Methodenartikel

Synoviale vloeistofanalyse om artrose te identificeren

8.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64351

⸱

20 oktober 2022

 ,  ,  , 
1Rheumatology Unit, Department of Medicine-DIMED, University of Padova

In dit artikel

Samenvatting

Synoviale vloeistofanalyse onder doorgegeven, gepolariseerde en gecompenseerde lichtmicroscopie wordt gebruikt om de inflammatoire of niet-inflammatoire aard van een monster te evalueren door middel van eenvoudige stappen. Het is vooral nuttig bij artrose om calciumkristallen te detecteren en een ernstigere subset van artrose te identificeren.

Samenvatting

Synoviale vloeistof (SF) analyse is belangrijk bij het diagnosticeren van artrose (OA). Macroscopische en microscopische kenmerken, waaronder het totale en differentiële aantal witte bloedcellen (WBC), helpen bij het definiëren van de niet-inflammatoire aard van SF, wat een kenmerk is van OA. Bij patiënten met artrose is WBC in SF-monsters meestal niet hoger dan 2000 cellen per microliter en is het percentage ontstekingscellen, zoals neutrofielen, zeer laag of afwezig. Calciumkristallen komen vaak voor in SF verzameld van OA-patiënten. Hoewel hun rol in de pathogenese van artrose onduidelijk blijft, zijn ze in verband gebracht met een mild ontstekingsproces en een ernstiger ziekteprogressie. Onlangs zijn calciumkristallen beschreven in zowel de vroege als de late stadia van artrose, wat aangeeft dat ze een vitale rol kunnen spelen bij het diagnosticeren van verschillende klinische subsets van artrose en farmacologische behandeling. Het algemene doel van SF-analyse bij artrose is tweeledig: het vaststellen van de niet-inflammatoire mate van SF en het benadrukken van de aanwezigheid van calciumkristallen.

Inleiding

Artrose (OA) is een complexe en multifactoriële chronische gewrichtsaandoening, met een geschatte gepoolde wereldwijde prevalentie van 16% bij proefpersonen van 15 jaar en ouder, en 23% bij proefpersonen van 40 jaar en ouderdan 1. De incidentie van artrose zal naar verwachting toenemen als gevolg van een vergrijzende bevolking en een toename van risicofactoren, zoals obesitas en metabool syndroom2.

Een van de belangrijkste problemen in verband met artrose is de moeilijkheid bij het diagnosticeren van de ziekte in de vroege stadia en de momenteel beschikbare behandelingen die beperkt zijn tot pijnbestrijding en symptomatische langwerkende geneesmiddelen (SYSADO's) zoals glycosaminoglycanen. De diagnose artrose is gebaseerd op klinische symptomen en beeldvormingsbevindingen. Het ontbreken van correlatie tussen de twee beoordelingen kan echter leiden tot jarenlange vertraging bij de diagnose van artrose en het starten van de behandeling2. Artrose wordt gekenmerkt door degeneratieve processen en laaggradige ontsteking, die gemakkelijk kunnen worden onderzocht via synoviale vloeistof (SF) -analyse. SF is een viskeus plasmatisch dialysaat rijk aan hyaluronzuur, dat de gewrichtsruimte smeert, voedingsstoffen en zuurstof aan kraakbeen levert en metabolisch afval verwijdert. SF fungeert ook als een schokdemper en beschermt zo de gewrichten tijdens stress en spanning3.

SF-analyse is een eenvoudige en betrouwbare methode die altijd moet worden uitgevoerd tijdens de eerste evaluatie van patiënten met musculoskeletale symptomen en gewrichtsuitvloeiingen3. Aanbevelingen van het American College of Rheumatology, de British Society for Rheumatology en anderen omvatten SF-analyse onder de diagnostische tests voor reumatische aandoeningen die voornamelijk moeten worden uitgevoerd bij het evalueren van acute monoartritis 4,5. Totale en differentiële leukocytentellingen verkregen uit SF-analyse bieden een momentopname van het pathologische proces dat zich in het gewricht voordoet, waardoor de mate van ontsteking wordt geclassificeerd. De identificatie van pathogene kristallen, zoals mononatriumuraat (MSU) en calciumpyrofosfaat (CPP) kristallen, onder gepolariseerd licht, is van vitaal belang bij de diagnose en behandeling van kristalartritis (bijv. Jicht en pseudogout). Bovendien suggereert de aanwezigheid van micro-organismen een diagnose van septische artritis.

Calciumkristallen komen vaak voor in monsters die zijn verzameld bij patiënten met OA6. Basische calciumfosfaat (BCP) kristallen en CPP zijn gemeld in respectievelijk ongeveer 22% en 23% van de SF-monsters van patiënten met OA6. Hoewel hun rol onduidelijk blijft, zijn deze kristallen geassocieerd met ernstigere vormen van OA7 en worden ze beschouwd als een epifenomeen van het pathologische proces zelf. Calciumkristallen zijn gedetecteerd in 100% van de weefselmonsters van artrosepatiënten die een knieprothese ondergaan8. Bovendien is verondersteld dat calciumkristallen betrokken kunnen zijn bij de pathogenese van artrose vanwege hun ontstekingseffecten, aangetoond door verschillende studies9 en gemedieerd, althans gedeeltelijk, door het NLRP3-inflammasoom10.

Meer recent zijn calciumkristallen beschreven in zowel vroege als late stadia6 van artrose, wat aangeeft dat ze een vitale rol kunnen spelen bij het diagnosticeren van verschillende klinische subsets van artrose en farmacologische behandeling.

Het algemene doel van SF-analyse is tweeledig: het bepalen van de ontstekingsgraad van SF en het diagnosticeren van kristal- of septische artritis door specifieke kristallen of micro-organismen te identificeren. Het is een bijzonder nuttig, eenvoudig en betrouwbaar hulpmiddel bij het diagnosticeren van artrose, vanwege het typische niet-inflammatoire patroon met een zeer laag percentage of afwezigheid van neutrofielen.

Voordelen ten opzichte van alternatieve technieken
SF-analyse bestaat uit eenvoudige procedures die totale en differentiële leukocytentellingen en kristalonderzoek omvatten. Handmatige celtelling uitgevoerd door deskundige laboratoriumtechnici 3,11 blijft de gouden standaard voor de cytologische analyse van synoviale en andere lichaamsvloeistoffen. Vanwege de tijdrovende beperking en de inter- en intra-waarnemersvariabiliteit van deze methode, hebben geautomatiseerde celtellers echter geleidelijk het handmatig tellen vervangen in grote routinematige klinische laboratoria waar bloed- en urineanalysatoren zijn aangepast om SF-analyse11,12 mogelijk te maken. Niettemin biedt handmatig tellen enkele voordelen in specifieke omgevingen: (1) in de ambulante, om op tijd een totale en differentiële WBC-waarde te verkrijgen; (2) om celtypen te identificeren zoals cytofagocytische mononucleaire (Reiter) cellen of niet-hematopoëtische cellen zoals synoviocyten, die geautomatiseerde tellers niet kunnen herkennen; 3) wanneer het monster te klein is om door het instrument te worden gehanteerd; (4) het opzetten van lokale laboratoriumregisters die gemakkelijk toegankelijk zijn voor onderzoeksdoeleinden. Een ander voordeel van handmatig tellen is insupravitale kleuring, een methode die de differentiatie van cellen zeer snel en onmiddellijk na de voorbereiding van glasplaten mogelijk maakt. Traditionele kleuringen, zoals de Wright- en de May-Grünwald-Giemsa-procedures, vereisen daarentegen luchtgedroogde SF-uitstrijkjes en tijd om de cellen te kleuren13. Hoewel niet geschikt voor tijdgevoelige routineanalyses, onthullen deze kleuringsmethoden meer gedetailleerde celpopulaties in het monster, waaronder erytrocyten, basofielen, eosinofielen, polymorfonucleaire leukocyten, lymfocyten en bloedplaatjes.

Ten slotte wordt routinematige SF-analyse voor kristallen uitgevoerd met behulp van een eenvoudige techniek op basis van gepolariseerde lichtmicroscopie, die snelle resultaten oplevert14. Alternatieve methoden, zoals scanning en elektronenmicroscopie, leveren nauwkeurigere en gevoeligere resultaten op, maar het gebruik ervan in de dagelijkse klinische praktijk is niet haalbaar vanwege de hoge kosten en tijdrovende monstervoorbereiding en -analyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Het huidige protocol voldoet aan de richtlijnen van de ethische commissie van het Universitair Ziekenhuis Padova. SF werd verzameld met toestemming van de patiënt van de kniegewrichten van patiënten die therapeutische artrocentese kregen voor gewrichtsuitvloeiing bij hun eerste presentatie aan de kliniek of als reactie op een artritische opflakkering. Contra-indicaties voor de procedure waren: coagulopathie, antistollingsmedicijnen, huidlaesies, dermatitis of cellulitis boven het gewricht. Alle SF-monsters werden gedeïdentificeerd.

1. Synoviale vloeistofbereiding

  1. Breng de SF-monsters die zijn verzameld tijdens de artrocentese van gezwollen gewrichten15 over in een buis met antistollingsmiddel (bij voorkeur EDTA; zie materiaaltabel) en in een tweede buis zonder additief (figuur 1).
  2. In vermoedelijke gevallen van infectie, breng aseptisch een deel van het SF-monster (~ 1 ml) over in kweekflessen voor microbiologisch onderzoek.
    OPMERKING: Infectie kan worden vermoed als gevolg van zowel klinische kenmerken (ernstige tumor, dolor, calor, functio laesa en soms koorts) als macroscopisch uiterlijk van de SF (troebelheid, kleur). In dit geval schrijft de arts een microbiologische analyse voor, die wordt uitgevoerd door een microbiologisch laboratorium.
  3. Voer SF-analyse uit (stappen 2-5) zodra het monster is verzameld.

2. Macroscopisch onderzoek

OPMERKING: Macroscopische evaluatie van SF-monsters bestaat uit subjectieve, kwalitatieve en semikwantitatieve beoordelingen. Er zijn geen referentiestandaardschalen en er worden geen controlemonsters gebruikt.

  1. Annoteer het SF-volume uitgedrukt in milliliter. Definieer de kleur van het monster, die kan variëren van bleek tot donkergeel. Noteer de aanwezigheid van bloed.
  2. Definieer de mate van helderheid door het monster in de achtergrondverlichting te observeren en het gemak van het lezen van een afgedrukte pagina door de vloeistofbuis te bepalen (figuur 2A).
  3. Beoordeel de viscositeit door het monster uit een wegwerppipet te druppelen. Een lange snaar- of druppelvorming duidt respectievelijk op een goede of slechte viscositeit (figuur 2B).
  4. Beoordeel de aanwezigheid van deeltjes, waaronder weefselfragmenten of fibrine, door het monster door de buis en in de achtergrondverlichting te observeren.

3. Microscopisch onderzoek

OPMERKING: De SF-microscopische analyse bestaat uit cytologisch onderzoek, inclusief totale en differentiële witte bloedcellen (WBC) tellingen en het zoeken naar kristallen.

  1. Bepaal het totale aantal cellen aan de hand van de onderstaande stappen.
    1. Bepaal het totale aantal leukocyten in de SF verzameld in de EDTA-buis met behulp van een hemocytometer (zie tabel met materialen).
    2. Trek 0,5 μL SF uit de EDTA-buis met behulp van een pipet van Malassez-Potain (merkteken 0,5; zie materiaaltabel) (aanvullende figuur 1). Trek met dezelfde pipet 9,5 μl 0,1% methyleenblauwoplossing op (merkteken 11). De uiteindelijke verdunning is 20-voudig.
    3. Meng de pipet door zachte inversie, gooi de eerste druppels weg en giet de synoviale vloeistof + methyleenblauwe oplossing in de telkamer.
    4. Tel de cellen in twee opeenvolgende kwadraten van de negen en vermenigvuldig het verkregen getal met 100 (vereenvoudigde formule; Aanvullende figuur 2). Druk WBC's uit als het aantal leukocyten per kubieke millimeter.
      OPMERKING: Vereenvoudigde formule: Leukocyten (N/mm3) = het aantal getelde cellen in twee opeenvolgende vierkanten x 100.
    5. Classificeer de SF volgens het totale aantal WBC's na eerder gepubliceerde rapporten16,17 (tabel 1).
  2. Voer differentiële celtelling uit.
    1. Bepaal het percentage polymorfonucleaire (PMN) cellen, monocyten en lymfocyten met behulp van supravitale of traditionele kleuring13,18.
    2. Voor supravitale kleuring plaatst u een kleine druppel SF in het midden van een kant-en-klare dia die is voorgecoat met cresylviolet en methyleenblauw (aanvullende figuur 3; zie materiaaltabel).
    3. Dek af met een dekplaat en plaats een druppel microscoop onderdompelingsolie.
    4. Bereid een luchtgedroogd SF-uitstrijkje voor traditionele kleuring (minder geschikt voor routineanalyse). Leg een kleine druppel SF aan het einde van een schone dia. Gebruik een tweede dia of een coverslip en spreid deze met een voorwaartse beweging over de dia. Laat het uitstrijkje aan de lucht drogen.
    5. Bevlek het monster volgens een standaard May-Grünwald-Giemsa-procedure18.
    6. Onderzoek de dia onder het olie-onderdompelingsobjectief (1.000x).
    7. Tel 100 opeenvolgende cellen en maak onderscheid tussen polymorfonucleaire cellen, monocyten en lymfocyten (figuur 3, aanvullende figuur 4).
    8. Druk het totale aantal in elke categorie uit als een percentage.
      OPMERKING: Om nauwkeurige resultaten te verkrijgen, moeten cytologische onderzoeken worden uitgevoerd zodra de SF is verzameld of binnen 24-48 uur na artrocentese wanneer deze op de juiste manier wordt bewaard (4 °C).

4. Kristaldetectie

  1. Bepaal de aanwezigheid van pathologische kristallen met behulp van een gepolariseerde lichtmicroscoop uitgerust met een extra polarisatiefilter en een rode compensator19 (zie materiaaltabel).
  2. Voer diavoorbereiding uit voor kristaldetectie.
    1. Reinig een glasplaat zorgvuldig met optisch papier of zacht papier met ethanol. Breng een kleine druppel SF aan op de glazen dia.
    2. Dek af met een coverslip en plaats de dia onder de microscoop.
  3. Identificeer de kristallen.
    1. Stel de dia onder de microscoop scherp met behulp van een vergrotingsobjectief met een laag vermogen. Onderzoek de dia zorgvuldig onder een helder veld met een objectief van 40x. Kijk binnen en buiten de cellen.
    2. Identificeer de kristallen op basis van hun grootte en vorm (bijvoorbeeld rhomboïdaal, naaldvormig, staafvormig).
    3. Plaats het polarisatiefilter tussen de lichtbron en het monster. Draai de polarisator totdat de optische as loodrecht op de analysator staat (boven de objectieven geplaatst) om een donkere achtergrond te creëren.
    4. Zodra een birefringent kristal is geïdentificeerd, plaatst u de compensator tussen de polarisator en het monster en beweegt u het parallel of loodrecht op de optische as van het kristal.
    5. Let op de kleur die door het kristal wordt onthuld (tabel 2).
      OPMERKING: MSU-kristallen lijken naaldvormig, helder birefringent in het donkere veld en vertonen een geel/oranje kleur wanneer hun as evenwijdig is aan de compensator. Omgekeerd zijn ze blauw wanneer ze loodrecht op elkaar staan (negatief teken) (tabel 2; Figuur 4). CPP-kristallen zijn staaf- of ruitvormige kristallen, zwak birefringent onder gepolariseerd licht, en vertonen een blauwe of gele kleur wanneer ze respectievelijk parallel of loodrecht op de as van de compensator zijn uitgelijnd (positief teken) (tabel 2; Figuur 5).

5. Alizarine rode kleuring

  1. Bereid een 2% oplossing van alizarine rood S (pH 4,1-4,3), filter de oplossing door een filter van 0,22 μm en bewaar het uit de buurt van licht.
    1. Meng voor het bereiden van de dia een druppel SF met hetzelfde volume alizarinerode oplossing (1:1) op een schone dia. Dek af met een coverslip en onderzoek bij 400x vergroting.
    2. Identificeer de kristallen onder de microscoop.
      OPMERKING: De test is positief wanneer heldere, donkerrode neerslagen zichtbaar zijn onder doorgelaten licht, met een ronde vorm en concentrische lagen. Onder gepolariseerd licht lijken ze sterk birefringent20 (figuur 6).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Grote gewrichten die zijn aangetast door artrose zijn vaak gezwollen en produceren aanzienlijke hoeveelheden SF, die worden afgevoerd via artrocentese15. De macroscopische kenmerken van SF die onmiddellijk na artrocentese worden geëvalueerd, omvatten in wezen de hoeveelheid, kleur, helderheid en viscositeit17. Ondanks hun lage specificiteit bieden ze voorlopige gegevens over de mate van ontsteking. De kleur hangt af van SF-cellulariteit en de mate van fragmentatie ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In OA helpt SF-analyse bij het definiëren van ziektekenmerken door middel van eenvoudige stappen: totale en differentiële leukocytentellingen en het zoeken naar kristallen, waaronder CPP en BCP. Bovendien kan de detectie van MSU-kristallen belangrijke comorbiditeiten aan het licht brengen.

Ondanks lage kosten en eenvoudige uitvoering, kunnen de gevoeligheid van de tests en de betrouwbaarheid van de resultaten worden beïnvloed door onervaren analisten, voornamelijk als het gaat om kristalidenti...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Alle auteurs maken geen belangenconflicten bekend.

Dankbetuigingen

De auteurs willen professor Leonardo Punzi bedanken voor zijn kostbare mentorschap op het gebied van synoviale vloeistofanalyse en het Padova University Hospital voor zijn steun.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Alizarin red SMerckA5533Voor BCP-kristalzoeken
Burker kamerMerckBR718905Voor totale witte bloedceltelling
DekglazenMerckC7931Voor microscopisch onderzoek 
EDTA buisjesBD368861Voor SF-verzameling 
Glijbanen MerckS8902Voor kristallen zoeken
Lambda filter (compensator)Elke Raadpleeg microscoopbedrijfVoor kristallen identificatie 
Malassez-Potain pipetArtiglass54830000Voor verdunning van synoviaal vocht
Methyleenblauw oplossingMerck3978Voor totale witte bloedceltelling
Gepolariseerde microscoop Leica, Nikon, anderenAfhankelijk van het model en bedrijfVoor volledige synoviaal vocht analyse
PolriseringslensElke Raadpleeg microscoopbedrijfVoor kristallen identificatie 
Testsimplet Waldeck14386Supravital kleuring voor celdifferentiatie

Referenties

  1. Cui, A., et al. Global, regional prevalence, incidence and risk factors of knee osteoarthritis in population-based studies. EClinicalMedicine. 29, 100587(2020).
  2. Hunter, D. J., Bierma-Zeinstra, S. Osteoarthritis. Lancet. 393 (10182), 1745-1759 (2019).
  3. Mandell, B. F. Synovial Fluid Analysis and the Evaluation of Patients with Arthritis. , Springer. Cham. (2022).
  4. Schmerling, R. H. Guidelines for the initial evaluation of the adult patient with acute musculoskeletal symptoms. Arthritis & Rheumatism. 39 (1), 1-8 (1996).
  5. Coakley, G., et al. RCGP and BSAC guidelines for management of the hot swollen joint in adults. Rheumatology. 45 (8), 1039-1041 (2006).
  6. Frallonardo, P., et al. Basic calcium phosphate and pyrophosphate crystals in early and late osteoarthritis: relationship with clinical indices and inflammation. Clinical Rheumatology. 37 (10), 2847-2853 (2018).
  7. Nalbant, S., et al. Synovial fluid features and their relations to osteoarthritis severity: new findings from sequential studies. Osteoarthritis Cartilage. 11 (1), 50-54 (2003).
  8. Fuerst, M., et al. Calcification of articular cartilage in human osteoarthritis. Arthritis & Rheumatism. 60 (9), 2694-2703 (2009).
  9. Campillo-Gimenez, L., et al. Inflammatory potential of four different phases of calcium pyrophosphate relies on NF-κB activation and MAPK pathways. Frontiers in Immunology. 9, 2248(2018).
  10. Pazár, B. Basic calcium phosphate crystals induce monocyte/macrophage IL-1β secretion through the NLRP3 inflammasome in vitro. The Journal of Immunology. 186 (4), 2495-2502 (2011).
  11. Martín, M. J. A., et al. Automated cell count in body fluids: a review. Advances in Laboratory Medicine. 2, 149-161 (2021).
  12. Seghezzi,, et al. Optimization of cellular analysis of synovial fluids by optical microscopy and automated count using the Sysmex XN body fluid mode. Clinica Chimica Acta. 462, 41-48 (2016).
  13. Reginato, A. J., Maldonado, I., Reginato, A. M., Falasca, G. F., O'Connor, C. R. Supravital staining of synovial fluid with Testsimplets. Diagnostic Cytopathology. 8 (2), 147-152 (1992).
  14. Lumbreras, B., et al. Analysis for crystals in synovial fluid: training of the analysts results in high consistency. Annals of the Rheumatic Diseases. 64 (4), 612-615 (2005).
  15. Tieng, A., Franchin, G. Knee arthrocentesis in adults. Journal of Visualized Experiments. , e63135(2022).
  16. Punzi, L., Oliviero, F. Arthrocentesis and synovial fluid analysis in clinical practice: value of sonography in difficult cases. Annals of the New York Academy of Sciences. 1154 (1), 152-158 (2009).
  17. Schumacher, H. R., Reginato, A. J. Atlas of Synovial Fluid Analysis and Crystal Identification. , Lea & Febiger. Philadelphia. (1991).
  18. Mopin, A., Driss, V., Brinster, C. A. Detailed protocol for characterizing the murine C1498 cell line and its associated leukemia mouse model. Journal of Visualized Experiments. (116), e54270(2016).
  19. Oliviero, F., Punzi, L. Basics of Polarized Light Microscopy. Synovial Fluid Analysis and the Evaluation of Patients with Arthritis. , Springer. Cham. 79-90 (2022).
  20. Paul, H., Reginato, A. J., Schumacher, H. R. Alizarin red S staining as a screening test to detect calcium compounds in synovial fluid. Arthritis & Rheumatism. 26 (2), 191-200 (1983).
  21. Favero, M., et al. Synovial fluid fetuin-A levels in patients affected by osteoarthritis with or without evidence of calcium crystals. Rheumatology. 58 (4), 729-730 (2019).
  22. Frallonardo, P., et al. Detection of calcium crystals in knee osteoarthritis synovial fluid: a comparison between polarized light and scanning electron microscopy. Journal of Clinical Rheumatology. 22 (7), 369-371 (2016).
  23. Peffers, M. J., Smagul, A., Anderson, J. R. Proteomic analysis of synovial fluid: current and potential uses to improve clinical outcomes. Expert Review of Proteomics. 16 (4), 287-302 (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Diagnose van artroseaantal witte bloedcellencalciumkristallendifferentiatie van bloedcellenarthrocentesealizarineroodkleuringgepolariseerde lichtmicroscopiebasiscalciumfosfaatinflammatoire cytokinen

Gerelateerde artikelen