Spatiotemporele analyse van microgliale Ca2+ -activiteit met een resolutie van één cel

Samenvatting

In dit artikel beschrijven we een protocol voor in vivo beeldvorming van microgliale Ca²⁺ -activiteit en de daaropvolgende analyse van de spatiotemporele dynamiek. Deze methode maakt een grondige karakterisering mogelijk van hoe microglia reageren op veranderingen in de hersenomgeving, waarbij de fijne spatiotemporele schalen waarop dergelijke gebeurtenissen plaatsvinden op de juiste manier worden vastgelegd.

Samenvatting

Microglia zijn de enige immuuncellen in het centrale zenuwstelsel. Hun morfologie is zeer plastisch en verandert afhankelijk van hun activiteit. Onder homeostatische omstandigheden bezitten microglia een sterk vertakte morfologie. Dit vergemakkelijkt hun monitoring van de omgeving door het continu verlengen en intrekken van hun processen. Tijdens hersenletsel en ontsteking worden microglia echter geactiveerd en ondergaan ze dramatische morfologische veranderingen, waardoor hun vertakte processen worden ingetrokken en hun cellichaam opzwellen. Dit vergemakkelijkt activiteiten zoals migratie en fagocytose, die microglia ondernemen om de hersenomgeving naar een minder pathologische toestand te navigeren.

Deze nauwe relatie tussen microgliale morfologie en veranderingen in hun activiteit heeft aanzienlijke inzichten opgeleverd in verschillende microgliale functies. Dergelijke morfologische en activiteitsveranderingen zijn echter zelf verschijnselen die het gevolg kunnen zijn van een willekeurig aantal intracellulaire signaalroutes. Bovendien maken het tijdsverloop tussen stimulus en respons, evenals de sterk gecompartimenteerde morfologie van microglia, het moeilijk om de oorzakelijke mechanismen te isoleren die ten grondslag liggen aan de functie. Om dit probleem op te lossen, ontwikkelden we een genetisch gemodificeerde muizenlijn waarin een zeer gevoelig fluorescerend Ca²⁺-indicatoreiwit specifiek tot expressie wordt gebracht in microglia.

Na het beschrijven van methoden voor in vivo microgliale Ca²⁺ beeldvorming, presenteert dit artikel een gestructureerde analysebenadering die deze Ca²⁺ activiteit classificeert in rationeel gedefinieerde subcellulaire gebieden, waardoor ervoor wordt gezorgd dat de ruimtelijke en temporele dimensies van de gecodeerde informatie op een zinvolle manier worden geëxtraheerd. Wij zijn van mening dat deze benadering een gedetailleerd begrip zal bieden van de intracellulaire signaleringsregels die van toepassing zijn op de diverse reeks microgliale activiteiten die verband houden met zowel hogere hersenfuncties als pathologische aandoeningen.

Inleiding

Microglia zijn de aanwezige immuuncellen in het centrale zenuwstelsel (CZS) en spelen een belangrijke rol bij het handhaven van een homeostatische hersenomgeving en bij het reguleren van de vorming van neurale circuits tijdens de ontwikkeling van de hersenen ^1,2. Een uniek kenmerk van microglia in het CZS is dat hun morfologie zeer plastisch is; Verschillende morfologische fenotypes kunnen echter worden geassocieerd met bepaalde functies. Bovendien is de transformatie tussen morfologische fenotypes zeer dynamisch en vindt deze plaats op snelle tijdschalen als reactie op veranderingen in de omgeving ^3,4.

Onder homeostatische fysiologische omstandigheden nemen microglia een sterk vertakte morfologie aan, waarbij meerdere processen in alle richtingen naar buiten uitstralen. Deze vertakte processen zelf vertonen een hoge beweeglijkheid, waarbij ze continu uit- en intrekken ^3,4. Dergelijke activiteit is voornamelijk gericht op periodiek contact met neuronale synapsen, axonen en soma's om de neuronale activiteit te controleren 5,6,7,8,9. Wanneer de hersenen echter gewond zijn, detecteren microglia deze afwijking snel en als eerste stap in hun adaptieve respons richten ze de uitbreiding van hun processen naar de overeenkomstige locatie ^3,4. Waar microglia nodig zijn om fagocytose van dode cellen en metabolieten uit te voeren, nemen ze een amoeboïde-achtige morfologie aan, waardoor hun processen worden verkort en hun cellichaam wordt vergroot, als onderdeel van hun overgang naar het immunologisch geactiveerde fenotype^10,11.

Hoewel de dramatische morfologische veranderingen van microgliale processen gemakkelijk kunnen worden gedetecteerd, zijn fijnere schaalveranderingen van de celsoma aanzienlijk moeilijker vast te leggen, vooral bij een temporele resolutie die fysiologisch relevant is. Bovendien vertegenwoordigen morfologische veranderingen zelf alleen het geïntegreerde resultaat van een willekeurig aantal intracellulaire signaalroutes. Dit is problematisch voor een doel om functionele activiteit te volgen en een stimulus mechanistisch te koppelen aan de eindrespons die het uitlokt.

Gezien zijn wijdverbreide rol als tweede boodschapper, legt het onderzoeken van de intracellulaire Ca²⁺-dynamiek de bijbehorende spatiotemporele informatie beter vast bij het bestuderen van dynamische celprocessen. Een dergelijke benadering is van toepassing op microglia, aangezien ze een verscheidenheid aan ionotrope en metabotrope receptoren tot expressie brengen die verband houden met stroomafwaartse intracellulaire Ca²⁺-verhoging. In vivo Ca²⁺-beeldvorming is inderdaad gebruikt om spatiotemporele aspecten van microgliale activiteiten in realtime te karakteriseren, waarbij veranderingen in microgliale Ca²⁺-activiteit met succes worden gecorreleerd met hersenletsel, ontsteking en zowel hyper- als hypoactiviteit in neuronen 12,13,14,15,16. Bijvoorbeeld, Ca²⁺-verhogingen geassocieerd met uitbreiding van het microgliale proces als reactie op hyper/hypoactieve neuronale activiteit weerspiegelen waarschijnlijk het onderliggende Ca²⁺-afhankelijke actinepolymerisatieproces¹⁶. Bovendien kan in vivo Ca²⁺ beeldvorming ook gemakkelijk worden gecombineerd met farmacologische benaderingen. Terwijl microglia bijvoorbeeld zowel P2X (ionotrope) als P2Y (metabotrope) receptoren tot expressie brengen, bootst lokale toepassing van P2Y-agonisten de microgliale^{Ca 2+}-respons op beschadigde naburige neuronen na en desensibiliseert deze vervolgens¹³, wat de grotere relevantie van P2Y-signalering voor het detecteren van neuronale schade impliceert.

Tot op heden hebben eerdere rapporten die de microgliale Ca²⁺ -activiteit onderzochten, gebruik gemaakt van op het interessegebied (ROI) gebaseerde analysemethoden. Een nadeel van deze benaderingen is dat ze nog steeds te grof zijn om de spatiotemporele dynamiek van Ca^2+- activiteit op het niveau van individuele microgliale processen op te lossen. Dit protocol beschrijft dus zowel conventionele ROI-gebaseerde methoden voor het analyseren van microgliale Ca²⁺ -activiteit als nieuwere op gebeurtenissen gebaseerde benaderingen, die individuele Ca²⁺ -gebeurtenissen in microgliale processen kunnen extraheren. Vooraf bieden we een algemene gids voor in vivo beeldvorming van twee fotonen om microgliale Ca²⁺ -activiteit op de juiste manier vast te leggen voor gedetailleerde analyse.

Protocol

Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Animal Research Committees van het National Institute for Physiological Sciences en waren in overeenstemming met de richtlijnen van de National Institutes of Health. Voor alle experimenten werden 8-10 weken oude mannelijke muizen grootgebracht onder een licht/donker-cyclus van 12/12 uur met ad libitum toegang tot voedsel en water. Om de Ca²⁺ activiteit in microglia te visualiseren, werden geïoniseerde Ca²⁺ bindingsadaptermolecuul 1 (Iba1)-tetracycline transactivator (Iba1-tTA) muizen gekruist met tetracycline operator-GCaMP6 (tetO-GCaMP6) muizen^17,18. Bij afwezigheid van tetracycline-analoge suppletie drijft de Iba1-promotor dus de expressie van GCaMP6 aan, uitsluitend in microglia. Voor alle experimenten werd de voedingssuppletie met doxycycline 6 weken na de geboorte stopgezet. Aan het einde van alle experimenten werden muizen geëuthanaseerd door een overdosis isofluraan, gevolgd door cervicale dislocatie. Zie de Materiaaltabel voor details met betrekking tot alle materialen, dieren en reagentia die in dit protocol worden gebruikt.

1. Chirurgische voorbereiding van muizen voor in vivo beeldvorming met twee fotonen; Dag 1

1. Voer alle chirurgische ingrepen uit in een laminaire luchtstroomkast om steriele werkomstandigheden te behouden. Voordat u met de operatie begint, steriliseert u de binnenkant van de kast gedurende 5 minuten met UV-licht.
2. Steriliseer alle werkoppervlakken, het operatieframe en stereotactische instrumenten door ze af te vegen met 70% ethanol.
3. Steriliseer alle chirurgische instrumenten (schaar, tang, scheermesje, pincet) en de op maat gemaakte hoofdplaat die aan de schedel van de muis moet worden bevestigd door ze onder te dompelen in 1% chloorhexidinegluconaatoplossing.
4. Verdoof de muis met ketamine (7,4 mg ^kg-1, intraperitoneaal [i.p.]) en xylazine (10 mg ^kg-1, i.p.). Breng het terug naar zijn thuiskooi totdat de verdoving aanslaat. Bevestig de volledige inductie van anesthesie door verlies van de teenknijpreflex.
5. Steriliseer de hoofdhuid met 1% chloorhexidinegluconaat. Scheer de vacht weg met een scheermesje.
6. Zet de muis vast binnen het operatiekader met behulp van stereotactische instrumenten.
7. Breng dierenartszalf aan op de ogen om uitdroging onder narcose te voorkomen.
8. Breng 2% xylocaïnegelei aan op de hoofdhuid voor pijnbestrijding. Wacht 5 minuten.
9. Verwijder de hoofdhuid met een schaar en leg de schedel bloot. Reinig het botzakje en droog het blootgestelde schedeloppervlak af door met wattenstaafjes te wrijven.
   OPMERKING: De blootgestelde schedelgebieden moeten volledig droog zijn om een sterke hechting met de op maat gemaakte hoofdplaat te garanderen.
10. Bevestig de op maat gemaakte hoofdplaat aan de schedel met tandcement.
11. Zodra het cement is uitgehard, vult u eventuele openingen tussen het schedeloppervlak en de randen van de op maat gemaakte kopplaat op met extra tandheelkundig cement.
12. Maak het cement en de schedeloppervlakken waterdicht door tandheelkundig harscement op acrylbasis aan te brengen.
13. Plaats de muis terug in zijn thuiskooi en plaats hem op een warmhoudkussen. Houd de muis in de gaten totdat deze weer voldoende bewustzijn heeft om de sternale lighouding te behouden (binnen 2 uur).
    OPMERKING: Muizen zouden de volgende dag volledig hersteld moeten zijn en kunnen dan samen met andere dieren worden gehuisvest.

2. Chirurgische voorbereiding van muizen voor in vivo beeldvorming van twee fotonen; Dag 2

1. Voer alle chirurgische ingrepen uit in een laminaire luchtstroomkast om steriele werkomstandigheden te behouden. Voordat u met de operatie begint, steriliseert u de binnenkant van de kast gedurende 5 minuten met UV-licht.
2. Lamineer twee glazen dekglaasjes van verschillende afmetingen (bovenste glas: 3 mm × 3 mm; onderste glas: 2 mm × 2 mm) met UV-uithardende optische hars.
   OPMERKING: Het dubbele dekglaasje biedt langdurige bescherming aan het hersengebied dat wordt blootgesteld door het schedelvenster, terwijl het chronische optische toegang mogelijk maakt. De afmetingen kunnen dus worden aangepast aan het hersengebied dat moet worden afgebeeld.
3. Steriliseer alle werkoppervlakken en het operatieframe door ze af te vegen met 70% ethanol.
4. Steriliseer alle chirurgische instrumenten (staalboor, pincet, chirurgische naaldhaak) door ze onder te dompelen in 1% chloorhexidinegluconaatoplossing.
5. Verdoof de muis met isofluraan (4% inductie, 1,2%-1,5% onderhoud). Zet de muis vast in het operatiekader via de hoofdplaat.
6. Om een schedelvenster over de primaire motorische cortex te maken, markeert u een vierkant met afmetingen van 2 mm × 2 mm gecentreerd 0,2 mm anterieur en 1 mm lateraal van, het oriëntatiepunt van de Bregma-schedel.
7. Verdun de schedel langs de rand van het gemarkeerde vierkant met behulp van de staalboor.
   OPMERKING: Wanneer ze dicht bij de gewenste dikte zijn, zullen de verdunde schedelgebieden transparant lijken wanneer ze worden bevochtigd met zoutoplossing en zullen er haarscheurtjes verschijnen.
8. Nadat u hebt bevestigd dat de hele rand van het gemarkeerde vierkant op de juiste manier is verdund, plaatst u de chirurgische naaldhaak voorzichtig net onder het schedeloppervlak en richt u de punt naar het midden van het vierkant. Til het vierkante stuk schedel voorzichtig op met de haak en gebruik een pincet om het los te trekken van de rest van de schedel. Als er een bloeding optreedt, was dan continu het blootgestelde hersenoppervlak met zoutoplossing totdat het volledig is verdwenen.
9. Plaats het dubbele dekglaasje op het blootgestelde hersenoppervlak en richt de kant met het kleinere dekglaasje naar de hersenen. Zorg ervoor dat de randen van het grotere dekglaasje in contact zijn met de randen van het schedelvenster.
10. Gebruik een glazen staaf met siliconenpunt die in een manipulator is gemonteerd en druk voorzichtig op het dubbele dekglaasje om ervoor te zorgen dat het goed contact maakt met het hersenoppervlak.
11. Vul de opening tussen het dubbele dekglaasje, de schedel en het hersenoppervlak met UV-uithardende hars en bestraal met UV-licht tot het hard is (~20 s). Til de glazen staaf met siliconenpunt langzaam op van het dubbele dekglaasje.
12. Laat de muis herstellen en plaats hem op een warmhoudkussen. Houd de muis in de gaten totdat deze weer voldoende bewustzijn heeft om de sternale lighouding te behouden (30 min).
13. Ga verder met stap 3 of plaats de muis terug in zijn thuiskooi.
    OPMERKING: Na een bekwame operatie zijn de dura en alle onderliggende bloedvaten volledig intact zonder bloedingen. In dit geval is de ontsteking minimaal en is het mogelijk om direct door te gaan naar stap 3. Als u het niet zeker weet, wacht dan 1-3 weken om er zeker van te zijn dat de ontsteking volledig is verdwenen.

3. Gegevensverzameling met behulp van in vivo beeldvorming met twee fotonen

1. Schakel de beeldvormingsinstelling van tevoren in om ervoor te zorgen dat de laser voldoende tijd heeft om op te warmen en te stabiliseren. Stem de laser af om uit te zenden op een golflengte van 920 nm, het twee-fotonspectrum dat de GCaMP6-fluorofoor optimaal opwindt.
2. Plaats de muis onder een 25x microscoop objectieflens en laat hem 30 minuten wennen. Verdoof de muis indien nodig met isofluraan tijdens de beeldvorming (4% inductie, 1,2%-1,5% onderhoud).
   OPMERKING: Isofluraan is mogelijk niet geschikt voor sommige onderzoekstoepassingen, omdat het de motiliteit van het microgliale proces en de Ca²⁺-activiteit^{beïnvloedt 19,20,21}.
3. Stel de zoom in op 1x en zoek vervolgens naar microglia die GCaMP6 tot expressie brengen in het craniale venstergebied. Zoek op een diepte tussen 100 μm en 300 μm onder het hersenoppervlak.
4. Zodra een geschikte GCaMP6-expressie microglia is gevonden, maximaliseert u de zoom zodat Ca²⁺ -activiteit kan worden vastgelegd met een resolutie van één cel.
5. Controleer visueel of de Ca²⁺ -activiteit duidelijk wordt vastgelegd en pas indien nodig het laservermogen en de beeldversterking aan.
   OPMERKING: Het laservermogen moet zoveel mogelijk worden geminimaliseerd om fotobleken en letsel aan microglia te voorkomen.
6. Voer vierdimensionale (4D) beeldacquisitie als volgt uit (stappen 3.6.1-3.6.3; Figuur 1B):
   1. Stel de afbeeldingsafmetingen in op XY-gebied = 512 × 512 pixels, 0,25 μm/pixel; Z-gebied = vijf z-vlakken, 3 μm z-stap (Figuur 1B).
   2. Stel de acquisitiesnelheid in op 2,5 frames/s.
      OPMERKING: Z-scannen met deze snelheid wordt mogelijk gemaakt door een piëzo-nanopositioneringssysteem.
   3. Verkrijg gegevens totdat ten minste 10 individuele Ca^2+- gebeurtenissen zijn waargenomen (meestal 10 minuten).

4. Voorbereiding op analyse (bewegingscorrectie, gemiddelde/max z-projectie)

1. Voordat u doorgaat met het analyseren van microgliale Ca²⁺ -activiteit, corrigeert u de 4D-beelden op bewegingsgerelateerde artefacten (beeldregistratie) met behulp van het ECC-algoritme voor beelduitlijning²² binnen de MATLAB-programmeeromgeving (R2020a). Download de code via: https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/27253-ecc-image-alignment-algorithm-image-registration.
2. Maak een referentie 3D-afbeelding door alle afbeeldingen binnen het eerste tijdsbestek te registreren met behulp van de imregister MATLAB-bewerking (standaard beeldverwerkingstoolbox).
3. Registreer alle volgende beelden en match ze met het corresponderende z-vlak van het 3D-referentiebeeld met behulp van de ecc-functie (ECC-algoritmebibliotheek voor beelduitlijning).
4. Genereer gemiddelde intensiteit z-projecties van de geregistreerde beelden met behulp van de gemiddelde MATLAB-bewerking. Als het beeldsignaal te zwak is, genereer dan z-projecties met maximale intensiteit met behulp van de maximale MATLAB-bewerking.
   OPMERKING: De signaal-ruisverhouding is slechter bij gebruik van z-projecties met maximale intensiteit.
5. Ga verder met stap 5 of 6. Gebruik de z-projecties die in stap 4 zijn gegenereerd als analysedoel voor het in kaart brengen van de spatiotemporele dynamiek van Ca²⁺ -activiteit in stap 5 en 6.

5. Analyse op basis van ROI

1. Identificeer met behulp van de z-projecties die in stap 4 zijn gegenereerd microgliale processen die gedurende de beeldvormingsperiode een stabiel gebiedsprofiel (stabiel gebied) behouden voor daaropvolgende analyse van Ca²⁺ -activiteit als volgt (stappen 5.3-5.6):
   1. Genereer afzonderlijke t-projecties met maximale intensiteit van de geregistreerde 4D-beelden van monsters van 2 minuten die aan het begin en einde van de beeldvormingsperiode zijn genomen met behulp van de maximale MATLAB-bewerking.
   2. Binariseer de t-projecties om polygonen van de microgliale morfologie te genereren die overeenkomen met het begin en einde van de beeldvormingsperiode met behulp van de imbinarize MATLAB-operatie. Gebruik de automatisch ingestelde standaarddrempel.
      OPMERKING: Als het Ca²⁺ -signaal zwak is tijdens het begin en einde van de beeldvormingsperiode, kan binarisatie polygonen genereren met ontbrekende randen. Teken in dit geval de ontbrekende randen handmatig met het potlood in ImageJ.
   3. Bedek de t-projectiepolygonen met behulp van de imadd MATLAB-bewerking. De overlappende regio('s) vertegenwoordigen het stabiele gebied (Figuur 2B).
   4. Gebruik binnen geïdentificeerde stabiele gebieden de drawpolygon MATLAB-bewerking om handmatig ROI's te definiëren en te traceren voor elk van de primaire microgliale processen en eventuele voor de hand liggende tweede-orde subtakken.
2. Volg de absolute fluorescentie-intensiteiten gemiddeld over een individuele ROI over alle tijdsbestekken (Figuur 2C,D).
3. Bereken uit de tijdreeksen van absolute fluorescentie-intensiteiten de relatieve verandering in fluorescentie-intensiteit (ΔF/F) tijdreeksen volgens vergelijking (1). Deze tijdreeks vertegenwoordigt de genormaliseerde microgliale Ca²⁺ dynamiek op het niveau van individuele ROI's.
   ΔF/F = (F(t) - F₀) / F₀ (1)
   Waarbij F(t) de geregistreerde fluorescentie-intensiteit op een bepaald moment is en F0 het 10e^percentiel van de fluorescentie-intensiteit in alle tijdsbestekken (Figuur 2E).
4. Identificeer kandidaat Ca²⁺ ontstekingsgebeurtenissen die zich voordoen in een bepaalde individuele ROI als volgt (stappen 5.5.1-5.5.3):
   1. Pas type I eindige impulsrespons (FIR) laagdoorlaatfiltering toe op de ΔF/ F-tijdreeksen met behulp van de fir1 MATLAB-bewerking. Stel de cut-off frequentie in op de Nyquist-waarde (de helft van de bemonsteringsfrequentie).
   2. Inspecteer het gefilterde spoor visueel om te bevestigen dat de individuele spoorpieken overeenkomen met uitbarstingen van Ca²⁺ -activiteit in de geregistreerde 4D-beelden (Figuur 2F).
   3. Identificeer kandidaat Ca²⁺ afvuurgebeurtenissen als concave neerwaartse verbuigingen in hetΔF/F-tijdreeksspoor. Definieer een basislijndrempel als de mediane ΔF/F-waarde binnen de boven- en onderplafonds die de maximale en minimale amplitudes van 10% over alle tijdsbestekken uitsluiten. Definieer een detectiedrempel van drie SD's boven de basislijndrempel (Figuur 2F,H).
5. Identificeer als volgt echte Ca²⁺ ontslaggebeurtenissen van kandidaten (stappen 5.5.1-5.5.2):
   1. Bereken de helling van elke kandidaat-gebeurtenis door onderscheid te maken tussen de corresponderende gefilterde ΔF/F-tijdreeksframes met behulp van de numerieke gradiënt MATLAB-bewerking.
   2. Identificeer vervolgens echte Ca²⁺-gebeurtenissen op basis van de rise-time van het profiel. Definieer een basislijndrempel als het gemiddelde van hellingswaarden voor alle kandidaat-evenementen. Definieer een detectiedrempel van drie SD's boven de basislijndrempel (Figuur 2G,H).
6. Karakteriseer echte Ca²⁺ gebeurtenissen als volgt (stappen 5.6.1-5.6.3):
   OPMERKING: Het volgende is geen uitputtende lijst van parameters die kunnen worden gebruikt om microgliale Ca²⁺ -gebeurtenissen te karakteriseren. Parameters die van belang zijn, zijn afhankelijk van het doel van het onderzoek.
   1. Leid de maximale amplitude van een echte Ca²⁺ -vuurgebeurtenis af als de ΔF/F-waarde van het corresponderende ΔF/ F-tijdreeksframe.
   2. Leid de gemiddelde amplitude van een echte Ca²⁺ afvuurgebeurtenis af als de gemiddelde ΔF/F-waarde over de gehele corresponderende ΔF/ F-tijdreekssubset van frames.
   3. Leid de frequentie van echte Ca²⁺ -gebeurtenissen af als het aantal gebeurtenissen gedeeld door de beeldvormingstijd.

6. Analyse op basis van gebeurtenissen

1. Voer een event-based analyse uit op de z-projecties uit stap 4 met behulp van de AQuA-bibliotheek binnen de MATLAB-programmeeromgeving. Download de code van: https://github.com/yu-lab-vt/AQuA.
   OPMERKING: Een overzicht voor algemeen gebruik van de AQuA-bibliotheek is beschikbaar op: https://drive.google.com/file/d/1a3lhe0dUth-5J1-S2fZlPOCZlPbeuvUr/view. Gedetailleerde documentatie voor de AQuA-bibliotheek is beschikbaar op: https://drive.google.com/file/d/1CckDLbrkw16b7MPlOQdYpZciIz80Snm_/view.
2. Nadat u MATLAB hebt gestart, schakelt u over van de standaard werkmapmap naar de aangewezen werkmapmap van AQuA met behulp van de cd-bewerking .
3. Laad de geregistreerde 4D-afbeeldingen als volgt in de AQuA-analysepijplijn (stappen 6.3.1-6.3.2):
   1. Start de AQuA GUI. Typ aqua_gui in het opdrachtvenster van MATLAB in de aangewezen werkmapmap van AQuA.
   2. Klik in de AQuA GUI op nieuw project en selecteer de geregistreerde afbeeldingen die moeten worden geanalyseerd. Geef het gegevenstype (GCaMPInVivo_cyto_Lck_) en de beeldvormingsparameters op (tijdelijke resolutie seconden per frame = 1,993; ruimtelijke resolutie μm per pixel = 0,25; sluit pixels uit die korter zijn dan deze afstand tot de rand = 5). Klik op openen om de gegevens te laden.
4. Definieer oriëntatiepunten voor de volgende analysepijplijnen door interessegebieden te traceren. Meestal zijn oriëntatiepunten gebaseerd op de celgrens en het gebied van het cellichaam.
5. Detecteer vervolgens kandidaat Ca²⁺ -gebeurtenissen door de geautomatiseerde analysepijplijnen uit te voeren voor de volgende parameters: actief signaal, supervoxel, gebeurtenisdetectie, schone gebeurtenissen en samenvoeggebeurtenissen.
   OPMERKING: Een gedetailleerde uitleg over elk van deze parameters en de output van hun kandidaatscore wordt gegeven in de AQuA-walkthrough. In het kort passen deze parameters de Ca²⁺ -gebeurtenisdetectiedrempel als volgt aan: actief signaal = fluorescentieamplitude, supervoxel = clustering van fluorescering in 3D-ruimte, gebeurtenisdetectie = opkomst/vervalkinetiek, schone gebeurtenissen = signaal-ruisverhouding en samenvoeggebeurtenissen = tijdelijke scheiding van gebeurtenissen.
6. Inspecteer de gedetecteerde Ca²⁺ -gebeurtenissen visueel (automatisch over de originele geregistreerde afbeeldingen heen gelegd). Pas indien nodig de parameterinstellingen van de analysepijplijnen aan door rekening te houden met de beeldkwaliteit in termen van de bovenstaande parameters; Als de beeldkwaliteit voor een bepaalde parameter goed is, kan een hogere drempel worden ingesteld en vice versa.
7. Zodra alle Ca²⁺ -gebeurtenissen op de juiste manier zijn gedetecteerd, karakteriseert u deze gebeurtenissen binnen de hoofdomgeving van MATLAB als volgt (stappen 6.8-6.14):
8. Exporteer de uitvoerbestanden van de AQuA-analyse.
   OPMERKING: Een gedetailleerde uitleg over de uitvoerbestanden, de geëxtraheerde functies die worden gebruikt om Ca²⁺ -gebeurtenissen te definiëren en de onderliggende parameters van deze geëxtraheerde functies wordt gegeven in de AQuA-documentatie.
9. (optioneel) Categoriseer alle Ca²⁺ gebeurtenissen in twee groepen: 1) gebeurtenissen die beginnen bij de soma en 2) gebeurtenissen die beginnen bij de processen.
10. Krijg toegang tot de amplitude van individuele Ca^2+- gebeurtenissen binnen de res.dffMat MATLAB-structuur van het AQuA-analyse-uitvoerbestand (.mat-bestand).
11. Leid de frequentie van individuele Ca²⁺ -gebeurtenissen af met behulp van de res.fts.loc.x3D MATLAB-bewerking (AQuA-bibliotheek).
12. Leid de duur van individuele Ca²⁺ -gebeurtenissen af met behulp van de res.fts.curve.width11 MATLAB-bewerking (AQuA-bibliotheek).
13. Leid het gebied van individuele Ca²⁺ -gebeurtenissen af met behulp van de res.fts.basic.area MATLAB-bewerking (AQuA-bibliotheek).
14. Categoriseer alle Ca²⁺ gebeurtenissen als: 1) lokale gebeurtenissen, 2) propagatieve gebeurtenissen die naar de soma reizen, en 3) propagatieve gebeurtenissen die weg reizen van de soma. Gebruik hiervoor de MATLAB-bewerkingen res.fts.region.landmarkDir.chgToward en res.fts.region.landmarkDir.chgAway (AQuA-bibliotheek) (Afbeelding 3C).

Resultaten

Bij transgene muizen die uitsluitend GCaMP6 (Ca²⁺-gevoelig fluorescerend eiwit) tot expressie brengen in microglia, zien we doorgaans verschillende patronen van microgliale Ca²⁺ -activiteit (Figuur 2A). Belangrijk is dat zelfs binnen een enkele microglia de patronen van Ca²⁺ -activiteit dramatisch kunnen verschillen tussen processen.

Om dergelijke proces-tot-proces verschillen in de spatiotemporele dynamiek van microgliale Ca²⁺-activiteit te kwantificeren, moeten eerst stabiele gebieden worden geïdentificeerd en vervolgens worden onderverdeeld in fijn gesegmenteerde ROI's (Figuur 2B,C). Voor elke ROI moeten parameters van Ca²⁺-activiteit worden afgeleid en gekwantificeerd, zoals amplitude en frequentie, door kenmerken zoals lokale amplitudes en spoorhellingen te extraheren uit de tijdreeks van de fluorescentie-intensiteit (Figuur 2D-G).

Vervolgens moeten individuele Ca²⁺ -gebeurtenissen worden onderzocht door het nauwkeurige kwantificeringsalgoritme AQuA toe te passen (Figuur 3A). Uit dergelijke op gebeurtenissen gebaseerde analyses worden doorgaans grote verschillen waargenomen in de oorsprong, amplitude, duur, locatie en stroomrichtingskenmerken van individuele Ca²⁺ -gebeurtenissen (Figuur 3B). Als we ons richten op het analyseren van de dynamiek van Ca²⁺ -activiteit in microgliale processen, is een classificatieschema van lokale gebeurtenissen, gebeurtenissen die naar de soma reizen en gebeurtenissen die van de soma reizen informatief (Figuur 3C).

Figuur 1: Experimentele opstelling voor in vivo microgliale Ca²⁺ beeldvorming. (A) Experimentele opstelling. Een Iba1-tTA × tetO-GCaMP6-muis met microglia-specifieke GCaMP6-expressie. Door een schedelvenster in de schedel van de muis in te voegen, kan microgliale Ca²⁺ -activiteit in vivo worden waargenomen met behulp van twee-fotonenmicroscopie. (B) Experimenteel schema en analyseprocedure. 4D-beelden worden gedurende ten minste 10 minuten verkregen als z-stacks met vijf frames. De frame-acquisitiesnelheid is 2,5 frames/s. Alvorens de microgliale Ca²⁺ -activiteit te analyseren, worden de z-stacks met vijf frames omgezet in 2D z-projecties door de gemiddelde (of maximale) intensiteit te nemen. De afspeelsnelheid van de z-projectie is 0,5 frames/s. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2: ROI-gebaseerde analyse voor microgliale Ca²⁺ activiteit. (A) Gemiddelde GCaMP6-intensiteitsprojectie over 10 minuten voor een individuele microglia. (B) Stabiele gebieden (wit) worden gedefinieerd door een overlay van binaire t-projecties met maximale GCaMP6-intensiteit, afgeleid van monsters van 2 minuten die zijn genomen aan het begin (magenta) en einde (groen) van een beeldvormingsperiode. (C) Stabiele gebieden worden verder gesegmenteerd in regionale ROI's. Individuele kleuren geven individuele ROI's aan. (D) ΔF/F-sporen van alle individuele ROI's in C. Let op de variatie in activiteitspatronen tussen ROI's. (E) Oorspronkelijk spoor van een ΔF/F-tijdreeks afgeleid van absolute intensiteitswaarden voor een enkele ROI. (F) Dezelfde ΔF/F-tijdreeks na laagdoorlaatfiltering. Kandidaat Ca²⁺ -gebeurtenissen worden gedetecteerd door een amplitude-afkapdrempel (rode lijn) gedefinieerd als basislijn + drie SD's. De basislijn (groene lijn) wordt gedefinieerd als de mediaanwaarde over de gehele ΔF/F-tijdreeks binnen een boven- en onderplafond dat de maximale en minimale 10% van de ΔF/F-waarden uitsluit. (G) Het hellingsspoor afgeleid van de gefilterde ΔF/F-tijdreeks in F. Echte Ca²⁺ -gebeurtenissen worden gesorteerd op basis van kandidaat Ca²⁺ -gebeurtenissen op basis van een drempelwaarde voor het afsnijden van de helling (rode lijn) die is gedefinieerd als basislijn + drie SD's. De basislijn (groene lijn) wordt gedefinieerd als de gemiddelde waarde over de gehele hellingstijdreeks binnen een boven- en onderplafond dat de maximale en minimale 10% van de hellingswaarden uitsluit. (H) Kandidaat Ca²⁺ -voorvallen geïdentificeerd aan de hand van amplitudecriteria in F worden aangegeven in oranje. Echte Ca²⁺ -evenementen gesorteerd op kandidaat Ca²⁺ -evenementen op hellingscriteria in G in rood. Merk op dat sommige kandidaat Ca²⁺ evenementen zijn samengevoegd op basis van de hellingscriteria. De corresponderende gefilterde ΔF/F-tijdreeks wordt hieronder ter referentie over elkaar heen gelegd. De zwarte lijn geeft een nulamplitude (ΔF/F) aan. Gemiddelde en maximale amplitude van echte Ca²⁺ -gebeurtenissen worden afgeleid als het gemiddelde en maximum van hun overeenkomstige pieken in de gefilterde ΔF/F-tijdreeks . Frequentie (gebeurtenissen/min) wordt afgeleid als het aantal echte Ca²⁺ -ontstekingsgebeurtenissen gedeeld door de beeldvormingsperiode (10 min). Schaalbalken = 20 μm (A,B), 10 μm (C). Afkorting: ROI = regio van interesse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Event-based analyse voor microgliale Ca²⁺ activiteit. (A) Representatieve beelden van gebeurtenissen die zijn gedetecteerd met behulp van het AQuA-algoritme. De kleuren geven individuele gebeurtenisgebieden aan die op een bepaald tijdstip zijn gedetecteerd. (B) Representatieve genormaliseerde Ca²⁺-activiteit (ΔF/F) in individuele gebeurtenissen, gesorteerd op volgorde van aanvang. De rechterbalk geeft de kleur aangegeven ΔF/F. (C) Representatieve activiteitsvoetafdrukken van gebeurtenissen die zich voortplanten naar en weg van de soma of lokale gebeurtenissen. Voor lokale evenementen wordt de evenementvorm in blauw weergegeven. Voor propagatieve gebeurtenissen wordt de begintijd van de gebeurtenis aangegeven door de blauw-gele schaal. Aangezien AQuA in eerste instantie Ca²⁺-gebeurtenissen afzonderlijk detecteert, worden propagatieve gebeurtenissen vervolgens geïdentificeerd op basis van de overlappende ruimtelijke locaties en tijdreeksen van meerdere individuele Ca²⁺-gebeurtenissen. Merk op dat dit dezelfde dendritische tak is die is gebruikt voor de ROI-analyse in figuur 2E-H. Schaalbalken = 20 μm (A), 10 μm (C). Afkorting: ROI = regio van interesse; S = soma. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Dit artikel introduceert een verbeterde benadering voor het in beeld brengen van microgliale Ca²⁺ activiteit met een hoge spatiotemporele resolutie. Deze methode is gevoelig genoeg om verschillende soorten microgliale Ca²⁺ -activiteit te detecteren op het niveau van enkelvoudige vertakte processen, waarbij gemakkelijk onderscheid kan worden gemaakt tussen lokale en propagatieve gebeurtenissen.

In de algemene methode voor in vivo beeldvorming met twee fotonen van microgliale Ca²⁺ -activiteit, moet zorgvuldig aandacht worden besteed aan de volgende punten om de beeldkwaliteit te maximaliseren. Ten eerste, aangezien microglia extreem gevoelig zijn voor letsel, is het belangrijk om tijdens de operatie het direct aanraken van het oppervlak van de hersenen met chirurgisch gereedschap tot een minimum te beperken. De belangrijkste aanwijzingen dat de operatie vakkundig is uitgevoerd, zijn intacte bloedvaten en dura en zeer minimale bloedingen tijdens de operatie. Ten tweede verminderen een veilige bevestiging van de hoofdplaat aan de schedel van de muis en een goed contact tussen het dubbele dekglaasje en het hersenoppervlak aanzienlijk bewegingsgerelateerde artefacten tijdens beeldvorming. Dit is vooral belangrijk bij beeldvorming met hoge spatiotemporele resoluties en bij volledig wakkere muizen. Hoewel de analysepijplijn op betrouwbare wijze compenseert voor bewegingsgerelateerde artefacten die voortkomen uit de hartslag, ademhaling en algemene drift, is deze minder robuust bij het omgaan met significante geometrische vervormingen die voortkomen uit plotselinge grote bewegingen.

De twee hier beschreven analysemethoden bieden verschillende voordelen en zijn geschikt voor verschillende onderzoeksvragen. Bij een ROI-analyse definieert de gebruiker vooraf de ROI (zoals individuele processen), waardoor de geaggregeerde dynamiek van Ca²⁺ -activiteit van deze ROI kan worden geëxtraheerd. Het is dus het meest geschikt voor situaties waarin fenomenen naar verwachting gelokaliseerd zijn in een subcellulair gebied dat zowel goed gedefinieerde morfologische grenzen heeft als een relatief groot gebied (d.w.z. een procestak). In event-based analyse worden individuele gebeurtenissen gedefinieerd op basis van de spatiotemporele dynamiek van de microgliale Ca²⁺ -activiteit zelf en moeten ze vervolgens worden geplaatst in de context van door de gebruiker gedefinieerde oriëntatiepunten binnen de microglia om hun functie te kunnen interpreteren. Het is dus het meest geschikt voor situaties waarin aannames over de lokalisatie van verschijnselen niet kunnen worden gemaakt of waar het interessegebied relatief klein is (d.w.z. een procestip). Als zodanig biedt event-based analyse een verbeterde spatiotemporele resolutie bij het karakteriseren van microgliale Ca²⁺ -activiteit in vergelijking met eerdere methoden.

Bij deze muizen is de enige fluorescerende marker die door microglia tot expressie wordt gebracht de Ca^2+-indicator GCaMP6. In regio's waar de Ca²⁺-activiteit laag is, moet de microgliale morfologie dus worden geëxtraheerd door meerdere tijdsbestekken te combineren, wat de temporele resolutie kan verslechteren. Deze beperking kan echter worden overwonnen door een afzonderlijk rood, stabiel fluorescerend eiwit tot expressie te brengen in microglia. Met name nieuwe adeno-geassocieerde virussen die in staat zijn om microglia te transfecteren, zijn onlangs beschreven 23,24,25.

Hoe de microgliale Ca²⁺ activiteit wordt veranderd door de omgeving is een opkomend onderwerp van belang. In het bijzonder lijkt microgliale Ca²⁺ -activiteit significante correlaties te vertonen met neuronale activiteit, hoewel de functionele betekenis hiervan nog grondig moet worden gekarakteriseerd. Het combineren van neuronale activiteitsmanipulatie met de hier gepresenteerde beeldvormings- en analysemethoden voor microgliale Ca²⁺ -activiteit zou dus nieuwe inzichten moeten opleveren in de microgliale fysiologie en ons begrip van de rol die microglia spelen in fysiologische en pathologische toestanden verder moeten vergroten.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
2% xylocaine jelly	AstraZeneca, UK
B6(129S6)-Tg(Aif1-tTA)54Kftnk	RIKEN RBC, Japan	RBRC05769	Iba1-tTA muizen
B6;129-Actb(tm3.1(tetO-GCaMP6)Kftnk)	RIKEN RBC, Japan	RBRC09552	tetO-GCaMP6 muizen
Forceps	Fine science tools, US	13008-12
G-CEM ONE	GC corporation, Japan
Glas capillair	Narishige, Japan	GDC-1
ImageJ	NIH, US
Isofluran	Pfizer, US
Ketamin	Daiichi-Sankyo, Japan
Kwik-sil	World Precision Instruments, US	KWIK-SIL
MATLAB, 2020a	MathWorks, US
Micro dekglas  (2 x 2 mm, Nr.3)	Matsunami, Japan	op maat	Onderglas voor craniale  venster
Micro dekglas  (3 x 3 mm, Nr.0)	Matsunami, Japan	op maat	Bovenglas voor craniumvenster
N25X-APO-MP	Nikon, Japan	N25X-APO-MP	Objectieflens (25x)
Norland optische lijm	Edmund optics, US	6101
Piezo nano-positioneringssysteem, Nano-Drive	Mao City Labs, US
Vedermesje	Feather, Japan	FA-10
Schaar	Fine science tools, US	14060-11
Staalboor	Minitor, Japan	BS1201
Stereotaxische instrumenten	Narishige, Japan	SR-5M-HT
Super-bond (C&B kit)	Sun Medical, Japan	4560227797382
Chirurgische naaldhaken	Fine science tools, US	10065-15
Ti:Sappire laser, MaiTai DeepSee	Spectra Physics, US	Mai Tai eHP DS
Pincet	Fine science tools, US	11051-10
Pincet	Fine science tools, US	11255-20
Twee-foton microscoop	Nikon, Japan	A1R-MP
UV-kunsthars	Kiyohara, Japan	UVR
Xylazin	Bayer, Duitsland