam.
   4. Zoek een drempelwaarde die het maximale aantal kernen aangeeft. Klik hiervoor op Afbeelding > Helderheid/Contrast > Drempelwaarde.
   5. Vul de gaten door te klikken op Verwerken > Binair > gaten vullen.
   6. Gebruik de opdracht waterscheiding om verbonden componenten in afzonderlijke componenten te verdelen. Klik op Proces > binaire > stroomgebied.
   7. Analyseer deeltjes om het aantal kernen te bepalen door te klikken op Deeltjes analyseren > analyseren.

Results

Met behulp van de hierboven beschreven procedure is het mogelijk om de methylering van een interessant eiwit te detecteren en te kwantificeren. Hier laten we het voorbeeld zien van de methylering van GR door PRMT5. De antilichamen en de experimentele omstandigheden voor PLA werden eerder toegepast op cellen¹⁰. Kort gezegd worden primaire antilichamen gericht tegen GR en SDMA herkend door nabijheidssondes geconjugeerd met complementaire oligonucleotiden. Vervolgens...

Discussion

Argininemethylering draagt, net als andere PTM's, bij aan de fijne regulatie van eiwitfuncties. De impact ervan wordt echter onderschat vanwege de moeilijkheid om deze wijzigingen te beoordelen, voornamelijk vanwege een gebrek aan instrumenten. Dit is met name het geval bij het bestuderen van methylering in vivo, waarbij de enige manier om argininemethylering te meten is om specifieke antilichamen te bezitten die het gemethyleerde residu van het betreffende eiwit herkennen. Dit ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesion slides TOMO 90°, x100	VWR	631-1239
anti-GR antibody (mouse)	Santa Cruz	sc393232
anti-GR antibody (mouse)	santa cruz	sc393232
anti-PRMT5 antibody (rabbit)	Merck	07-405
anti-SDMA antibody (rabbit)	CST	13222
Automate d'inclusion	Leica	ASP 6025	Paraffin infiltratie en blokbereiding
Autostainer XL	Leica	ST5010	Autostainer
Cassettes Q path macrostar III  x1500	VWR	720-2233
CC1	Roche	5279801001
Citrate Buffer pH 6 10x, 100 mL	MMF	F/T0050
Dako antibody diluent	Dako Agilent	S202230-2	antibody diluent
Discovery ChromoMap Diaminobenzidine (DAB) kit	Roche	760-159	Diaminobenzidine (DAB) kit
Discovery Wash	Roche	7311079001
Duolink insitu  PLA probe anti-mouse minus	Sigma-Aldrich	DUO92004	PLA  kit (probe anti-rabbit minus)
Duolink insitu detection reagents brightfield	Sigma-Aldrich	DUO92012	PLA  kit (in situ detection reagents)
Duolink insitu PLA probe anti-rabbit plus	Sigma-Aldrich	DUO92002	PLA  kit (probe anti-rabbit plus)
Duolink insitu wash buffer brightfield	Sigma-Aldrich	DUO82047	PLA  kit (in situ wash buffer)
Ethanol 96% VOL TECHNISOLV, 5 L	VWR	83804.360
Ethanol absolute ≥99.8%, AnalaR NORMAPUR ACS,  5 L	VWR	20821.365
EZ Prep 10x	Roche	5279771001
Formol, ready to use, 5 L	MMF	F/40877-36	Formalin
Fully automated glass coverslipper	Leica	CV5030	automated coverslipper
Glass coverslips 24 x 40	Dutscher	100037
Hematoxylin	Ventana	760-2021
IHC instrument	Roche	DISCOVERY XT	Automatisering van IHC
LCS	Roche	5264839001
Microtome	Thermo Scientific	Microm HM340E	Snijden van de weefsels inclusief in blokken
Mounting Medium Pertex	Histolab	00801-FR
PAP Pen for immunostaining	Sigma-Aldrich	Z672548-1EA
Paraffin Wax tek III, 4 x 2, 5 kg	Sakura	4511
Pasteur Disposable Pipettes	Fisher Scientific	12583237
PBS Buffer 10x, 100 mL	MMF	F/T0020
Reaction Buffer 10x	Roche	5353955001
Ribo Wash 10x	Roche	5266262001
RiboCC1	Roche	5266297001
Secondary antibody anti-mouse	Abcam	ab133469
Secondary antibody OmniMap anti-rabbit HRP	Roche	760-4311
Tissue Embedding center	MMF	EC 350
Xylene (mixture of isomers) ≥98.5%, AnalaR NORMAPUR ACS, 5 L	VWR	28975.360
Zeiss Axio Imager M2 microscope			upright bright-field microscope