Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Tyramide signaalversterking voor de immunofluorescente kleuring van ZBP1-afhankelijke fosforylering van RIPK3 en MLKL na HSV-1-infectie in menselijke cellen

2.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64332

⸱

20 oktober 2022

 ,  ,  , 
1VIB-UGent Center for Inflammation Research, 2Department of Biomedical Molecular Biology, Ghent University

In dit artikel

Samenvatting

Tyramide signaalversterking tijdens immunofluorescente kleuring maakt de gevoelige detectie van gefosforyleerde RIPK3 en MLKL mogelijk tijdens ZBP1-geïnduceerde necroptose na HSV-1-infectie.

Samenvatting

De kinase Receptor-interacting serine/threonine protein kinase 3 (RIPK3) en zijn substraat mixed lineage kinase domain-like (MLKL) zijn kritische regulatoren van necroptose, een inflammatoire vorm van celdood met belangrijke antivirale functies. Autofosforylering van RIPK3 induceert fosforylering en activering van het porievormende beulseiwit van necroptosis MLKL. Handel en oligomerisatie van gefosforyleerde MLKL aan het celmembraan resulteert in cellyse, kenmerkend voor necroptotische celdood. De nucleïnezuursensor ZBP1 wordt geactiveerd door binding aan linkshandig Z-vormig dubbelstrengs RNA (Z-RNA) na infectie met RNA- en DNA-virussen. ZBP1-activering beperkt virusinfectie door gereguleerde celdood, inclusief necroptose, van geïnfecteerde gastheercellen te induceren. Immunofluorescentiemicroscopie maakt de visualisatie van verschillende signaalstappen stroomafwaarts van ZBP1-gemedieerde necroptose per cel mogelijk. De gevoeligheid van standaard fluorescentiemicroscopie, met behulp van de huidige in de handel verkrijgbare fosfo-specifieke antilichamen tegen humane RIPK3 en MLKL, sluit reproduceerbare beeldvorming van deze markers echter uit. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde kleuringsprocedure voor serine (S) gefosforyleerde RIPK3 (S227) en MLKL (S358) in menselijke HT-29-cellen die zijn geïnfecteerd met herpes simplex-virus 1 (HSV-1). De opname van een tyramide signaal amplificatie (TSA) stap in het immunofluorescente kleuring protocol maakt de specifieke detectie van S227 gefosforyleerde RIPK3 mogelijk. Bovendien verhoogt TSA de gevoeligheid van de detectie van S358 gefosforyleerde MLKL aanzienlijk. Samen maakt deze methode de visualisatie van deze twee kritieke signaleringsgebeurtenissen mogelijk tijdens de inductie van ZBP1-geïnduceerde necroptose.

Inleiding

Receptor-interagerende serine/threonine-eiwitkinase 3 (RIPK3) en mixed lineage kinase domain-like (MLKL) zijn centrale regulatoren van necroptotische celdood 1,2. Necroptose is een lytische en inflammatoire vorm van gereguleerde celdood die betrokken is bij antivirale immuniteit en auto-inflammatie. Necroptose van met virus geïnfecteerde cellen sluit onmiddellijk de virusreplicatie uit. Cellyse na necroptose-inductie geeft ook schadegerelateerde moleculaire patronen vrij, die antivirale immuniteit stimuleren 3,4. Necroptose wordt geïnitieerd door de activering van RIPK3 na RIP homotypische interactie motief (RHIM)-gemedieerde interacties met een van de drie upstream activerende moleculen: RIPK1 (bij TNF receptor 1 [TNFR1] engagement), TIR-domein-bevattende adapter-inducerende interferon-β (TRIF; op Toll-like receptor 3 en 4 engagement), of de antivirale nucleïnezuursensor Z-DNA binding protein 1 (ZBP1)1,2 . Necroptose signalering verloopt door een reeks fosforylering gebeurtenissen beginnend met de autofosforylering van RIPK3. De autofosforylering van humaan RIPK3 bij serine (S)227 binnen zijn kinasedomein is een voorwaarde voor necroptose door de interactie met MLKL mogelijk te maken en wordt vaak gebruikt als biochemische marker voor humane RIPK3-activering en necroptotische celdood 1,5. Eenmaal geactiveerd, fosforyleert RIPK3 de activeringslus van MLKL bij threonine (T) 357 en S3581. Dit veroorzaakt een verandering in MLKL-conformatie, wat resulteert in blootstelling van het N-terminal vier helixbundeldomein. MLKL oligomeriseert vervolgens en verkeert naar het celmembraan waar het een porie vormt door het inbrengen van de blootgestelde vier helixbundels in de lipide bilayer, wat uiteindelijk leidt tot celdood 2,6.

ZBP1 is een antivirale nucleïnezuursensor die linkshandige Z-vorm nucleïnezuren herkent, waaronder dubbelstrengs RNA in de Z-conformatie (Z-RNA). Z-RNA-binding vindt plaats via twee Zα-domeinen die zich op het N-eindpunt van ZBP1 bevinden. Van Z-RNA dat zich ophoopt tijdens RNA- en DNA-virusinfectie wordt verondersteld ZBP1 7,8 direct te betrekken. Geactiveerd zbp1 rekruteert RIPK3 via zijn centrale RHIMs en induceert gereguleerde celdood, waaronder necroptose 9,10. Virussen hebben tal van ontsnappingsmechanismen aangenomen om ZBP1-geïnduceerde gastheercelnederroptose tegen te gaan11. Bijvoorbeeld, het herpes simplex virus 1 (HSV-1) ribonucleotide reductase subunit 1, bekend als ICP6 en gecodeerd door UL39, herbergt RHIM op zijn N-terminus dat interfereert met ZBP1-gemedieerde RIPK3-activering in menselijke cellen 12,13,14,15. ZBP1 beperkt niet alleen virale replicatie, maar muisstudies hebben aangetoond dat ZBP1-activering ontstekingsziekten veroorzaakt en kankerimmuniteit stimuleert 16,17,18,19,20,21. Protocollen die signaleringsgebeurtenissen detecteren die optreden tijdens ZBP1-geïnduceerde necroptose in menselijke cellen zijn daarom waardevol om de rol van ZBP1 in deze processen te beoordelen.

Tyramide signaalversterking (TSA), ook wel katalyseerde reporter depositie (CARD) genoemd, is ontwikkeld om de detectiegrens en signaal-ruisverhouding in op antilichamen gebaseerde immunoassays te verbeteren. Tijdens TSA kan elk primair antilichaam worden gebruikt om het antigeen van belang te detecteren. Mierikswortelperoxidase (HRP), gekoppeld aan een secundair antilichaam, katalyseert de lokale opbouw van gebiotinyleerde tyramideradicalen in aanwezigheid van waterstofperoxide. Deze geactiveerde biotine-tyramideradicalen reageren vervolgens met proximale tyrosineresiduen om covalente bindingen te vormen. Potentiële tyramide-biotinesubstraten omvatten het antigeen zelf, de primaire en secundaire antilichamen en naburige eiwitten. Dus, terwijl TSA de gevoeligheid van de test aanzienlijk verbetert, gaat een deel van de ruimtelijke resolutie verloren. In een laatste stap worden biotinemoleculen gedetecteerd met behulp van fluorescerend gelabeld streptavidin. De HRP-reactie zet veel tyramide-biotinemoleculen af op of in de buurt van het antigeen van belang. Dit verhoogt het aantal streptavidin-fluorochrome bindingsplaatsen aanzienlijk, waardoor de gevoeligheid van de test aanzienlijk wordt versterkt (figuur 1). Als alternatief kan tyramide direct worden gekoppeld aan een fluorochroom, waardoor de noodzaak voor streptavidin-gekoppelde fluoroforen wordt geëlimineerd. Eiwitimmunohistochemie en DNA/RNA in situ hybridisatie behoorden tot de eerste methoden waarbij TSA werd gebruikt om de signaalintensiteiten te verbeteren22,23. Meer recent is TSA gecombineerd met intracellulaire flowcytometrie24 en massaspectrometrie25.

Hier presenteren we een protocol om serine 227 gefosforyleerde humane RIPK3 (p-RIPK3 [S227]) en gefosforyleerde humane MLKL (p-MLKL [S358]) te detecteren bij de activering van ZBP1 door HSV-1-infectie met behulp van immunofluorescentiemicroscopie. We gebruiken een necroptose-gevoelige HT-29 menselijke colorectale adenocarcinoom cellijn die werd getransduceerd om stabiel menselijk ZBP1 tot expressie te brengen. Deze cellen werden geïnfecteerd met een HSV-1-stam die een mutant ICP6-eiwit (HSV-1 ICP6mutRHIM) tot expressie bracht waarin vier kernaminozuren binnen het virale RHIM (VQCG) werden vervangen door alanines (AAAA), waardoor de ICP6 niet in staat was om ZBP1-gemedieerde necroptose te blokkeren 13,14,15. Om het probleem van de lage signaal-ruisverhouding van de momenteel in de handel verkrijgbare antilichamen gericht tegen p-RIPK3 en p-MLKL in immunostaining26 te overwinnen, voeren we een tyramide signaalversterking (TSA) stap uit (Figuur 1), die resulteert in de robuuste detectie van humane p-RIPK3 (S227) en de detectiegevoeligheid van menselijke p-MLKL (S358) met een orde van grootte verbetert.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Bereiding van gebiotinyleerd tyramide

  1. Bereid gebiotinyleerd tyramide vanaf biotine-tyramide. Om een 10 mM stockoplossing te maken, lost u 3,6 mg biotine-tyramide op in 1 ml DMSO. Bewaar het opgeloste product in aliquots bij −20 °C om de kwaliteit te behouden.

2. Behoud van HT-29 cellen in cultuur

OPMERKING: ZBP1-expresserende HT-29 werden gegenereerd door transductie met een lentivector27 die codeert voor menselijk ZBP1.

  1. Houd ZBP1-tot expressie brengende HT-29-cellen in McCoy's 5A-medium aangevuld met L-glutamine, natriumpyruvaat en 10% foetaal runderserum (vanaf nu aangeduid als volledig medium) en onderhoud in een incubator op 37 °C met 5% koolstofdioxide. Gebruik idealiter cellen met een laag passagegetal (minder dan 10). Laat de cellen ten minste 5 dagen na de dooicyclus herstellen voordat het experiment begint.
  2. Om de cellen los te maken van de kweekkolf, verwijdert u het medium en wast u de cellen met 5 ml PBS (voorverwarmd tot 37 °C). Voeg vervolgens de juiste hoeveelheid trypsine/EDTA (respectievelijk 0,05% trypsine en 0,032% EDTA, voorverwarmd tot 37 °C) toe aan de cellen (2 ml voor een T75-kolf, 3 ml voor een T175-kolf).
  3. Incubeer de cellen met trypsine/EDTA gedurende maximaal 10 minuten in een incubator bij 37 °C met 5% koolstofdioxide. Tik daarna op de kolf en controleer visueel of de cellen loskomen van de kolf met behulp van een microscoop met 4x-20x objectiefvergroting.
  4. Als de cellen niet volledig losstaan, incubeer dan nog eens 5 minuten bij 37 °C. Wanneer de cellen zijn losgemaakt, stopt u de enzymatische reactie door 6 ml vol medium aan de kolf toe te voegen.
  5. Verzamel de celsuspensie in een buis van 15 ml. Tel de cellen met behulp van een trypan blauwe vlek om de levensvatbaarheid te beoordelen; een verdunning van 1:5 wordt aanbevolen. Ga alleen verder met het experiment als de levensvatbaarheid van de cellen groter is dan 90%.

3. Het experiment starten, zaaien en stimuleren van de cellen

  1. Zaai 90.000 ZBP1-tot expressie brengende HT-29-cellen in volledig medium in een putplaat met een oppervlakteoppervlak van 1 cm² die high-end microscopie mogelijk maakt. Gebruik een eindvolume van 200 μL per putje.
  2. Incubeer de cellen een nacht bij 37 °C met 5% koolstofdioxide. Houd er rekening mee dat er enkele extra putten moeten worden gezaaid voor kleuringscontroles, wat in stap 5.6 in meer detail wordt uitgelegd.
  3. Wanneer de cellen 70% -80% samenvloeiing bereiken, voegt u een necroptose-inducerende stimulus toe aan de cellen. Hier werden de cellen geïnfecteerd met HSV-1 ICP6mutRHIM (multiplicity of infection [MOI] van 5, gedefinieerd als plaquevormende eenheden (pfu) gedeeld door het aantal cellen; de pfu werd gekwantificeerd met behulp van een plaquetest op Vero-cellen) gedurende 6 h, 8 h of 10 h.
  4. Als een positieve controle voor necroptose-inductie, stimuleer de cellen gedurende 4 uur met een necroptose-inducerende cocktail met 30 ng / ml TNF, 20 μM van de pan-caspaseremmer zVAD-fmk en 5 μM van de SMAC mimetische BV6.
  5. Als negatieve controle voor p-RIPK3 (S227) kleuring, neem GSK'840 (1 μM) op om RIPK3 kinase activiteit te remmen en de autofosforylering van S227 te voorkomen. Idealiter, voeg de remmer toe in een onbehandelde toestand en na necroptose stimulatie. De remmer kan gelijktijdig met een virale infectie worden toegevoegd.
  6. Bereid de stimulaties in volledig medium, voorverwarmd tot 37 °C. Gebruik een eindvolume van 200 μL per putje voor alle stimulaties.

4. De cellen bevestigen

  1. Verwijder het medium en was de cellen met 200 μL 1x PBS. Voeg vervolgens 150 μL van 4% PFA (al in evenwicht bij kamertemperatuur) toe aan de cellen en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
    OPMERKING: Als u cellen gebruikt die gemakkelijk kunnen worden losgemaakt, kan de fixatie van de cellen als volgt worden geoptimaliseerd. Verwijder 100 μL medium uit de put, zodat een volume van 100 μL op de plaat blijft. Voeg 100 μL 4% PFA toe aan de cellen. Incubeer de cellen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder daarna het medium/fixatief uit de putjes en vervang het door 150 μL van 4% PFA. Incubeer de cellen nog eens 20 minuten bij kamertemperatuur om volledige fixatie van de cellen te garanderen.
  2. Verwijder na fixatie de 4% PFA en was de cellen 3x met 200 μL 1x PBS. De monsters kunnen worden bewaard in een overmaat (>200 μL) van 1x PBS bij 4 °C 's nachts tot verdere verwerking.

5. Permeabilisatie en primaire kleuring

  1. Verwijder de PBS en voeg 100 μL permeabilisatiebuffer toe (0,5% Triton X-100 in PBS). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
  2. Verwijder de permeabilisatiebuffer en was vervolgens de putjes met 100 μL wasbuffer (0,1% Triton X-100 in PBS). Incubeer de beeldkamer met wasbuffer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur op een kantelbare laboratoriumschudder (20-30 schommelbewegingen per minuut).
  3. Om niet-specifieke binding van primaire antilichamen te voorkomen, voegt u 100 μL blokkerend medium toe en incubeert u bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. Als alternatief kan deze blokkerende stap worden vervangen door blokkering met 3% BSA, 0,1% Triton-X-100 in PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  4. Was de putjes 3x met 100 μL wasbuffer (0,1% Triton X-100 in PBS). Incubeer de wastreden gedurende 5 minuten op kamertemperatuur op een kantelbare laboratoriumschudder.
  5. Voeg na het verwijderen van de wasbuffer de primaire antilichamen toe aan de beeldvormende kamer en incubeer een nacht bij 4 °C. Gebruik een eindvolume van 100 μL om de put te bedekken. Plaats tijdens de nachtelijke incubatie bij 4°C de beeldkamer niet op een kantelbare laboratoriumschudder.
    OPMERKING: Anti p-MLKL (S358; verdunning: 1:200) en anti-p-RIPK3 (S227; verdunning: 1:200) delen konijn als gastheersoort en mogen daarom niet in één put worden gecombineerd. Om de virale infectie te controleren, combineert u een primair antilichaam tegen een viraal eiwit naar keuze met p-MLKL (S358) of p-RIPK3 (S227). Hier werden de cellen geïnfecteerd met HSV-1-infectie gevolgd door ICP0-kleuring (verdunning: 1:50, gastheersoort: muis).
  6. Houd op dit moment rekening met de nodige kleuringscontroles. Neem altijd een no primary antibody condition op om de mogelijke achtergrond van de TSA-versterkingsstap te visualiseren om de maskeringsdrempel in te stellen (zie stap 9).
    OPMERKING: In het geval van een co-kleuringsprotocol (bijvoorbeeld het combineren van p-MLKL [S358] of p-RIPK3 [S227] met een antilichaam tegen een viraal eiwit) gebruik ook enkele vlekken. Het gebruik van enkele vlekken is belangrijk om te corrigeren voor mogelijk doorbloedingssignaal in andere beeldkanalen.

6. Tyramide signaalversterking (TSA)

  1. Verwijder het primaire antilichaammengsel en was putjes 3x met 100 μL wasbuffer (0,1% Triton X-100 in PBS). Incubeer de wastreden gedurende 5 minuten op kamertemperatuur op een kantelbare laboratoriumschudder.
  2. Verwijder de wasbuffer en voeg 100 μL HRP-gelabeld secundair antilichaam toe dat de soort primair antilichaam herkent dat moet worden versterkt. Om het p-RIPK3 (S227) of p-MLKL (S358) signaal te versterken, voegt u 100 μL anti-konijn-HRP toe en incubeert u gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op een kantelbare laboratoriumschudder.
    OPMERKING: Alleen p-MLKL (S358) of p-RIPK3 (S227) wordt versterkt. De kleuring van een viraal eiwit wordt gevisualiseerd met behulp van een standaard indirecte kleuringsmethode.
  3. Was daarna de putjes 3x met 100 μL wasbuffer (0,1% Triton X-100 in PBS). Incubeer de wastreden gedurende 5 minuten op kamertemperatuur op een kantelbare laboratoriumschudder.
  4. Voeg in de volgende stappen de gebiotinyleerde tyramide toe aan de microscopische plaat. Met behulp van de HRP-groep gekoppeld aan de secundaire antilichamen, zal de enzymatische reactie de vorming van tyramideradicalen in de nabijheid van het primaire doelwit veroorzaken (hier p-MLKL [S358] of p-RIPK3 [S227]).
  5. Om de enzymatische activiteit van HRP te activeren, voegt u een oxiderend substraat toe samen met het gebiotinyleerde tyramide. Vul hiervoor de TSA-buffer (0,1 M boorzuur [pH 8,5]) aan met 0,03 M H2O2; neem specifiek 5 ml TSA-buffer en voeg 5 μL 30% H2O2 toe.
  6. Verdun nu de biotine-tyramide in H2O2-aangevulde TSA-buffer variërend van 1: 1.000 tot 1: 20.000.
    OPMERKING: De verdunningsfactor van de biotine-tyramide moet per batch worden geoptimaliseerd.
  7. Verwijder de wasbuffer uit de putjes en voeg verdund biotine-tyramide toe aan de putjes tot een eindvolume van 100 μL. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten op een kantelbare laboratoriumschudder.
  8. Was vervolgens de putjes 3x met 100 μL wasbuffer (0,1% Triton X-100 in PBS). Incubeer de wastreden gedurende 5 minuten op kamertemperatuur op een kantelbare laboratoriumschudder.

7. Fluoroforen

OPMERKING: Aangezien het signaal van het primaire antilichaam wordt omgezet in een biotinegroep, worden p-MLKL (S358) en p-RIPK3 (S227) gevisualiseerd met behulp van streptavidin gekoppeld aan een fluorofoor (fluorofoor 568, verdunning: 1:500). Bovendien zijn de kernen gekleurd met DAPI (5 μg /ml). Als een viraal eiwit is opgenomen in het kleuringsprotocol, neem dan een geschikt fluorescerend gelabeld secundair antilichaam op tegen de gastheersoort van uw primaire antilichaam. In de representatieve resultaten werd een muis anti-ICP0 gebruikt. Als secundair antilichaam werd geiten antimuis gekoppeld aan fluorofoor 633 (verdunning: 1:1.000) opgenomen.

  1. Maak het kleuringsmengsel in wasbuffer (0,1% Triton X-100 in PBS) met de hierboven genoemde antilichamen en vlekken. Verwijder de wasbuffer, voeg 100 μL kleuringsmengsel toe en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur op een kantelbare laboratoriumschudder. Houd de beeldkamer vanaf deze stap afgeschermd van licht.
  2. Was vervolgens de putjes 2x met wasbuffer (0,1% Triton X-100 in PBS). Incubeer de wastreden gedurende 5 minuten op kamertemperatuur op een kantelbare laboratoriumschudder.
  3. Spoel tot slot de putjes 2x af met 1x PBS. Bewaar de monsters in een overmaat (> 200 μL) van 1x PBS tot beeldvorming. U kunt de monsters ook onderdompelen in een montagemedium om de kleuring te behouden. De beeldkamer is nu klaar om te worden gevisualiseerd op een confocale microscoop.

8. Beeldvorming met behulp van een confocale microscoop

  1. Schakel de confocale microscoop en lasers ten minste 10 minuten voordat u de afbeelding maakt.
  2. Gebruik een onderdompelingsdoel voor gevoeligheid. Gebruik bij voorkeur 40x of 63x objectiefvergroting. Reinig voordat u gaat fotograferen de onderdompelingsdoelstellingen met lensreiniger met behulp van geschikte wattenbollen. Vuile doelstellingen (bijvoorbeeld als gevolg van stof) kunnen leiden tot afbeeldingen van lagere kwaliteit.
  3. Plaats een overtollige hoeveelheid olie op de bodem van de beeldkamer. Voeg bovendien een druppel olie toe aan het doel van keuze.
  4. Leg de beeldkamer op de microscoop. Zoek het focusveld met behulp van DAPI-kleuring of met behulp van brightfield-beeldvorming. Beweeg indien nodig rond de beeldkamer om een goede verspreiding van de dompelolie te garanderen.
  5. Stel de benodigde beeldsporen in op de microscoop. Afhankelijk van de microscoop kunnen de volgende stappen variëren (tabel 1).
    OPMERKING: Programmeer bij het instellen van de beeldsporen de sporen zodat de nucleaire kleuring als laatste wordt gemeten. De 405 nm laser kan bijdragen aan fotobleaching en daarmee het verlies van specifiek signaal in alle kanalen.
  6. Als u een volledige cel wilt analyseren op de aanwezigheid van p-RIPK3 (S227) of p-MLKL (S358), meet u z-stacks die de hoogte van de cel overspannen. Hier werden de z-stacks gemaakt van 40 plakjes om de 0,16 μm, wat resulteerde in een bereik van 6,22 μm.

SpoorLaserBundelsplitserFilter
pRIPK3 (S227) / pMLKL (S358)561MBS -405 +BP 570-620 + LP645
MBS 488/561/633 + SBS SP615
Viraal gen: ICP0633MBS -405 +BP 420-480 + LP605
MBS 488/561/633 + SBS LP570
Kern: DAPI405MBS -405 +BP 420-480 + BP 495-550
MBS 488/561/633

Tabel 1: Beeldvormingssporen voor celvisualisatie.

9. Data-analyse en kwantificering

  1. Upload de microscopische afbeeldingen naar de software. Gebruik de uitgebreide focus om alle informatie van de z-stack in een 2D-afbeelding te visualiseren.
  2. Programmeer vervolgens het analyseprotocol om de volgende informatie te extraheren: het aantal cellen per afbeelding, de som van voxels met p-RIPK3 (S227)+ of p-MLKL (S358)+ kleuring. Een voxel vertegenwoordigt een driedimensionaal volume, gedefinieerd als het driedimensionale equivalent van een pixel.
  3. Als u het aantal cellen per afbeelding wilt kwantificeren, segmenteert u de kern. Om ruis in de segmentatieresultaten te verminderen, voegt u een groottebeperking toe aan de segmentatie (>100 μm³). Het aantal gesegmenteerde kernen staat voor het aantal cellen in de afbeelding.
  4. Om de hoeveelheid p-RIPK3 (S227)+ of p-MLKL (S358)+ voxels te kwantificeren, programmeert u een op drempels gebaseerde segmentatie. Stel de drempel zo in dat er geen signaal wordt opgepikt in de no primary antibody (NP) beelden.
  5. Pas de drempel verder aan met behulp van de afbeeldingen van de onbehandelde mock-conditie. Om gevoelige detectie van de signaaltoename als gevolg van necroptosestimulatie te garanderen, beperkt u de opname van p-RIPK3 (S227)+ of p-MLKL (S358)+ voxels in schijnomstandigheden door een hogere drempel in te stellen. Controleer altijd het geprogrammeerde analyseprotocol in verschillende afbeeldingen van de nepconditie en necroptose-inducerende virale infectie.
  6. Voer de analyse uit op alle afbeeldingensets. Exporteer de voxelkwantificering en kernsegmentatie in een .txt bestand voor verdere verwerking in spreadsheetsoftware.
  7. Maak een draaitabel van de gegevens met de afbeeldingsnaam, de kernkwantificering en de som van gedetecteerde voxels.
  8. Deel vervolgens de som van positieve voxels door het aantal cellen in de afbeelding. Dit resulteert in een relatieve waarde van positieve voxels per cel. Om de vouwtoename te visualiseren, deelt u de relatieve waarde van p-RIPK3 (S227)+ of p-MLKL (S358)+ voxels per cel door de mediaan van de onbehandelde toestand (mock).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De immunofluorescentiedetectie van MLKL-fosforylering en vooral RIPK3-fosforylering in menselijke cellen is technisch uitdagend26. We presenteren hier een verbeterd kleuringsprotocol voor humane p-RIPK3 (S227) en p-MLKL (S358) bij de activering van ZBP1. Het protocol bevat een TSA-stap om de detectielimiet en gevoeligheid van de fluorescerende signalen te verbeteren. Om de methode te valideren, werd een zij-aan-zij vergelijking van de TSA-gemedieerde immunofluorescentie met standaard indirecte flu...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit immunofluorescente kleuringsprotocol beschrijft het gebruik van tyramide signaalversterking (TSA) om de gevoeligheid te verhogen voor signaleringsgebeurtenissen van de menselijke necroptotische signaleringsroute die moeilijk te detecteren zijn, waaronder de fosforylering van RIPK3 en MLKL26. De opname van een TSA-stap verbetert de detectiedrempel van p-RIPK3 (S227) en p-MLKL (S358) aanzienlijk en verhoogt de gevoeligheid van p-MLKL (S358) overbelasting. TSA onthulde een p-RIPK3 (S227) signaal ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We willen de VIB Bioimaging Core bedanken voor training, ondersteuning en toegang tot het instrumentenpark. J.N. wordt ondersteund door een doctoraatsbeurs van het Fonds Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO). Het onderzoek in de J.M.-groep werd ondersteund door een Odysseus II Grant (G0H8618N), EOS INFLADIS (40007512), een junior onderzoeksbeurs (G031022N) van het Fonds Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO), een CRIG young investigator proof-of-concept grant, en van de Universiteit Gent. Onderzoek in de P.V.-groep werd ondersteund door EOS MODEL-IDI (30826052), EOS INFLADIS (40007512), FWO senior research grants (G.0C76.18N, G.0B71.18N, G.0B96.20N, G.0A9322N), Methusalem (BOF16/MET_V/007), iBOF20/IBF/039 ATLANTIS, Foundation against Cancer (F/2016/865, F/2020/1505), CRIG en GIGG consortia en VIB.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Antilichamen
Anti-konijn HRPAgilent Technologies BelgiumK4002Envision+ System-HRP Labelled Polymer anti-konijn
Geit anti-muis DyLight 633Thermofisher35513Secundaire antilichaam
HSV-1 ICP0Santa Cruzsc-53070Muis anti-ICP0(HSV-1) antilichaam
IAV-PR8 muis serumIn house productiexxMuis anti-IAV-PR8 polycloonaal antilichaam
pMLKLAbcamab187091Konijn anti-MLKL-fosfo S358 antilichaam
pRIPK3Abcamab209384Konijn anti-RIPK3-fosfo S227 antilichaam
Fluoroforen
DAPIThermofisherD21490Om de celkern van de cellen te visualiseren
Streptavidine gekoppeld aan Alexa Fluor 568ThermofisherS11226Om biotin-moleculen te visualiseren
Verbindingen
30% H2O2SigmaH1009Oxidatie substraat, noodzakelijk voor HRP-activiteit
4% PFASANBIOAR1068Om de cellen te fixeren/crosslinken
Biotinyl-tyramideR&D Systems6241Om het signaal te versterken, HRP substraat
BV-6SelleckchemS7597BV6 IAP Inhibitor
      Voor celcultuur: om de cellen los te maken
      8,0 g/L NaCl
      0,4 g/L natriumdinatriumzout van EDTA
EDTA 0,04%In house formulering1,1 g/L Na2HPO4
      0,2 g/L NaH2PO4
      0,2 g/L KCl
      0,2 g/L Glucose
Fetaal bovien serumTICOFBS EU XXXVoor celcultuur, het onderhouden van celcultuur; lotnummer: 90439
GSK'840AobiousAOB0917RIPK3 kinase remmer
L-GlutamineSigma-AldrichG7513Voor celcultuur, het onderhouden van celcultuur
MAXblockActive Motif15252Blocking oplossing
PBSGibco10444402
NatriumpyruvaatSigma-AldrichS8636Voor celcultuur, het onderhouden van celcultuur
TNF-αIn house productie-Signaalmolecuul, in staat om celdood te activeren in combinatie met BV6 en zVAD
Triton X-100Sigma AldrichT8787-50MLOm de cellen permeabel te maken
Trypan blauwMerck11732Voor celtelling, gebruikt als levende/dode marker op 0,1%
TrypsineSigma-AldrichT4424Voor celcultuur: om de cellen los te maken
zVADBachemBACE4026865.0005Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketon
Materiaal
µ-Slide 8 well hoge glazen bodemiBidi80807Om de cellen te kweken
Katoen Preping Balls-maat mediumElectron Microscopy Sciences71001-10Om de objectieven schoon te maken
Immersol 518 F / 30 °CZEISS444970-9000-000Om het monster bij hoge vergroting te visualiseren
LensreinigerZEISS000000-0105-200Om de objectieven schoon te maken
LSM880 Fast Airyscan confocale microscoopOm het monster te visualiseren
Software
ExcelOfficexxOm de gegevens te verwerken
Prism 9GraphpadxxOm de gegevens te analyseren - statistische testen en graafgeneratie
Volocity 6.3VolocityxxOm kwantificeringen uit te voeren
Zen blackZEISSxxOm beelden te verwerven en te verwerken
Zen blueZEISSxxOm beelden te visualiseren
Virussen
HSV-1 (mutRHIM) F-stamgeproduceerd door  Dr. Jiahuai Hanin house replicatieHSV-1 als trigger voor necroptose; RHIM kerndomein van UL39/ICP6 is gemutateerd (VQCG>AAAA)
HSV-1 (WT) F-stamGeproduceerd door Dr. Jiahuai Hanin house replicatieHSV-1 (WT) als negatieve controle voor necroptose-inductie (ICP6-remming)
IAV PR8in house stockin house replicatieIAV als trigger voor necroptose

Referenties

  1. Meng, Y., Sandow, J. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The regulation of necroptosis by post-translational modifications. Cell Death & Differentiation. 28 (3), 861-883 (2021).
  2. Petrie, E. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The structural basis of necroptotic cell death signaling. Trends in Biochemical Sciences. 44 (1), 53-63 (2019).
  3. Mocarski, E. S., Guo, H., Kaiser, W. J. Necroptosis: The Trojan horse in cell autonomous antiviral host defense. Virology. 479-480, 160-166 (2015).
  4. Nailwal, H., Chan, F. K. Necroptosis in anti-viral inflammation. Cell Death & Differentiation. 26 (1), 4-13 (2019).
  5. Meng, Y., et al. Human RIPK3 maintains MLKL in an inactive conformation prior to cell death by necroptosis. Nature Communications. 12 (1), 6783(2021).
  6. Samson, A. L., Garnish, S. E., Hildebrand, J. M., Murphy, J. M. Location, location, location: A compartmentalized view of TNF-induced necroptotic signaling. Science Signalling. 14 (668), (2021).
  7. Koehler, H., et al. Vaccinia virus E3 prevents sensing of Z-RNA to block ZBP1-dependent necroptosis. Cell Host Microbe. 29 (8), 1266-1276 (2021).
  8. Balachandran, S., Mocarski, E. S. Viral Z-RNA triggers ZBP1-dependent cell death. Current Opinion in Virology. 51, 134-140 (2021).
  9. Kuriakose, T., Kanneganti, T. D. ZBP1: Innate sensor regulating cell death and inflammation. Trends in Immunology. 39 (2), 123-134 (2018).
  10. Maelfait, J., Liverpool, L., Rehwinkel, J. Nucleic acid sensors and programmed cell death. Journal of Molecular Biology. 432 (2), 552-568 (2020).
  11. Verdonck, S., Nemegeer, J., Vandenabeele, P., Maelfait, J. Viral manipulation of host cell necroptosis and pyroptosis. Trends in Microbiology. 30 (6), 593-605 (2022).
  12. Guo, H., et al. Herpes simplex virus suppresses necroptosis in human cells. Cell Host & Microbe. 17 (2), 243-251 (2015).
  13. Yu, X., et al. Herpes simplex virus 1 (HSV-1) and HSV-2 mediate species-specific modulations of programmed necrosis through the viral ribonucleotide reductase large subunit R1. Journal of Virology. 90 (2), 1088-1095 (2016).
  14. Huang, Z., et al. RIP1/RIP3 binding to HSV-1 ICP6 initiates necroptosis to restrict virus propagation in mice. Cell Host & Microbe. 17 (2), 229-242 (2015).
  15. Guo, H., et al. Species-independent contribution of ZBP1/DAI/DLM-1-triggered necroptosis in host defense against HSV1. Cell Death & Disease. 9 (8), 816(2018).
  16. Devos, M., et al. Sensing of endogenous nucleic acids by ZBP1 induces keratinocyte necroptosis and skin inflammation. The Journal of Experimental Medicine. 217 (7), 20191913(2020).
  17. Jiao, H., et al. Z-nucleic-acid sensing triggers ZBP1-dependent necroptosis and inflammation. Nature. 580 (7803), 391-395 (2020).
  18. de Reuver, R., et al. ADAR1 prevents autoinflammation by suppressing spontaneous ZBP1 activation. Nature. 607 (7920), 784-789 (2022).
  19. Jiao, H., et al. ADAR1 averts fatal type I interferon induction by ZBP1. Nature. 607 (7920), 776-783 (2022).
  20. Hubbard, N. W., et al. ADAR1 mutation causes ZBP1-dependent immunopathology. Nature. 607 (7920), 769-775 (2022).
  21. Zhang, T., et al. ADAR1 masks the cancer immunotherapeutic promise of ZBP1-driven necroptosis. Nature. 606 (7914), 594-602 (2022).
  22. Adams, J. C. Biotin amplification of biotin and horseradish peroxidase signals in histochemical stains. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 40 (10), 1457-1463 (1992).
  23. Speel, E. J., Hopman, A. H., Komminoth, P. Tyramide signal amplification for DNA and mRNA in situ hybridization. Methods in Molecular Biology. 326, 33-60 (2006).
  24. Clutter, M. R., Heffner, G. C., Krutzik, P. O., Sachen, K. L., Nolan, G. P. Tyramide signal amplification for analysis of kinase activity by intracellular flow cytometry. Cytometry A. 77 (11), 1020-1031 (2010).
  25. Dopie, J., Sweredoski, M. J., Moradian, A., Belmont, A. S. Tyramide signal amplification mass spectrometry (TSA-MS) ratio identifies nuclear speckle proteins. The Journal of Cell Biology. 219 (9), 201910207(2020).
  26. Samson, A. L., et al. A toolbox for imaging RIPK1, RIPK3, and MLKL in mouse and human cells. Cell Death and Differentiation. 28 (7), 2126-2144 (2021).
  27. De Groote, P., et al. Generation of a new gateway-compatible inducible lentiviral vector platform allowing easy derivation of co-transduced cells. Biotechniques. 60 (5), 252-259 (2016).
  28. Ali, M., Roback, L., Mocarski, E. S. Herpes simplex virus 1 ICP6 impedes TNF receptor 1-induced necrosome assembly during compartmentalization to detergent-resistant membrane vesicles. The Journal of Biological Chemistry. 294 (3), 991-1004 (2019).
  29. Mandal, P., et al. RIP3 induces apoptosis independent of pronecrotic kinase activity. Moleular Cell. 56 (4), 481-495 (2014).
  30. Zhang, T., et al. Influenza virus Z-RNAs induce ZBP1-mediated necroptosis. Cell. 180 (6), 1115-1129 (2020).
  31. Garnish, S. E., et al. Conformational interconversion of MLKL and disengagement from RIPK3 precede cell death by necroptosis. Nature Communications. 12 (1), 2211(2021).
  32. Clay, H., Ramakrishnan, L. Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification. Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).
  33. Parra, E. R., et al. Procedural requirements and recommendations for multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification assays to support translational oncology studies. Cancers. 12 (2), 255(2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

ZBP1 afhankelijke necroptosegefosforyleerd RIPK3gefosforyleerd MLKLconfocale microscopienecroptose biomarkersceldoodpadenhumane HT 29 cellen
Tyramide signaalversterking voor de immunofluorescente kleuring van ZBP1-afhankelijke fosforylering van RIPK3 en MLKL na HSV-1-infectie in menselijke cellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.