Hier wordt een nanobar-ondersteund lipide bilayer-systeem ontwikkeld om een synthetisch membraan te bieden met een gedefinieerde kromming die de karakterisering van eiwitten met krommingsdetectievermogen in vitro mogelijk maakt.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een nanobar-ondersteund lipide bilayer-systeem voor de studie van membraankrommingsgevoelige eiwitten in vitro
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Membraankromming speelt een belangrijke rol in verschillende essentiële processen van cellen, zoals celmigratie, celdeling en vesikelhandel. Het wordt niet alleen passief gegenereerd door cellulaire activiteiten, maar reguleert ook actief eiwitinteracties en is betrokken bij veel intracellulaire signalering. Het is dus van grote waarde om de rol van membraankromming bij het reguleren van de distributie en dynamiek van eiwitten en lipiden te onderzoeken. Onlangs zijn er veel technieken ontwikkeld om de relatie tussen het gebogen membraan en eiwit in vitro te bestuderen. In vergelijking met traditionele technieken biedt de nieuw ontwikkelde nanobar-supported lipid bilayer (SLB) zowel een hoge doorvoer als een betere nauwkeurigheid bij het genereren van membraankrommingen door een continue lipide bilayer te vormen op patroonarrays van nanobaren met een vooraf gedefinieerde membraankromming en lokale vlakke controle. Zowel de lipidefluïditeit als de eiwitgevoeligheid voor gebogen membranen kunnen kwantitatief worden gekarakteriseerd met behulp van fluorescentiemicroscopiebeeldvorming. Hier wordt een gedetailleerde procedure geïntroduceerd voor het vormen van een SLB op gefabriceerde glazen oppervlakken met nanobar arrays en de karakterisering van krommingsgevoelige eiwitten op dergelijke SLB. Daarnaast komen protocollen voor hergebruik van nanochips en beeldverwerking aan bod. Naast de nanobar-SLB is dit protocol gemakkelijk toepasbaar op alle soorten nanogestructureerde glaschips voor krommingsdetectiestudies.
Inleiding
Membraankromming is een kritische fysieke parameter van een cel die voorkomt in een verscheidenheid aan cellulaire processen zoals morfogenese, celdeling en celmigratie1. Het wordt nu algemeen erkend dat membraankromming verder gaat dan een eenvoudig resultaat van cellulaire gebeurtenissen; in plaats daarvan is het naar voren gekomen als een effectieve regulator van eiwitinteracties en intracellulaire signalering. Verschillende eiwitten die betrokken zijn bij clathrin-gemedieerde endocytose bleken bijvoorbeeld bij voorkeur te binden aan het gebogen membraan, wat resulteerde in de vorming van een hotspot voor endocytose2.....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Reiniging van nanochips
- Plaats de nanochip in een bekerglas van 10 ml met de patroonzijde naar boven gericht.
OPMERKING: Deze kwarts nanochip is vervaardigd via elektronenbundellithografie zoals beschreven vóór21. De geometrie en rangschikking van de nanostructuur op de chip kan op maat worden ontworpen. De maten van de gradiënt nanobars die hier worden gebruikt, zijn 2000 nm lang, 600 nm hoog en 100 tot 1000 nm breed (100 nm stappenset). - Voeg voorzichtig 1 ml 98% zwavelzuur toe aan het bekerglas en zorg ervoor dat het zuur de voor- en achterkant van de chip volledig bedekt.
OPMERKING: 98% ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Nanobar-ontwerp wordt aanbevolen voor het onderzoeken van positieve krommingsgevoelige eiwitten, die aan elk uiteinde een halve cirkel bevatten met kromming gedefinieerd door de nanobarbreedte en één vlakke / nulkrommingsregeling lokaal in het midden (figuur 2A, B). Succesvolle vorming van de SLB op nanobars resulteert in gelijkmatig verdeelde lipidemarkersignalen over het gehele nanobaroppervlak, zoals weergegeven in figuur 2C. Signalen van mee.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het hier beschreven nanobar-SLB-systeem biedt een unieke combinatie van de voordelen in verschillende bestaande in vitro assays. Het onthult efficiënt de preferentiële binding van eiwitten aan sterk gebogen membranen als de liposoom floatatie- of sedimentatietest, maar vereist veel minder monsters en biedt nauwkeuriger gedefinieerde kromming op individuele nanobaren 8,29. Het biedt ook een breed scala aan nauwkeurig gecontroleerde krommingen voor gelijkt.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen concurrerend financieel belang te hebben bij dit werk.
Dankbetuigingen
We bedanken Nanyang NanoFabrication Centre (N2FC) en het Centre for Disruptive Photonic Technologies (CDPT) aan de Nanyang Technological University (NTU) voor het ondersteunen van nanostructuurfabricage en SEM-beeldvorming, het Protein Production Platform (PPP) aan de School of Biological Sciences NTU voor eiwitzuivering en de School of Chemical and Biomedical Engineering NTU voor de confocale microscoop. Dit werk wordt gefinancierd door het Ministerie van Onderwijs van Singapore (MOE) (W. Zhao, RG112/20, RG95/21 en MOE-T2EP30220-0009), het Institute for Digital Molecular Analytics and Science (IDMxS), ondersteund door MOE-financiering in het kader van het Research Ce....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Anhydrous Ethanol | Sigma-Aldrich | 100983 | |
| Aluminiumfolie | Diamond | RN0879999FU | |
| Bernstein Vial | Sigma-Aldrich | 27115-U | |
| Brain PS: L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (natriumzout) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 840032 | |
| 10 mL Beker | Schott-Duran | SCOT211060804 | |
| 50 mL Beker | Schott-Duran | SCOT211061706 | |
| 1000 mL Beker | Schott-Duran | SCOT211065408 | De tweede container |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | V800117 | |
| Wattenstaafjes | Watsons | ||
| 18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nikkelzout) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 790404 | |
| Egg PC: L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 840051 | |
| F-BAR | Protein Production Platform, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Eiwitten en peptide | |
| F-BAR+IDR | Protein Production Platform, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Eiwitten en peptide | |
| GFP | Protein Production Platform, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Eiwitten en peptide | |
| GFP-His | Protein Production Platform, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Eiwitten en peptide | |
| GraphPad Prism | GraphPad | V9.0.0 | |
| Waterstofperoxide, 30% (gecertificeerd ACS) | Thermo Scientific | H325-500 | |
| IDR uit menselijk FBP17 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| ImageJ | National Institutes of Health | 1.50d | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Zeiss | LSM 800 with Airyscan | 100x (N.A.1.4) olie objectief. |
| Methanol | Fisher scientific | 10010240 | |
| Mini-extruder | Avanti Polar Lipids, Inc. | 610000-1EA | |
| 1.5 mL Microbuisjes | Greiner | 616201 | |
| MATLAB | Mathworks | R2018b | |
| Nuclepore Hydrophilic Membrane, 0.1 μm | Whatman | 800309 | |
| Fosfaat Buffer Saline (PBS) | Life Technologies Holdings Pte Ltd. | 70013 | |
| Polydimethylsiloxaan (PDMS) Basis | Dow Corning Corporation | SYLGARD 184 | |
| Polydimethylsiloxaan (PDMS) Crosslinker | Dow Corning Corporation | SYLGARD 184 | |
| Plasma Cleaner | HARRICK PLASMA | PDC-002-HP | |
| Kwarts Nanochip | Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD | ||
| Natriumhydroxide | Sigma-Aldrich | 795429 | |
| Zwavelzuur | Sigma-Aldrich | 258105 | |
| Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosfoethanolamine, Triethylammoniumzout | Life Technologies Holdings Pte Ltd. | T1395MP | |
| Pincet | Gooi | PDC-002-HP | |
| Ultrasoonreinigers | Elma | D-78224 | |
| Voterx | Scientific Industries | G560E | |
| Vacuum Desicator | NUCERITE | 5312 | |
| Waterbad | Julabo | TW8 |
Referenties
- McMahon, H. T., Gallop, J. L. Membrane curvature and mechanisms of dynamic cell membrane remodelling. Nature. 438 (7068), 590-596 (2005).
- Zhao, W. et al. Nanoscale manipulation of membrane curvature for probing endocytosis in live cells. Nature Nanotechnology. 12 (8), 750-756 (2017).
- Galic, M. et al. External push and internal pull forces recruit curvature-sensing N-BAR domain proteins to the plasma membrane. Nature Cell Biology. 14 (8), 874-881 (2012).
- Rosholm, K. R. et al. Membrane curvature regulates ligand-specific membrane sorting of GPCRs in living cells. Nature Che....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
