Tyramide signaalversterking tijdens immunofluorescente kleuring maakt de gevoelige detectie van gefosforyleerde RIPK3 en MLKL mogelijk tijdens ZBP1-geïnduceerde necroptose na HSV-1-infectie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Tyramide signaalversterking voor de immunofluorescente kleuring van ZBP1-afhankelijke fosforylering van RIPK3 en MLKL na HSV-1-infectie in menselijke cellen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De kinase Receptor-interacting serine/threonine protein kinase 3 (RIPK3) en zijn substraat mixed lineage kinase domain-like (MLKL) zijn kritische regulatoren van necroptose, een inflammatoire vorm van celdood met belangrijke antivirale functies. Autofosforylering van RIPK3 induceert fosforylering en activering van het porievormende beulseiwit van necroptosis MLKL. Handel en oligomerisatie van gefosforyleerde MLKL aan het celmembraan resulteert in cellyse, kenmerkend voor necroptotische celdood. De nucleïnezuursensor ZBP1 wordt geactiveerd door binding aan linkshandig Z-vormig dubbelstrengs RNA (Z-RNA) na infectie met RNA- en DNA-virussen. ZBP1-activering beperkt virusinfectie door gereguleerde celdood, inclusief necroptose, van geïnfecteerde gastheercellen te induceren. Immunofluorescentiemicroscopie maakt de visualisatie van verschillende signaalstappen stroomafwaarts van ZBP1-gemedieerde necroptose per cel mogelijk. De gevoeligheid van standaard fluorescentiemicroscopie, met behulp van de huidige in de handel verkrijgbare fosfo-specifieke antilichamen tegen humane RIPK3 en MLKL, sluit reproduceerbare beeldvorming van deze markers echter uit. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde kleuringsprocedure voor serine (S) gefosforyleerde RIPK3 (S227) en MLKL (S358) in menselijke HT-29-cellen die zijn geïnfecteerd met herpes simplex-virus 1 (HSV-1). De opname van een tyramide signaal amplificatie (TSA) stap in het immunofluorescente kleuring protocol maakt de specifieke detectie van S227 gefosforyleerde RIPK3 mogelijk. Bovendien verhoogt TSA de gevoeligheid van de detectie van S358 gefosforyleerde MLKL aanzienlijk. Samen maakt deze methode de visualisatie van deze twee kritieke signaleringsgebeurtenissen mogelijk tijdens de inductie van ZBP1-geïnduceerde necroptose.
Inleiding
Receptor-interagerende serine/threonine-eiwitkinase 3 (RIPK3) en mixed lineage kinase domain-like (MLKL) zijn centrale regulatoren van necroptotische celdood 1,2. Necroptose is een lytische en inflammatoire vorm van gereguleerde celdood die betrokken is bij antivirale immuniteit en auto-inflammatie. Necroptose van met virus geïnfecteerde cellen sluit onmiddellijk de virusreplicatie uit. Cellyse na necroptose-inductie geeft ook schadegerelateerde moleculaire patronen vrij, die antivirale immuniteit stimuleren 3,4. Necroptose wordt geïnitieerd door de ac....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Bereiding van gebiotinyleerd tyramide
- Bereid gebiotinyleerd tyramide vanaf biotine-tyramide. Om een 10 mM stockoplossing te maken, lost u 3,6 mg biotine-tyramide op in 1 ml DMSO. Bewaar het opgeloste product in aliquots bij −20 °C om de kwaliteit te behouden.
2. Behoud van HT-29 cellen in cultuur
OPMERKING: ZBP1-expresserende HT-29 werden gegenereerd door transductie met een lentivector27 die codeert voor menselijk ZBP1.
- Houd ZBP1-tot expressie brengende HT-29-cellen in McCoy's 5A-medium aangevuld met L-glutamine, natriumpyruva....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De immunofluorescentiedetectie van MLKL-fosforylering en vooral RIPK3-fosforylering in menselijke cellen is technisch uitdagend26. We presenteren hier een verbeterd kleuringsprotocol voor humane p-RIPK3 (S227) en p-MLKL (S358) bij de activering van ZBP1. Het protocol bevat een TSA-stap om de detectielimiet en gevoeligheid van de fluorescerende signalen te verbeteren. Om de methode te valideren, werd een zij-aan-zij vergelijking van de TSA-gemedieerde immunofluorescentie met standaard indirecte flu.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit immunofluorescente kleuringsprotocol beschrijft het gebruik van tyramide signaalversterking (TSA) om de gevoeligheid te verhogen voor signaleringsgebeurtenissen van de menselijke necroptotische signaleringsroute die moeilijk te detecteren zijn, waaronder de fosforylering van RIPK3 en MLKL26. De opname van een TSA-stap verbetert de detectiedrempel van p-RIPK3 (S227) en p-MLKL (S358) aanzienlijk en verhoogt de gevoeligheid van p-MLKL (S358) overbelasting. TSA onthulde een p-RIPK3 (S227) signaal .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We willen de VIB Bioimaging Core bedanken voor training, ondersteuning en toegang tot het instrumentenpark. J.N. wordt ondersteund door een doctoraatsbeurs van het Fonds Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO). Het onderzoek in de J.M.-groep werd ondersteund door een Odysseus II Grant (G0H8618N), EOS INFLADIS (40007512), een junior onderzoeksbeurs (G031022N) van het Fonds Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO), een CRIG young investigator proof-of-concept grant, en van de Universiteit Gent. Onderzoek in de P.V.-groep werd ondersteund door EOS MODEL-IDI (30826052), EOS INFLADIS (40007512), FWO senior research grants (G.0C76.18N, G.0B71.18N, G.0B96.20N, G.0A932....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Antilichamen | |||
| Anti-konijn HRP | Agilent Technologies Belgium | K4002 | Envision+ System-HRP Labelled Polymer anti-konijn |
| Geit anti-muis DyLight 633 | Thermofisher | 35513 | Secundaire antilichaam |
| HSV-1 ICP0 | Santa Cruz | sc-53070 | Muis anti-ICP0(HSV-1) antilichaam |
| IAV-PR8 muis serum | In house productie | xx | Muis anti-IAV-PR8 polycloonaal antilichaam |
| pMLKL | Abcam | ab187091 | Konijn anti-MLKL-fosfo S358 antilichaam |
| pRIPK3 | Abcam | ab209384 | Konijn anti-RIPK3-fosfo S227 antilichaam |
| Fluoroforen | |||
| DAPI | Thermofisher | D21490 | Om de celkern van de cellen te visualiseren |
| Streptavidine gekoppeld aan Alexa Fluor 568 | Thermofisher | S11226 | Om biotin-moleculen te visualiseren |
| Verbindingen | |||
| 30% H2O2 | Sigma | H1009 | Oxidatie substraat, noodzakelijk voor HRP-activiteit |
| 4% PFA | SANBIO | AR1068 | Om de cellen te fixeren/crosslinken |
| Biotinyl-tyramide | R&D Systems | 6241 | Om het signaal te versterken, HRP substraat |
| BV-6 | Selleckchem | S7597 | BV6 IAP Inhibitor |
| Voor celcultuur: om de cellen los te maken | |||
| 8,0 g/L NaCl | |||
| 0,4 g/L natriumdinatriumzout van EDTA | |||
| EDTA 0,04% | In house formulering | 1,1 g/L Na2HPO4 | |
| 0,2 g/L NaH2PO4 | |||
| 0,2 g/L KCl | |||
| 0,2 g/L Glucose | |||
| Fetaal bovien serum | TICO | FBS EU XXX | Voor celcultuur, het onderhouden van celcultuur; lotnummer: 90439 |
| GSK'840 | Aobious | AOB0917 | RIPK3 kinase remmer |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | Voor celcultuur, het onderhouden van celcultuur |
| MAXblock | Active Motif | 15252 | Blocking oplossing |
| PBS | Gibco | 10444402 | |
| Natriumpyruvaat | Sigma-Aldrich | S8636 | Voor celcultuur, het onderhouden van celcultuur |
| TNF-α | In house productie | - | Signaalmolecuul, in staat om celdood te activeren in combinatie met BV6 en zVAD |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-50ML | Om de cellen permeabel te maken |
| Trypan blauw | Merck | 11732 | Voor celtelling, gebruikt als levende/dode marker op 0,1% |
| Trypsine | Sigma-Aldrich | T4424 | Voor celcultuur: om de cellen los te maken |
| zVAD | Bachem | BACE4026865.0005 | Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketon |
| Materiaal | |||
| µ-Slide 8 well hoge glazen bodem | iBidi | 80807 | Om de cellen te kweken |
| Katoen Preping Balls-maat medium | Electron Microscopy Sciences | 71001-10 | Om de objectieven schoon te maken |
| Immersol 518 F / 30 °C | ZEISS | 444970-9000-000 | Om het monster bij hoge vergroting te visualiseren |
| Lensreiniger | ZEISS | 000000-0105-200 | Om de objectieven schoon te maken |
| LSM880 Fast Airyscan confocale microscoop | Om het monster te visualiseren | ||
| Software | |||
| Excel | Office | xx | Om de gegevens te verwerken |
| Prism 9 | Graphpad | xx | Om de gegevens te analyseren - statistische testen en graafgeneratie |
| Volocity 6.3 | Volocity | xx | Om kwantificeringen uit te voeren |
| Zen black | ZEISS | xx | Om beelden te verwerven en te verwerken |
| Zen blue | ZEISS | xx | Om beelden te visualiseren |
| Virussen | |||
| HSV-1 (mutRHIM) F-stam | geproduceerd door Dr. Jiahuai Han | in house replicatie | HSV-1 als trigger voor necroptose; RHIM kerndomein van UL39/ICP6 is gemutateerd (VQCG>AAAA) |
| HSV-1 (WT) F-stam | Geproduceerd door Dr. Jiahuai Han | in house replicatie | HSV-1 (WT) als negatieve controle voor necroptose-inductie (ICP6-remming) |
| IAV PR8 | in house stock | in house replicatie | IAV als trigger voor necroptose |
Referenties
- Meng, Y., Sandow, J. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The regulation of necroptosis by post-translational modifications. Cell Death & Differentiation. 28 (3), 861-883 (2021).
- Petrie, E. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The structural basis of necroptotic c....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
