Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Tyramide signaalversterking voor de immunofluorescente kleuring van ZBP1-afhankelijke fosforylering van RIPK3 en MLKL na HSV-1-infectie in menselijke cellen

2.6K weergaven

DOI:

10.3791/64332

20 oktober 2022

In dit artikel

Samenvatting

Tyramide signaalversterking tijdens immunofluorescente kleuring maakt de gevoelige detectie van gefosforyleerde RIPK3 en MLKL mogelijk tijdens ZBP1-geïnduceerde necroptose na HSV-1-infectie.

Samenvatting

De kinase Receptor-interacting serine/threonine protein kinase 3 (RIPK3) en zijn substraat mixed lineage kinase domain-like (MLKL) zijn kritische regulatoren van necroptose, een inflammatoire vorm van celdood met belangrijke antivirale functies. Autofosforylering van RIPK3 induceert fosforylering en activering van het porievormende beulseiwit van necroptosis MLKL. Handel en oligomerisatie van gefosforyleerde MLKL aan het celmembraan resulteert in cellyse, kenmerkend voor necroptotische celdood. De nucleïnezuursensor ZBP1 wordt geactiveerd door binding aan linkshandig Z-vormig dubbelstrengs RNA (Z-RNA) na infectie met RNA- en DNA-virussen. ZBP1-activering beperkt virusinfectie door gereguleerde celdood, inclusief necroptose, van geïnfecteerde gastheercellen te induceren. Immunofluorescentiemicroscopie maakt de visualisatie van verschillende signaalstappen stroomafwaarts van ZBP1-gemedieerde necroptose per cel mogelijk. De gevoeligheid van standaard fluorescentiemicroscopie, met behulp van de huidige in de handel verkrijgbare fosfo-specifieke antilichamen tegen humane RIPK3 en MLKL, sluit reproduceerbare beeldvorming van deze markers echter uit. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde kleuringsprocedure voor serine (S) gefosforyleerde RIPK3 (S227) en MLKL (S358) in menselijke HT-29-cellen die zijn geïnfecteerd met herpes simplex-virus 1 (HSV-1). De opname van een tyramide signaal amplificatie (TSA) stap in het immunofluorescente kleuring protocol maakt de specifieke detectie van S227 gefosforyleerde RIPK3 mogelijk. Bovendien verhoogt TSA de gevoeligheid van de detectie van S358 gefosforyleerde MLKL aanzienlijk. Samen maakt deze methode de visualisatie van deze twee kritieke signaleringsgebeurtenissen mogelijk tijdens de inductie van ZBP1-geïnduceerde necroptose.

Inleiding

Receptor-interagerende serine/threonine-eiwitkinase 3 (RIPK3) en mixed lineage kinase domain-like (MLKL) zijn centrale regulatoren van necroptotische celdood 1,2. Necroptose is een lytische en inflammatoire vorm van gereguleerde celdood die betrokken is bij antivirale immuniteit en auto-inflammatie. Necroptose van met virus geïnfecteerde cellen sluit onmiddellijk de virusreplicatie uit. Cellyse na necroptose-inductie geeft ook schadegerelateerde moleculaire patronen vrij, die antivirale immuniteit stimuleren 3,4. Necroptose wordt geïnitieerd door de ac....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Bereiding van gebiotinyleerd tyramide

  1. Bereid gebiotinyleerd tyramide vanaf biotine-tyramide. Om een 10 mM stockoplossing te maken, lost u 3,6 mg biotine-tyramide op in 1 ml DMSO. Bewaar het opgeloste product in aliquots bij −20 °C om de kwaliteit te behouden.

2. Behoud van HT-29 cellen in cultuur

OPMERKING: ZBP1-expresserende HT-29 werden gegenereerd door transductie met een lentivector27 die codeert voor menselijk ZBP1.

  1. Houd ZBP1-tot expressie brengende HT-29-cellen in McCoy's 5A-medium aangevuld met L-glutamine, natriumpyruva....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De immunofluorescentiedetectie van MLKL-fosforylering en vooral RIPK3-fosforylering in menselijke cellen is technisch uitdagend26. We presenteren hier een verbeterd kleuringsprotocol voor humane p-RIPK3 (S227) en p-MLKL (S358) bij de activering van ZBP1. Het protocol bevat een TSA-stap om de detectielimiet en gevoeligheid van de fluorescerende signalen te verbeteren. Om de methode te valideren, werd een zij-aan-zij vergelijking van de TSA-gemedieerde immunofluorescentie met standaard indirecte flu.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit immunofluorescente kleuringsprotocol beschrijft het gebruik van tyramide signaalversterking (TSA) om de gevoeligheid te verhogen voor signaleringsgebeurtenissen van de menselijke necroptotische signaleringsroute die moeilijk te detecteren zijn, waaronder de fosforylering van RIPK3 en MLKL26. De opname van een TSA-stap verbetert de detectiedrempel van p-RIPK3 (S227) en p-MLKL (S358) aanzienlijk en verhoogt de gevoeligheid van p-MLKL (S358) overbelasting. TSA onthulde een p-RIPK3 (S227) signaal .......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We willen de VIB Bioimaging Core bedanken voor training, ondersteuning en toegang tot het instrumentenpark. J.N. wordt ondersteund door een doctoraatsbeurs van het Fonds Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO). Het onderzoek in de J.M.-groep werd ondersteund door een Odysseus II Grant (G0H8618N), EOS INFLADIS (40007512), een junior onderzoeksbeurs (G031022N) van het Fonds Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO), een CRIG young investigator proof-of-concept grant, en van de Universiteit Gent. Onderzoek in de P.V.-groep werd ondersteund door EOS MODEL-IDI (30826052), EOS INFLADIS (40007512), FWO senior research grants (G.0C76.18N, G.0B71.18N, G.0B96.20N, G.0A932....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Antilichamen
Anti-konijn HRPAgilent Technologies BelgiumK4002Envision+ System-HRP Labelled Polymer anti-konijn
Geit anti-muis DyLight 633Thermofisher35513Secundaire antilichaam
HSV-1 ICP0Santa Cruzsc-53070Muis anti-ICP0(HSV-1) antilichaam
IAV-PR8 muis serumIn house productiexxMuis anti-IAV-PR8 polycloonaal antilichaam
pMLKLAbcamab187091Konijn anti-MLKL-fosfo S358 antilichaam
pRIPK3Abcamab209384Konijn anti-RIPK3-fosfo S227 antilichaam
Fluoroforen
DAPIThermofisherD21490Om de celkern van de cellen te visualiseren
Streptavidine gekoppeld aan Alexa Fluor 568ThermofisherS11226Om biotin-moleculen te visualiseren
Verbindingen
30% H2O2SigmaH1009Oxidatie substraat, noodzakelijk voor HRP-activiteit
4% PFASANBIOAR1068Om de cellen te fixeren/crosslinken
Biotinyl-tyramideR&D Systems6241Om het signaal te versterken, HRP substraat
BV-6SelleckchemS7597BV6 IAP Inhibitor
      Voor celcultuur: om de cellen los te maken
      8,0 g/L NaCl
      0,4 g/L natriumdinatriumzout van EDTA
EDTA 0,04%In house formulering1,1 g/L Na2HPO4
      0,2 g/L NaH2PO4
      0,2 g/L KCl
      0,2 g/L Glucose
Fetaal bovien serumTICOFBS EU XXXVoor celcultuur, het onderhouden van celcultuur; lotnummer: 90439
GSK'840AobiousAOB0917RIPK3 kinase remmer
L-GlutamineSigma-AldrichG7513Voor celcultuur, het onderhouden van celcultuur
MAXblockActive Motif15252Blocking oplossing
PBSGibco10444402
NatriumpyruvaatSigma-AldrichS8636Voor celcultuur, het onderhouden van celcultuur
TNF-αIn house productie-Signaalmolecuul, in staat om celdood te activeren in combinatie met BV6 en zVAD
Triton X-100Sigma AldrichT8787-50MLOm de cellen permeabel te maken
Trypan blauwMerck11732Voor celtelling, gebruikt als levende/dode marker op 0,1%
TrypsineSigma-AldrichT4424Voor celcultuur: om de cellen los te maken
zVADBachemBACE4026865.0005Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketon
Materiaal
µ-Slide 8 well hoge glazen bodemiBidi80807Om de cellen te kweken
Katoen Preping Balls-maat mediumElectron Microscopy Sciences71001-10Om de objectieven schoon te maken
Immersol 518 F / 30 °CZEISS444970-9000-000Om het monster bij hoge vergroting te visualiseren
LensreinigerZEISS000000-0105-200Om de objectieven schoon te maken
LSM880 Fast Airyscan confocale microscoopOm het monster te visualiseren
Software
ExcelOfficexxOm de gegevens te verwerken
Prism 9GraphpadxxOm de gegevens te analyseren - statistische testen en graafgeneratie
Volocity 6.3VolocityxxOm kwantificeringen uit te voeren
Zen blackZEISSxxOm beelden te verwerven en te verwerken
Zen blueZEISSxxOm beelden te visualiseren
Virussen
HSV-1 (mutRHIM) F-stamgeproduceerd door  Dr. Jiahuai Hanin house replicatieHSV-1 als trigger voor necroptose; RHIM kerndomein van UL39/ICP6 is gemutateerd (VQCG>AAAA)
HSV-1 (WT) F-stamGeproduceerd door Dr. Jiahuai Hanin house replicatieHSV-1 (WT) als negatieve controle voor necroptose-inductie (ICP6-remming)
IAV PR8in house stockin house replicatieIAV als trigger voor necroptose

Referenties

  1. Meng, Y., Sandow, J. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The regulation of necroptosis by post-translational modifications. Cell Death & Differentiation. 28 (3), 861-883 (2021).
  2. Petrie, E. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The structural basis of necroptotic c....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

ZBP1 afhankelijke necroptosegefosforyleerd RIPK3gefosforyleerd MLKLconfocale microscopienecroptose biomarkersceldoodpadenhumane HT 29 cellen