Methodenartikel

High-throughput cardiotoxiciteitsscreening met behulp van volwassen door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocytenmonolagen

DOI:

10.3791/64364

⸱

24 maart 2023

 ,  ,  ,  , 
1Frankel Cardiovascular Regeneration Core Laboratory, Cardiovascular Medicine-Internal Medicine, University of Michigan, Ann Arbor, 2CAIRN Research, 3StemBioSys, Inc.

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CMs) bieden een alternatief voor het gebruik van dieren voor preklinische cardiotoxiciteitsscreening. Een beperking voor de wijdverbreide toepassing van hiPSC-CMs in preklinische toxiciteitsscreening is het onrijpe, foetale fenotype van de cellen. Hier worden protocollen gepresenteerd voor robuuste en snelle rijping van hiPSC-CMs.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Door de mens geïnduceerde van stamcellen afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CMs) worden gebruikt om de afhankelijkheid van dieren en dierlijke cellen te vervangen en te verminderen voor preklinische cardiotoxiciteitstests. In tweedimensionale monolaagformaten recapituleren hiPSC-CMs de structuur en functie van de volwassen menselijke hartspiercellen wanneer ze worden gekweekt op een optimale extracellulaire matrix (ECM). Een van menselijke perinatale stamcellen afgeleide ECM (rijpingsinducerende extracellulaire matrix-MECM) rijpt de hiPSC-CM-structuur, functie en metabole toestand in 7 dagen na plating.

Volwassen hiPSC-CM monolayers reageren ook zoals verwacht op klinisch relevante medicijnen, met een bekend risico op het veroorzaken van aritmieën en cardiotoxiciteit. De rijping van hiPSC-CM monolagen was tot nu toe een obstakel voor de wijdverspreide acceptatie van deze waardevolle cellen voor regelgevende wetenschap en veiligheidsscreening. Dit artikel presenteert gevalideerde methoden voor de plating, rijping en high-throughput, functionele fenotypering van hiPSC-CM elektrofysiologische en contractiele functie. Deze methoden zijn van toepassing op in de handel verkrijgbare gezuiverde cardiomyocyten, evenals van stamcellen afgeleide cardiomyocyten die intern worden gegenereerd met behulp van zeer efficiënte, kamerspecifieke differentiatieprotocollen.

De elektrofysiologische functie met hoge doorvoer wordt gemeten met behulp van spanningsgevoelige kleurstoffen (VSD's; emissie: 488 nm), calciumgevoelige fluoroforen (CSF's) of genetisch gecodeerde calciumsensoren (GCaMP6). Een high-throughput optisch mappingapparaat wordt gebruikt voor optische opnames van elke functionele parameter en aangepaste speciale software wordt gebruikt voor elektrofysiologische gegevensanalyse. MECM-protocollen worden toegepast voor medicatiescreening met behulp van een positieve inotroop (isoprenaline) en humane Ether-a-go-go-related gene (hERG) kanaalspecifieke blokkers. Deze middelen zullen andere onderzoekers in staat stellen om met succes volwassen hiPSC-CMs te gebruiken voor high-throughput, preklinische cardiotoxiciteitsscreening, hartmedicatie-werkzaamheidstests en cardiovasculair onderzoek.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CMs) zijn op internationale schaal gevalideerd en zijn beschikbaar voor in vitro cardiotoxiciteitsscreening1. Zeer zuivere hiPSC-CM's kunnen in vrijwel onbeperkte aantallen worden gegenereerd, gecryopreserveerd en ontdooid. Bij het replateren reanimeren ze ook en beginnen ze samen te trekken met een ritme dat doet denken aan het menselijk hart 2,3. Opmerkelijk is dat individuele hiPSC-CM's aan elkaar koppelen en functionele syncytia vormen die als een enkel weefsel kloppen. Tegenwoordig worden hiPSC's routinematig afgeleid van bloedmonsters van patiënten, zodat elke persoon kan worden weergegeven met behulp van in vitro hiPSC-CM cardiotoxiciteitsscreeningstests 4,5. Dit creëert de mogelijkheid om "Clinical Trials in a Dish" uit te voeren, met een significante vertegenwoordiging uit diverse populaties6.

Een cruciaal voordeel ten opzichte van bestaande benaderingen voor cardiotoxiciteit bij dieren en dierlijke cellen is dat hiPSC-CMs het volledige menselijke genoom gebruiken en een in vitro systeem bieden met genetische overeenkomsten met het menselijk hart. Dit is vooral aantrekkelijk voor farmacogenomica en gepersonaliseerde geneeskunde - het gebruik van hiPSC-CMs voor medicatie en andere therapieontwikkeling zal naar verwachting nauwkeurigere, nauwkeurigere en veiligere medicatievoorschriften opleveren. Inderdaad, tweedimensionale (2D) hiPSC-CM monolayer assays hebben bewezen voorspellend te zijn voor medicatie cardiotoxiciteit, met behulp van een panel van klinisch gebruikte medicijnen met een bekend risico op het veroorzaken van aritmieën 1,7,8,9. Ondanks het enorme potentieel van hiPSC-CMs en de belofte om de ontwikkeling van geneesmiddelen te stroomlijnen en goedkoper te maken, is er een terughoudendheid geweest om deze nieuwe assays10,11,12 te gebruiken.

Tot nu toe is een belangrijke beperking van wijdverspreide acceptatie en acceptatie van hiPSC-CM-screeningstests hun onvolwassen, foetale uiterlijk, evenals hun functie. De kritieke kwestie van hiPSC-CM rijping is besproken en besproken in de wetenschappelijke literatuur ad nauseum13,14,15,16. Evenzo zijn veel benaderingen gebruikt om hiPSC-CM-rijping te bevorderen, waaronder extracellulaire matrix (ECM) manipulaties in 2D-monolagen en de ontwikkeling van 3D-gemanipuleerde hartweefsels (EHT's)17,18. Op dit moment is er een wijdverbreide overtuiging dat het gebruik van 3D EHT's een superieure rijping zal bieden ten opzichte van 2D monolayer-gebaseerde benaderingen. 2D-monolagen bieden echter een hogere efficiëntie van celgebruik en meer succes bij het plateren in vergelijking met 3D-EHT's; 3D EHT's gebruiken grotere aantallen cellen en vereisen vaak de opname van andere celtypen die de resultaten kunnen verstoren. Daarom ligt de focus in dit artikel op het gebruik van een eenvoudige methode om hiPSC-CMs te rijpen die zijn gekweekt als 2D-monolagen van elektrisch en mechanisch gekoppelde cellen.

Geavanceerde hiPSC-CM rijping kan worden bereikt in 2D monolagen met behulp van een ECM. De 2D-monolagen van hiPSC-CMs kunnen worden gerijpt met behulp van een zachte, flexibele polydimethylsiloxaan coverslip, bedekt met keldermembraanmatrix afgescheiden door een Engelbreth-Holm-Swarm muizensarcoomcel (muis-ECM). In 2016 toonden rapporten aan dat hiPSC-CMs gekweekt op deze zachte ECM-conditie functioneel volwassen werden, met actiepotentiaalgeleidingssnelheden in de buurt van volwassen hartwaarden (~ 50 cm / s)18. Verder vertoonden deze volwassen hiPSC-CM's vele andere elektrofysiologische kenmerken die doen denken aan het volwassen hart, waaronder hyperpolariseerde rustmembraanpotentiaal en expressie van Kir2.1. Meer recent identificeerden rapporten een van menselijke perinatale stamcellen afgeleide ECM-coating die de structurele rijping van 2D hiPSC-CMsbevordert 19. Hier worden eenvoudig te gebruiken methoden gepresenteerd om structureel volwassen 2D hiPSC-CM monolagen te ontwikkelen voor gebruik in elektrofysiologische schermen met hoge doorvoer. Verder bieden we validatie van een optisch mapping-instrument voor de geautomatiseerde acquisitie en analyse van 2D hiPSC-CM monolayer elektrofysiologische functie, met behulp van spanningsgevoelige kleurstoffen (VSD's) en calciumgevoelige sondes en eiwitten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

hiPSC-gebruik in dit protocol is goedgekeurd door de HPSCRO-commissie van de Universiteit van Michigan (Human Pluripotent Stem Cell Oversight Committee). Zie de Tabel met materialen voor een lijst met materialen en apparatuur. Zie tabel 1 voor de media en hun samenstellingen.

1. Ontdooien en plateren van in de handel verkrijgbare gecryopreserveerde hiPSC-CMs voor rijping op een rijpingsinducerende extracellulaire matrix (MECM)

  1. Verwarm alle reagentia tot kamertemperatuur en rehydrateer de MECM-platen met Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) of fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) die calcium en magnesium bevat, gedurende 1 uur voorafgaand aan cardiomyocytenplating (200 μL buffer per put van een plaat met 96 putten).
  2. Was de MECM-platen 2x met HBSS of PBS met calcium en magnesium gedurende 1 uur voorafgaand aan cardiomyocytenplating (200 μL buffer per put van een 96-putplaat) en houd de putjes gehydrateerd.
  3. Bereid een waterbad van 37 °C voor.
  4. Verwijder de cardiomyocytenbuizen uit de tank met vloeibare stikstof, breng de buizen over naar droogijs en open de buisdoppen enigszins om de druk te verminderen.
    OPMERKING: Het loslaten van druk in de buizen is uiterst belangrijk! Als er te veel druk in de buizen ontstaat, kunnen ze exploderen.
  5. Sluit de buisdoppen opnieuw en plaats ze in het waterbad om 4 minuten te ontdooien.
    OPMERKING: Laat ze volledig ontdooien, om celbeschadiging als gevolg van gedeeltelijke ontdooiing te voorkomen.
  6. Nadat de cellen zijn ontdooid, spuit u de buizen met 70% ethanol voordat u ze opent. Breng de cellen over in conische buisjes van 15 ml met een pipet van 1 ml. Druppel langzaam 8 ml platingmedium, waarbij de buis wordt geroerd telkens wanneer 1 ml wordt toegevoegd, zodat de cellen zich kunnen aanpassen aan veranderingen in osmolariteit.
    1. Was de cryovial met 1 ml beplatingsmedium met behulp van een glazen pipet van 1 ml. Druppel vervolgens de was langzaam in de conische buis van 15 ml.
  7. Centrifugeer de buizen op ~300 × g gedurende 5 minuten. Zuig het supernatant op en resuspensie de pellet in 1 ml platingmedium. Verwijder een aliquot en voer live celtelling uit met een hemocytometer. Voeg extra beplatingsmedium toe om 7,5 × 105 cellen/ml te verkrijgen.
    OPMERKING: Ongeveer 10 ml celsuspensie is vereist om 96 putten te bereiden.
  8. Doseer 100 μL celsuspensie per put van een MECM-gecoate 96-well plaat met behulp van een meerkanaals pipet.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat u celprecipitatie vermijdt en een uniforme celdichtheid in alle putten verkrijgt tijdens het plateren.
  9. Incubeer de cellen bij 37 °C, 5% CO 2 gedurende2 dagen voordat het medium wordt omgezet in onderhoudsmedium (200 μL/put). Vervang het onderhoudsmedium op dag 5 na het ontdooien. Voer EP-assays uit op dag 7 of later, zoals eerder beschreven 8,9. Verander het medium om de dag wanneer u kiest voor verlenging van de celkweek.

2. hiPSC cardiale differentiatie en hiPSC-CM zuivering

  1. Warme 1x in de handel verkrijgbare ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) oplossing, HBSS zonder calcium en magnesium (HBSS--), en 6-well platen bedekt met opgeloste keldermembraanmatrix uitgescheiden door een Engelbreth-Holm-Swarm muizensarcoomcel (muis-ECM) tot kamertemperatuur.
  2. Markeer de gedifferentieerde kolonies door fasecontrastmicroscopie en aspiraat/ablaat. Was elk goed met 1 ml HBSS--. Voer twee wasbeurten uit in putten met >10 differentiatieplekken.
  3. Zuig de HBSS aan - en voeg 1 ml EDTA-oplossing toe aan elke put. Incubeer de platen gedurende maximaal 5 minuten bij 37 °C. Controleer de platen na 3 minuten en zoek naar doorschijnende witte, zichtbare kolonies.
  4. Zuig de EDTA-oplossing aan en voeg 1 ml toe aan een enkele put. Maak de cellen los met 2 ml hiPSC-medium door de suspensie herhaaldelijk op en neer te pipetteren, met behulp van een glazen pipet van 10 ml om alle stamcellen uit de put los te maken en de celsuspensie over te brengen naar een verzamelbuis. Herhaal de aspiratie en ontwrichting met volgende putten.
    OPMERKING: Maak moeilijk op te tillen kolonies los met de punt van de glazen pipet.
  5. Tel de stamcellen en stel het volume in op plaat 8,0 × 105 cellen/put. Kweek de cellen op hiPSC-medium (2 ml / put) totdat de stamcellen 90% samenvloeiing bereiken (deze keer wordt dit vanaf nu D0 genoemd).
  6. Bereid 2 ml basaal differentiatiemedium aangevuld met 4 μM CHIR99021.
  7. Was op D0 elke put van een 6-putplaat met stamcellen met 1 ml HBSS per put. Vervang de HBSS door basaal differentiatiemedium aangevuld met 4 μM CHIR99021.
  8. Op D1, niets doen.
  9. Bereid op D2 basaal differentiatiemedium aangevuld met 4 μM IWP4.
  10. Vervang het medium door 2 ml IWP4-aangevuld basaal differentiatiemedium per put.
  11. Doe op D3 niets voor een ventriculaire-specifieke differentiatie. Voor een atriale specifieke differentiatie, zuig het medium en voeg 2 ml basaal medium aangevuld met 4 μM IWP4 en 1 μM retinoïnezuur (RA) oplossing per putje toe.
  12. Op D4, zuig het medium op en voeg 2 ml basaal medium per put toe voor ventriculaire differentiatie. Voor een atriale differentiatie, zuig het medium en voeg 2 ml basaal medium aangevuld met 1 μM RA-oplossing per put toe.
  13. Op D5 niets doen.
  14. Zuig op D6 het medium aan en voeg 2 ml basaal medium per put toe (voor zowel atriale als ventriculaire differentiatie).
  15. Op D7, niets doen.
  16. Zuig op D8 het medium aan en voeg 2 ml cardiomyocytenonderhoudsmedium toe. Verander het medium om de dag tot de celscheiding of volg een plan voor blootstelling aan chronische geneesmiddelen.

3. hiPSC-CM zuivering via MACS (magnetisch-geactiveerde celsortering)

  1. Zuig het celkweekmedium aan en was elk goed met 1 ml HBSS--. Dissocieer de cellen door 1 ml 0,25% trypsine/EDTA toe te voegen en te incuberen bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 10 minuten. Resuspendeer en singulariseer de cellen in elke put met 2 ml platingmedium om de trypsine / EDTA te inactiveren.
  2. Verzamel de cellen uit de zes putjes in een conische buis van 50 ml met een zeef van 70 μm. Was vervolgens de zeef met 3 ml platingmedium. Tel de cellen.
  3. Centrifugeer de suspensie op ~300 × g gedurende 5 minuten. Zuig het supernatant op en was de cellen met 20 ml ijskoude MACS-scheidingsbuffer. Centrifugeer vervolgens opnieuw op ~ 300 × g gedurende 5 minuten.
  4. Resuspendeerde de pellet in 80 μL koude MACS-scheidingsbuffer per 5 × 106 cellen. Voeg 20 μL koude niet-cardiomyocytendepletiecocktail (menselijk) toe per 5 × 106 cellen. Meng de celsuspensie voorzichtig en incubeer gedurende 10 minuten op ijs.
  5. Was het monster door 4 ml koude MACS-scheidingsbuffer per 5 × 106 cellen toe te voegen. Centrifugeer het monster gedurende 5 minuten op ~300 × g en zuig het supernatant op.
  6. Resuspendeerde de pellet in 80 μL koude MACS-scheidingsbuffer per 5 × 106 cellen. Voeg 20 μL koude anti-biotine microbeads per 5 × 106 cellen toe. Meng de celsuspensie voorzichtig en incubeer gedurende 10 minuten op ijs.
  7. Terwijl de monsters aan het broeden zijn, plaatst u de positieve depletiekolommen (uitgerust met de 30 μm voorscheidingsfilters) op de MACS-separator en plaatst u de gelabelde 15 ml opvangbuizen onder de kolommen. Voor elke 5 × 106 cellen is één kolom nodig.
  8. Primeer elke kolom met 3 ml koude MACS-scheidingsbuffer. Meng de met antilichamen behandelde celsuspensie met 2 ml MACS-scheidingsbuffer per 5 × 106 cellen en voeg toe aan de kolom.
    LET OP: Niet centrifugeren! Centrifugatie bij deze stap heeft nadelige effecten op de cardiomyocytenopbrengst.
  9. Voeg 2 ml MACS-scheidingsbuffer toe aan elke kolom en verzamel de doorstroming totdat 12 ml doorstroomde cardiomyocytensuspensie is verzameld.
    OPMERKING: Laat de kolommen nooit volledig drogen.
  10. Centrifugeer de cardiomyocyten op ~ 300 × g gedurende 5 minuten, gooi het supernatant weg en suspensie de cardiomyocyten in 1 ml platingmedium.
  11. Tel de cellen om de concentratie te bepalen, pas het volume aan de gewenste zaaidichtheid aan en plaats de cellen. Plaats de gezuiverde cardiomyocyten op de MECM 96-putplaten, zoals hierboven beschreven in stappen 1.9-1.11 (7.5 × 105 cellen/put).

4. Optische mapping met behulp van spanningsgevoelige kleurstoffen (VSD's) en calciumgevoelige fluoroforen (CSF's)

  1. Bereid de juiste hoeveelheid VSD in HBSS met calcium en magnesium, door 1 μL VSD-kleurstof per ml HBSS en 10 μL laadadjuvans per ml HBSS toe te voegen.
    OPMERKING: Doorgaans vereist een plaat met 96 putten 10 ml VSD-oplossing.
  2. Als alternatief, bereid HBSS met calcium en magnesium aangevuld met 5 μM van CSF. Zuig het onderhoudsmedium voor cardiomyocyten aan en vervang het door 100 μL VSD of CSF per putje van een plaat met 96 putten. Incubeer de cellen gedurende 30 minuten in de celkweekincubator.
  3. Verwijder de kleurstoffen en vervang deze door assay medium of HBSS. Evenwicht bij 37 °C voor de verwerving van optische mapping van basisgegevens met een optische mappingapparaat met hoge doorvoer.
  4. Behandel de cellen met medicijnen voor acute blootstellingstests, of breng de cellen in kaart die chronisch werden blootgesteld aan geneesmiddelen van belang.
  5. Gebruik voor cardiotoxiciteitstests in 96-putplaten vier doses van een verbinding met ten minste zes putjes per dosis. Gebruik doses variërend van onder tot boven de effectieve therapeutische plasmaconcentratie, inclusief een dosis van de klinisch effectieve therapeutische plasmaconcentratie.
  6. Verdun de geneesmiddelen in dimethylsulfoxide, bewaar ze als stamoplossingen bij -20 °C en verdun ze vervolgens in HBSS tot de gewenste concentraties.
  7. Voer basislijnelektrofysiologische metingen uit voorafgaand aan de toediening van het geneesmiddel, zoals beschreven in rubriek 5. Zodra de medicijnen zijn toegepast, maakt u ten minste 30 minuten later elektrofysiologische opnames voor chronische onderzoeken. Zie de volgende secties voor procedures voor het verzamelen en analyseren van optische mappinggegevens.

5. Optische mapping met behulp van genetisch gecodeerde calciumindicator (GECI)

  1. Plaat in de handel verkrijgbaar of MACS-gezuiverde hiPSC-CMs, zoals hierboven beschreven, met behulp van MECM-gecoate 96-well platen om volwassen hiPSC-CMs te maken. Om confluente monolagen te vormen, plaat 7,5 × 104 CMs per put van elke 96-well plaat. Gebruik plating medium.
  2. Schakel na 48 uur in platingmedium over op onderhoudsmedium voor cardiomyocyten.
  3. Voeg op dag 4 na het ontdooien en opnieuw plateren recombinant adenovirus voor het tot expressie brengen van GCaMP6m (AdGCaMP6m) toe aan cellen met een multipliciteit van infectie (MOI) = 5. Voeg het virus toe met behulp van CM-testmedium.
    OPMERKING: Hier werden experimenten met GCaMP6m uitgevoerd in iCell2 cardiomyocyten van een commerciële leverancier.
  4. Verwijder op dag 5 het adGCaMP6m-medium en vervang het door vers RPMI+B27 (onderhoudsmedium voor cardiomyocyten).
  5. Observeer op dag 7 de CMs met behulp van microscopie of de optische mapping imager, om spontane contracties en bijbehorende calciumtransiënten te visualiseren.
  6. Op dag 7 of later, voor medicatiescreening, brengt u 96-putplaten van volwassen hiPSC-CM-monolagen die GCaMP6m tot expressie brengen rechtstreeks over naar de optische mapping-imager van de incubator voor baselinegegevensverzameling.
  7. Na het verzamelen van elektrofysiologische gegevens, retourneert u de platen van de CM's naar de weefselkweekincubator voor metingen op een volgend tijdstip.
  8. Na basislijnopnamen, breng de medicijnen aan, met behulp van ten minste vier doses van elk medicijn en ten minste zes putten per dosis. Breng de medicijnen op de cellen in evenwicht gedurende ten minste 30 minuten voorafgaand aan het verzamelen van gegevens. Verwarm de puttemperatuur tot ~37 °C voor en tijdens het verzamelen van gegevens.
  9. Voeg na basislijnopnamen van een hele plaat isoproterenol (500 nM) toe aan elke put om robuuste medicijnresponsgegevens mogelijk te maken. Kwantificeer de effecten van isoproterenol op de monolayer beat rate, contractie amplitude (calcium transient amplitude) en calcium transient duration (zie figuur 6), zoals beschreven in rubriek 5.

6. Verwerving van optische kaartgegevens en analyse

  1. Zorg ervoor dat de camera van het optische mappingapparaat, de transilluminator en de plaatverwarming zijn ingeschakeld.
  2. Open de acquisitiesoftware en bepaal de locatie voor het opslaan van bestanden.
  3. Open de voorste lade en plaats de plaat op de plaatverwarming.
  4. Verkrijg een donker frame door op de knop Dark Frame te klikken.
  5. Selecteer Duur (10-30 s) en Framesnelheid van acquisitie (bijvoorbeeld 100 fps; 250 fps voor hogere tijdelijke resolutie) en klik op Acquisitie starten.
  6. Open de analysesoftware en selecteer op het tabblad Importeren/filteren de optie Bladeren naar één bestand of Meerdere naast elkaar plaatsen om een plaat te reconstrueren.
  7. Selecteer Parametermodus (APD of CaTD), voer Afstand per pixel in en gebruik de wizard Put om de locatie van de putten in de afbeelding te bepalen. Klik op Opslaan verwerken om naar het volgende tabblad te gaan.
  8. Open het tabblad ROI's (interessegebieden) en kies ervoor om de ROI's handmatig, automatisch of helemaal niet te gebruiken, waardoor de hele put voor analyse wordt overwogen. Nadat de ROI's zijn geselecteerd, klikt u op de knop Verwerken/Opslaan om naar de volgende stap te gaan. Vink de vakjes Putten verbergen en Alleen gefilterd weergeven aan om de ROI's te visualiseren.
  9. Open het tabblad Analyse en selecteer in de rechterbovenhoek van het scherm elke put of ROI om de nauwkeurigheid van automatische beatdetectie te bevestigen. Beats toevoegen aan of verwijderen uit de traceringen door op Add Beat/Save Beats te drukken of door een Individual Beat te selecteren en op Delete op het toetsenbord te drukken.
  10. Gebruik desgewenst de functie Gemiddelde heatmaps om heatmaps te maken van geselecteerde parameters voor de plaat.
  11. Klik op de knop Time-Space Plot op het tabblad Analyse om gegevens voor elke put of de ROI te visualiseren. Nadat u hebt gecontroleerd of de beatdetectie nauwkeurig is, gaat u naar het tabblad Exporteren en selecteert u Bestandsindeling. Druk op Exporteren en maak een map voor de gegevens waarnaar de gegevens moeten worden geëxporteerd. Ga verder met het openen van gegevensbestanden en voer de gekozen statistische analyseroutine uit.
    OPMERKING: .xlxs-bestanden hebben de voorkeur omdat alle parameters in één bestand worden geëxporteerd; Andere indelingen (.csv of .tsv) genereren één bestand per parameter.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

hiPSC-CM rijping gekenmerkt door fasecontrast en immunofluorescente confocale beeldvorming
De tijdlijn voor ECM-gemedieerde rijping van in de handel verkrijgbare hiPSC-CM's met behulp van MECM-gecoate 96-putplaten is weergegeven in figuur 1A. Deze gegevens worden verzameld met behulp van in de handel verkrijgbare cardiomyocyten die in het laboratorium aankomen als gecryopreserveerde injectieflacons met cellen. Elke injectieflacon bevat >5 × 106 levensvatbare ca...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er zijn verschillende benaderingen voor in vitro cardiotoxiciteitsscreening met behulp van hiPSC-CMs. Een recent artikel over "Best Practices" over het gebruik van hiPSC-CM's presenteerde de verschillende in vitro assays, hun primaire uitlezingen en, belangrijker nog, de granulariteit van elke assay om de menselijke cardiale elektrofysiologische functie te kwantificeren20. Naast het gebruik van membraandoorborende elektroden, wordt de meest directe meting van de menselijke cardia...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TJH is een consultant en wetenschappelijk adviseur van StemBioSys, Inc. TB is een werknemer van StemBioSys, Inc. AMR en JC zijn voormalige consultants van StemBioSys, Inc. TJH, TB, AMR en JC zijn aandeelhouders van StemBioSys, Inc.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk is ondersteund door NIH-subsidies HL148068-04 en R44ES027703-02 (TJH).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.25% Trypsin EDTAGibco25200-056
0.5 mg/mL BSA (7.5 µmol/L)Millipore SigmaA3294
2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L)Millipore SigmaH4034
AdGCaMP6mVector biolabs1909
Albumin humanSigmaA9731-1G
alpha actinin antibodyThermoFisherMA1-22863
B27Gibco17504-044
BlebbistatinSigmaB0560
CalBryte 520AMAAT Bioquest20650
CELLvo MatrixPlus 96wpStemBiosysN/Ahttps://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus
CHIR99021LC Laboratoriesc-6556
Clear Assay medium (fluorobrite)ThermoFisherA1896701Voor adenovirus-transductie
DAPIThermoFisher62248
DMEM:F12Gibco11330-032
FBS (Fetal Bovine Serum)SigmaF4135-500ML
FluoVoltThermoFisherF10488
HBSSGibco14025-092
iCell CM maintenance mediaFUJIFILM/Cellular DynamicsM1003
iCell2 CMsFUJIFILM1434
Incucyte Zoom Sartorius
iPS DF19-9-11T.HWiCell
IsoproterenolMilliporeSigmaCAS-51-30-9
IWP4Tocris5214
L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrateSigmaA8960-5g
L-glutamineGibcoA2916801
LS columnsMiltenyii Biotec130-042-401
MACS Buffer (autoMACS Running Buffer)Miltenyii Biotec130-091-221
MatrigelCorning354234
MitoTracker RedThermoFisherM7512
Nautilus HTS Optical Mapping CuriBiohttps://www.curibio.com/products-overview
Nikon A1R Confocal MicroscopeNikon
nonessential amino acidsGibco11140-050
pre-separation filterMiltenyii Biotec130-041-407
PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit, humanMiltenyii Biotec130-110-188
PulseCuriBiohttps://www.curibio.com/products-overview
Quadro MACS separator (Magnet)Miltenyii Biotec130-091-051
Retinoic acidSigmaR2625
RPMI 1640 Gibco11875-093
RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamine)Gibco22400-089
StemMACS iPS-Brew XFMiltenyii Biotec130-107-086
TnI antibody (pan TnI)Millipore SigmaMAB1691 
Versene (ethylenediaminetetraacetic acid - EDTA solution)Gibco15040-066
Y-27632 dihydrochlorideTocris1254
β-mercaptoethanolGibco21985023

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
  2. Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).
  3. Lee, P., et al. Simultaneous voltage and calcium mapping of genetically purified human induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocyte monolayers. Circulation Research. 110 (12), 1556-1563 (2012).
  4. Fermini, B., Coyne, S. T., Coyne, K. P. Clinical trials in a dish: a perspective on the coming revolution in drug development. SLAS Discovery. 23 (8), 765-776 (2018).
  5. Strauss, D. G., Blinova, K. Clinical trials in a dish. Trends in Pharmacological Sciences. 38 (1), 4-7 (2017).
  6. Blinova, K., et al. Clinical trial in a dish: personalized stem cell-derived cardiomyocyte assay compared with clinical trial results for two QT-prolonging drugs. Clinical and Translational Science. 12 (6), 687-697 (2019).
  7. Blinova,, et al. Comprehensive translational assessment of human-induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes for evaluating drug-induced arrhythmias. Toxicological Sciences. 155 (1), 234-247 (2017).
  8. da Rocha, A. M., et al. hiPSC-CM monolayer maturation state determines drug responsiveness in high throughput pro-arrhythmia screen. Scientific Reports. 7 (1), 13834(2017).
  9. da Rocha, A. M., Creech, J., Thonn, E., Mironov, S., Herron, T. J. Detection of drug-induced Torsades de Pointes arrhythmia mechanisms using hiPSC-CM syncytial monolayers in a high-throughput screening voltage sensitive dye assay. Toxicological Sciences. 173 (2), 402-415 (2020).
  10. Knollmann, B. C. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model. Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).
  11. Lam, C. K., Wu, J. C. Disease modelling and drug discovery for hypertrophic cardiomyopathy using pluripotent stem cells: how far have we come. European Heart Journal. 39 (43), 3893-3895 (2018).
  12. Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).
  13. Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178(2020).
  14. Guo, Y., Pu, W. T. Cardiomyocyte maturation: new phase in development. Circulation Research. 126 (8), 1086-1106 (2020).
  15. Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence:maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).
  16. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  17. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
  18. Herron, T. J., et al. Extracellular matrix-mediated maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiac monolayer structure and electrophysiological function. Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (4), 003638(2016).
  19. Block, T., et al. Human perinatal stem cell derived extracellular matrix enables rapid maturation of hiPSC-CM structural and functional phenotypes. Scientific Reports. 10 (1), 19071(2020).
  20. Gintant, G., et al. Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756(2020).
  21. Cyganek, L., et al. Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes. JCI Insight. 3 (12), 99941(2018).
  22. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
  23. Davis, J., et al. In vitro model of ischemic heart failure using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. JCI Insight. 6 (10), 134368(2021).
  24. Diaz, R. J., Wilson, G. J. Studying ischemic preconditioning in isolated cardiomyocyte models. Cardiovascular Research. 70 (2), 286-296 (2006).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

HiPSC cardiomyocytenmonolaagkweekextracellulaire matrixoptische mappingelektrofysiologische analysecalciumimagingmagnetische cel sorteringdrugrespons testenactiepotentiaalmeting

Gerelateerde artikelen