Method Article

Praktische problemen aanpakken bij op atoomkrachtmicroscopie gebaseerde micro-inkeping op menselijke gewrichtskraakbeenexplantaten

DOI:

10.3791/64371

⸱

October 28th, 2022

 ,  ,  , 
1Laboratory of Cell Biology, Department of Orthopaedic Surgery, University Hospital Tübingen, 2Department of Oral and Maxillofacial Surgery, University Hospital Tübingen

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We presenteren een stapsgewijze aanpak om de meest voorkomende problemen in verband met micro-inkepingen met atoomkrachtmicroscopie te identificeren en aan te pakken. We illustreren de opkomende problemen bij inheemse menselijke gewrichtskraakbeenexplantaten die worden gekenmerkt door verschillende gradaties van door artrose veroorzaakte degeneratie.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zonder twijfel is atoomkrachtmicroscopie (AFM) momenteel een van de krachtigste en nuttigste technieken om micro- en zelfs nanosignalen op biologisch gebied te beoordelen. Zoals bij elke andere microscopische benadering kunnen er echter methodologische uitdagingen ontstaan. Met name de kenmerken van het monster, de monstervoorbereiding, het type instrument en de indruksonde kunnen leiden tot ongewenste artefacten. In dit protocol illustreren we deze opkomende problemen met zowel gezonde als osteoartritische gewrichtskraakbeenexplantaten. Daartoe laten we eerst via een stapsgewijze aanpak zien hoe ex vivo gewrichtskraakbeenschijven kunnen worden gegenereerd, beoordeeld en visueel geclassificeerd volgens verschillende stadia van degeneratie door middel van grote 2D-mozaïekfluorescentiebeeldvorming van de explantaten van het hele weefsel. De belangrijkste kracht van het ex vivo-model is dat het verouderd, inheems, menselijk kraakbeen bevat dat het mogelijk maakt om artrose-gerelateerde veranderingen van vroeg begin tot progressie te onderzoeken. Daarnaast worden ook veelvoorkomende valkuilen bij weefselpreparatie gepresenteerd, evenals de eigenlijke AFM-procedure samen met de daaropvolgende data-analyse. We laten zien hoe basale maar cruciale stappen zoals monstervoorbereiding en -verwerking, topografische monsterkenmerken veroorzaakt door geavanceerde degeneratie en interactie tussen monster en tip van invloed kunnen zijn op het verzamelen van gegevens. Ook nemen we de meest voorkomende problemen in de AFM onder de loep en beschrijven we, waar mogelijk, hoe deze kunnen worden opgelost. Kennis van deze beperkingen is van het grootste belang voor het correct verzamelen, interpreteren en uiteindelijk inbedden van bevindingen in een brede wetenschappelijke context.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Door de steeds kleiner wordende omvang van elektronische apparaten en systemen is de snelle ontwikkeling van micro- en nanogebaseerde technologie en apparatuur in een stroomversnelling geraakt. Een van die apparaten is atoomkrachtmicroscopie (AFM), die biologische oppervlakken kan scannen en topografische of biomechanische informatie kan ophalen op zowel nano- als micrometerschaal 1,2. Een van de enorme functies is dat deze tool kan worden gebruikt als een micro- en een nano-indenter om informatie te verkrijgen over de mechanische eigenschappen van verschillende biologische systemen 3,4,5,6. De gegevens worden verzameld door fysiek contact met het oppervlak via een mechanische sonde, die zo klein kan zijn als ongeveer 1 nm aan het uiteinde7. De resulterende vervorming van het monster wordt vervolgens weergegeven op basis van de indrukdiepte van de uitkragende punt en de kracht die op het monsterwordt uitgeoefend 8.

Artrose (OA) is een langdurige degeneratieve chronische ziekte die wordt gekenmerkt door verslechtering van het gewrichtskraakbeen in de gewrichten en omliggende weefsels, wat kan leiden tot volledige blootstelling van de botoppervlakken. De last van artrose is aanzienlijk; Momenteel lijdt de helft van alle vrouwen en een derde van alle mannen van 65 jaar en ouder aan artrose9. Trauma's, obesitas en de daaruit voortvloeiende veranderde biomechanica van het gewricht10 bepalen de gewrichtskraakbeendegeneratie, die wordt gezien als een gemeenschappelijk eindresultaat. De baanbrekende studie van Ganz et al. stelde dat de vroege stappen van het artroseproces de biomechanische eigenschappen van kraakbeen11 kunnen omvatten, en sindsdien hebben onderzoekers deze hypothese bevestigd12. Evenzo wordt algemeen aanvaard dat de biomechanische eigenschappen van het weefsel functioneel worden georkestreerd door de ultrastructurele organisatie en door overspraak tussen cellen en celmatrixen. Elke verandering kan een dramatische invloed hebben op het algehele biomechanische functioneren van het weefsel13. Tot op heden is de diagnose van artrose klinisch en gebaseerd op gewone filmradiografie14. Deze benadering is tweezijdig: ten eerste maakt het ontbreken van een gedefinieerde degeneratieve afkapdrempel om de diagnose artrose te formuleren de aandoening moeilijk te kwantificeren, en ten tweede missen beeldvormingsmethoden gevoeligheid en standaardisatie en kunnen ze geen gelokaliseerde kraakbeenschade detecteren15,16,17. Daartoe heeft de beoordeling van de mechanische eigenschappen van het kraakbeen het doorslaggevende voordeel dat het een parameter beschrijft die in de loop van artrose verandert, ongeacht de etiologie van de ziekte, en die in een zeer vroeg stadium een directe invloed heeft op de weefselfunctionaliteit. Indrukkingsinstrumenten meten de kracht waarmee het weefsel zich tegen de indrukking verzet. Dit is in feite geen nieuw concept; De vroegste studies dateren uit de jaren 1980 en 1990. In deze periode suggereerden talrijke studies dat indrukkingsinstrumenten die zijn ontworpen voor de arthroscopische metingen van gewrichtskraakbeen zeer geschikt zouden kunnen zijn om degeneratieve veranderingen in het kraakbeen te detecteren. Zelfs 30 jaar geleden konden sommige onderzoeken aantonen dat indrukkingsinstrumenten in vivo veranderingen in het kraakbeenoppervlak tijdens weefseldegeneratie konden detecteren door drukstijfheidsmetingen uit te voeren tijdens artroscopie18,19,20.

AFM-inkeping (AFM-IT) van het gewrichtskraakbeen geeft informatie over een cruciale mechanische eigenschap van het weefsel, namelijk stijfheid. Dit is een mechanische parameter die de relatie beschrijft tussen een toegepaste, niet-destructieve belasting en de resulterende vervorming van het ingesprongen weefselgebied21. AFM-IT is in staat gebleken om leeftijdsafhankelijke veranderingen in stijfheid in macroscopisch onaangetaste collageennetwerken te kwantificeren, waardoor onderscheid wordt gemaakt tussen de pathologische veranderingen die verband houden met het begin van artrose (graad 0 op de Outerbridge-schaal in gewrichtskraakbeen)22. We hebben eerder aangetoond dat AFM-IT's, op basis van ruimtelijke chondrocytenorganisatie als een op beelden gebaseerde biomarker voor vroege kraakbeendegeneratie, niet alleen de vroegste degeneratieve mechanische veranderingen kunnen kwantificeren, maar ook daadwerkelijk kunnen lokaliseren. Deze bevindingen zijn al bevestigd door anderen23,24. Daarom fungeert AFM-IT als een interessant instrument om vroege degeneratieve veranderingen te diagnosticeren en te identificeren. Deze veranderingen kunnen al op cellulair niveau worden gemeten, waardoor het begrip van het pathofysiologische proces van artrose opnieuw wordt vormgegeven.

In dit protocol demonstreren we een volledige histologische en biomechanische beoordelingsprocedure van gewrichtskraakbeenexplantaten, van de voorbereiding van het inheemse kraakbeenexplantatie tot AFM-gegevensverzameling en -verwerking. Door middel van een stap-voor-stap aanpak, laten we zien hoe het articulair kraakbeenweefsel volgens verschillende stadia van degeneratie kan worden gegenereerd, gesorteerd en visueel geclassificeerd door middel van 2D grote mozaïekbeeldvorming, gevolgd door micro-AFM inkepingen.

Hoewel AFM-IT momenteel een van de meest gevoelige instrumenten is om biomechanische veranderingen in kraakbeen te meten7, heeft het, net als elke andere instrumentele techniek, beperkingen en praktische eigenaardigheden25 die kunnen leiden tot foutieve gegevensverzameling. Daartoe onderwerpen we de meest voorkomende problemen die zich voordoen tijdens AFM-metingen van de kraakbeenexplantaten en beschrijven we, waar mogelijk, hoe deze te minimaliseren of te overwinnen. Deze omvatten topografische aspecten van de steekproeven en de moeilijkheden om hen in een AFM-compatibele omgeving te stabiliseren, fysieke eigenaardigheden van het oppervlak van het weefsel, en de daaruit voortvloeiende moeilijkheden bij het uitvoeren van AFM-metingen op dergelijke oppervlakten. Er worden ook voorbeelden gegeven van foutieve kracht-afstandscurves, waarbij de nadruk wordt gelegd op de omstandigheden die deze kunnen veroorzaken. Bijkomende beperkingen die inherent zijn aan de geometrie van de cantilevertip en het gebruik van het Hertz-model voor de data-analyse worden ook besproken.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er werden femurcondylen gebruikt die waren verzameld bij patiënten die een totale knieartroplastiek ondergingen in het Universitair Ziekenhuis van Tübingen, Duitsland. Alleen gewrichtskraakbeenmonsters van patiënten met degeneratieve en posttraumatische gewrichtspathologieën werden in deze studie opgenomen. Vóór de start van het onderzoek werd goedkeuring verkregen van departementale, institutionele en lokale ethische commissies (projectnr. 674/2016BO2). Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd ontvangen van alle patiënten vóór deelname.

OPMERKING: Een stroomdiagram van de experimentstappen in chronologische volgorde wordt gegeven in figuur 1.

1. Weefselbewerking en aanmaak van kraakbeenschijven

  1. Weefsel preparatie
    1. Plaats de kraakbeenmonsters na postoperatieve resectie in een container gevuld met Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 5% (v/v) penicilline-streptomycine. Zorg ervoor dat de monsters volledig ondergedompeld zijn in het medium. De duur tussen chirurgische resectie en verdere verwerking van het kraakbeen mag niet langer zijn dan 24 uur. Zorg ervoor dat de monsters tijdens de hele verwerking volledig zijn ondergedompeld in media om uitdroging van het monster te voorkomen.
    2. Snijd het kraakbeen weg van het bot met behulp van een scalpel.
  2. Generatie van kraakbeenschijven
    1. Genereer kraakbeenschijven met een diameter van 4 mm met behulp van een biopsiepons.
      OPMERKING: Het is belangrijk om de delen van de condylus te selecteren en te verwijderen waar de dikte van de kraakbeenlaag groter is dan 1 mm. Dit kan problematisch zijn, vooral rond dragende zones, waar de kraakbeenlaag doorgaans zijn dikte verliest als gevolg van slijtageprocessen of degeneratie.
    2. Plaats de eerder gegenereerde kraakbeenschijven van 4 mm op een op maat gemaakte snij-inrichting en zet de kraakbeenschijven vast en houd ze stabiel met behulp van een spatel. Bij het plaatsen van de kraakbeenschijven op de snij-inrichting moet voorzichtig worden gehandeld. Plaats de monsters zo dat de bovenste laag van het kraakbeen (de oppervlakkige zone van het gewrichtskraakbeen) niet naar het mes is gericht
    3. Snijd de kraakbeenschijven door met een scheermesje. Zo worden schijfvormige kraakbeenmonsters van 4 mm x 1 mm gegenereerd. Om uitdroging van het monster te voorkomen, moet u zo snel mogelijk weefsel snijden.
    4. Verzamel elke schijf met behulp van een spatel en plaats de gegenereerde kraakbeenschijven in buisjes van 1,5 ml met 1 ml DMEM aangevuld met 5% (v/v) penicilline-streptomycine. Plaats ongeveer 15 schijven in één buis.
  3. Cryotoomdoorsnede van de kraakbeenschijven (voor loodrechte plakjes)
    OPMERKING: Deze stap is optioneel en kan worden gebruikt als een zijaanzichtvisualisatie van de cellulaire patroonverdeling binnen de kraakbeenschijven gewenst is. Het kan worden gebruikt als verificatiemethode, aangezien de verdeling van het cellulaire patroon een 3D-kenmerk is van gewrichtskraakbeen26. Optische doorsnede en 3D-reconstructies van de gehele kraakbeenschijven met behulp van een confocale microscoop kunnen ook worden gebruikt, waardoor het niet meer nodig is om de monsters te doorsnijden zoals beschreven in het protocol.
    1. Bedek de kraakbeenschijf met in water oplosbaar inbeddingsmedium en plaats deze op de rand op de cryotoomknop (met het oppervlak van de schijf loodrecht op het oppervlak van de knop). In het cryotoomapparaat bevriest het inbeddingsmedium bij lage temperaturen.
    2. Gebruik een standaard cryotoom om het weefsel zijwaarts in te delen met een dikte van 60 μm totdat het midden van de schijf is bereikt (d.w.z. wanneer cryosecties een lengte van 4 mm bereiken) en verzamel de plakjes. Door de schijf loodrecht te doorsnijden, kunnen alle zones van het kraakbeen (oppervlakkig, midden en diep) worden gevisualiseerd.
    3. Verzamel de secties op een glasplaatje en verwijder het in water oplosbare inbeddingsmedium door drie keer te wassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).

2. Sorteren van kraakbeenschijven als functie van het cellulaire ruimtelijke patroon

  1. Kleuring van de schijfvormige kraakbeenmonsters
    1. Plaats één kraakbeenschijf (sectie 1.2) in elk putje van een plaat met 96 putjes en voeg 130 μL celdoorlatende fluorescentiekleurstof in een verdunning van 1:1.000 toe aan elk putje.
    2. Inspecteer de hele plaat visueel en zorg ervoor dat er slechts één schijf in elke put wordt geplaatst. Incubeer de plaat gedurende 30 minuten in de standaard celkweekincubator bij 37 °C.
  2. Kleuring van de 60 μm kraakbeenplakken
    1. Plaats de kraakbeenschijfsecties (sectie 1.3) voorzichtig met behulp van een pincet op glazen microscoopglaasjes.
    2. Bedek de kraakbeensecties met montagemedium met nucleaire DAPI-tegenkleuring en plaats voorzichtig dekglaasjes die geschikt zijn voor fluorescentiemicroscopie.
    3. Verzegel de randen van elk dekglaasje met gewone transparante nagellak en laat 3 minuten drogen.
  3. Sorteren en afbeelden van kraakbeen van bovenaf en zijaanzicht
    OPMERKING: Elke schijf moet onder een fluorescerende microscoop worden onderzocht. Het doel van deze stap is om de schijven te sorteren op basis van hun overheersende cellulaire patroon (enkele strings, dubbele strings, kleine clusters, grote clusters of diffuus).
    1. Plaats de plaat met 96 putjes op de plaathouder van de fluorescentiemicroscoop.
    2. Selecteer het geschikte fluorescentiefilter van Em 495 nm/Ex 515 nm (voor top-down beeldvorming van de kraakbeenschijven bereid in punt 2.1) of Em 358 nm/Ex 461 nm (voor zijaanzichtbeeldvorming van de kraakbeensecties voorbereid in punt 2.2) en het 10x-objectief.
      OPMERKING: Met behulp van het 10x-objectief kan de hele omtrek van de schijf worden geïnspecteerd en kunnen monsters met inhomogene of onjuiste kleuring worden uitgesloten. Het gebruik van alleen het bovenaanzicht kan echter leiden tot de perceptie van veranderingen in de cellulaire organisatie als gevolg van analyse van de diepere weefsellagen die door oppervlakkige erosie zichtbaar zijn gemaakt voor top-down observatie. Een stijgende snaar die de collageenarcades volgt, kan bijvoorbeeld worden waargenomen als een enkele cel of verspreide cellen (diffuus patroon)26. Als gevolg hiervan moeten beide zijden van de schijven worden geïnspecteerd om een goede selectie van het cellulaire patroon te garanderen.
    3. Bepaal visueel het cellulaire patroon dat in elke kraakbeenschijf wordt weergegeven. Het is onwaarschijnlijk dat een schijf slechts één type cellulair patroon zal hebben. Voor het gedeelte van de schijf waar de opstelling van de chondrocyten niet overeenkomt met het patroon van belang, accepteer de monsters alleen als het ongewenste patroon zich aan de uiterste rand bevindt, waar geen AFM-metingen plaatsvinden (d.w.z. tot 0,5 mm van de schijfrand), en zorg ervoor dat dit niet meer dan 10% van het totale oppervlak van de schijf27 bedraagt, 28. okt.
  4. Beeldacquisitie van de gehele kraakbeenschijven
    1. Selecteer het 10x objectief van de microscoop en plaats het onder het vooraf geselecteerde putje met daarin een individuele kraakbeenschijf. Focus op de schijf om het cellulaire patroon te zien.
    2. Selecteer de Navigator-functie om een overzicht van de hele put te krijgen. Gebruik de linkermuisknop en sleep om naar een andere podiumpositie te navigeren. Zoom met het muiswiel in en uit.
      OPMERKING: Op dit punt kan een voorbeeld van de put met het volledige monster worden bekeken door achtereenvolgens op elk interessegebied te dubbelklikken.
    3. Selecteer een vierkant dat het interessegebied omvat dat moet worden gescand; Op dit punt worden alle afzonderlijke tegels waaruit het mozaïek bestaat zichtbaar.
    4. Pas de belichting/lichtintensiteit aan zodat de cellen duidelijk vanaf de achtergrond kunnen worden gevisualiseerd. Op dit punt is de helderheid/het contrast van de afbeelding aangepast voor alle tegels en kan deze niet langer voor elke tegel afzonderlijk worden aangepast.
      OPMERKING: Aangezien de cellen aan de rand van de schijf vaak een hoger fluorescentiesignaal uitzenden dan de cellen in het midden, moeten de instellingen voor belichting/lichtintensiteit worden aangepast.
      1. Om te beoordelen of de belichtingstijd geschikt is voor een bepaald kanaal, onderzoekt u de verdeling van het signaal in het histogram. Met behulp van het automatische belichtingsmechanisme in de beeldsoftware van de microscoop kunt u alle cellen in de schijf visualiseren.
    5. Selecteer de optie Focus Map Point van de software en selecteer vervolgens elke afzonderlijke tegel door met de linkermuisknop in het midden ervan te klikken.
    6. Selecteer de optie Focus Map. Er wordt een venster weergegeven met alle eerder geselecteerde tegels. Dubbelklik op een tegel in de lijst om deze weer te geven en in de juiste focus te brengen.
    7. Klik op Z instellen om het focusplan op te slaan en door te gaan naar de volgende tegel. Nadat u het focusplan voor elke afzonderlijke tegel hebt aangepast, begint u met het verzamelen van afbeeldingen door op Scan starten te drukken.
      1. Als de scan donkerdere horizontale en/of verticale balken weergeeft, kan dit te wijten zijn aan onjuiste en ongelijkmatige verlichting van de afzonderlijke frames. Los dit op door gebruik te maken van de optie Linked Shading die in de software is opgenomen voorafgaand aan de daadwerkelijke scan.
    8. Bewaar, exporteer en annoteer de afbeeldingen op de juiste manier.

3. Biomechanische benadering van kraakbeenexplantaten

  1. Monstervoorbereiding voor AFM-metingen
    1. Bevestig elke vooraf geselecteerde kraakbeenschijf met een cellulair patroon (sectie 2) in petrischaaltjes met behulp van biocompatibele lijm. Breng voldoende voorbeeldlijm aan op de boven-, onder-, linker- en rechterkant van de schijf.
    2. Bedek de schijven met 2,5 ml L-15 medium van Leibovitz zonder L-glutamine. Voeg het Leibowitz-medium voorzichtig toe aan de monsters om te voorkomen dat het monster loskomt van het oppervlak als gevolg van golven die door het medium worden gecreëerd.
  2. Laden van de monsters in de AFM
    1. Plaats de petrischaal in de monsterhouder van het AFM-apparaat en zet de petrischaalverwarmer aan die is ingesteld op 37 °C. Laat het weefselkweekschaaltje de gewenste temperatuur bereiken. Dit wordt gedaan om mogelijke artefacten uit te sluiten die worden veroorzaakt door temperatuurschommelingen.
  3. AFM-cantilever kalibratie
    1. Initialiseer de software-installatie zoals eerder beschreven door Danalache et al.29.
    2. Kies een geschikte cantileverhouder met glazen blok voor vloeistofmetingen en plaats deze voorzichtig op de AFM-kop. Een vergrendelingsmechanisme beveiligt het glasblok in de AFM-kop. Zorg ervoor dat het reflecterende oppervlak van het glasblok recht en evenwijdig is aan de AFM-houder.
    3. Plaats de draagarm voorzichtig op het oppervlak van de sledehouder met glazen blok. De cantilever zelf moet op het gepolijste optische vlak rusten, in het midden van het glasblok.
    4. Plaats voorzichtig een siliconen rok (siliconenmembraan) op de basis van de cantileverhouder om gemiddelde condensatie in de AFM-kop te voorkomen.
    5. Laat de cantilever in stappen van 100 μm met behulp van de stappenmotorfunctie zakken totdat deze volledig in het medium is ondergedompeld.
    6. Voer een scannerbenadering uit met de naderingsparameters beschreven door Danalache et al.29. Trek de uitkraging 100 μm in zodra de bodem van de petrischaal is bereikt.
    7. Kalibreer de cantilever met behulp van de exacte stappen en voer de parameters uit die zijn beschreven door Danalache et al.29. Aan het einde van de kalibratie wordt de verticale afbuiging opgeslagen en weergegeven in newton (N) krachteenheden in plaats van volt (V) - de eenheid van de oorspronkelijke registratie door de fotodiodedetector. In de experimenten hier resulteerde een instelpunt van 4,47 nN na kalibratie.
    8. Trek de cantilever met behulp van de stappenmotorfunctie in tot 1.000 μm.
  4. Identificeren van de gewenste kraakbeenmeetlocatie onder de AFM
    OPMERKING: Vanwege de dikte van 1 mm van de kraakbeenschijven is de cantilever niet zichtbaar in het gezichtsveld tijdens het navigeren over het monster.
    1. Gebruik de CCD-camera van de microscoop om de cantilever te identificeren. De AFM-cantilever moet in een monstervrij gebied van de petrischaal worden geplaatst.
    2. Start een scannerbenadering met de cantilever op een schoon, monstervrij gebied van de petrischaal, met dezelfde parameters beschreven door Danalache et al.29.
    3. Trek de cantilever verder 1.5 mm weg van de onderkant van de plaat met de stappenmotorbediening. Deze stap is cruciaal om een directe botsing tussen de cantilever en het monster te voorkomen.
    4. Schakel over van helderveld- naar fluorescentieweergave en identificeer visueel de bovenkant van de schijf.
    5. Verplaats de AFM-monsterhouder precies 2 mm naar het midden van de schijf. Dit punt wordt beschouwd als het centrum van de kraakbeenschijf.
    6. Voer een scannerbenadering uit en zodra het oppervlak van de kraakbeenschijf is bereikt, trekt u de cantilever 100 μm in.
  5. Kracht-afstandscurve-metingen
    1. Focus op de cellen die zich op de gewenste meetplaats bevinden. Klik op de knop Uitvoeren om de metingen en het genereren van kracht-afstandscurven in de beoogde positie te starten.
    2. Verkrijg vijf kracht-afstandscurven op elke meetplaats. Trek de uitkraging 500 μm in en verplaats de uitkraging naar de volgende meetplaats.
      OPMERKING: Het terugtrekken van de cantilever is een cruciale stap, aangezien het oppervlak van de kraakbeenschijf niet homogeen is en onregelmatigheden vertoont. Een hoge heuvel op het oppervlak van het monster kan leiden tot een dramatische botsing, wat kan leiden tot ongewenste schade aan de uitkragingspunt/monster. We raden aan om minimaal vijf verschillende meetlocaties verspreid over het oppervlak van de schijf te selecteren en op elke locatie minimaal vijf kracht-afstandscurven te verkrijgen.
    3. Inspecteer de kracht-afstandscurven en sla ze op.
  6. Schatting van Young's moduli met behulp van het Hertz fit-model
    1. Open de gegenereerde kracht-afstandscurven die moeten worden geanalyseerd (.jpk-bestand) in de gegevensanalysesoftware met behulp van de optie Een batch spectroscopiecurven openen .
    2. Selecteer het Hertz fit-model en selecteer vervolgens de optie Elasticiteitspasvorm .
      1. De optie elasticiteitsaanpassing voert automatisch de volgende berekeningen uit op de geselecteerde kracht-afstandscurve: berekent de basislijn en trekt deze af van de hele curve om de basislijnverschuiving te verwijderen (de basislijn wordt teruggebracht naar nul op de y-as); bepaalt het contactpunt door het punt te detecteren waar de kracht-afstandscurve de nul-krachtlijn kruist (het contactpunt wordt op nul gezet op de x-as); berekent de scheiding tussen de punt en het monster (het hoogtesignaal van de piëzo dat rekening houdt met de buiging van de cantilever wordt afgetrokken); en past de kracht-afstandscurve automatisch aan het geselecteerde model aan. Indien gewenst kan elk van deze stappen ook onafhankelijk worden uitgevoerd.
    3. Aanpassen met behulp van de volgende pasvormparameters: Poisson-verhouding van 0,5 en de juiste vrijdragende tipradius.
      NOTITIE: Bij gebruik van een cantilever met een bolvormige cantilever-tip moet het Hertz fit-model worden gebruikt. De cantilever die in dit onderzoek werd gebruikt, had een bolvormige punt met een straal van 5 μm. We raden aan om de kracht-afstandscurve aan te passen totdat de maximaal uitgeoefende kracht is bereikt (setpoint).
    4. Controleer visueel de pasvorm van de kracht-afstandscurve om de juistheid te garanderen. Deze stap moet worden uitgevoerd voor elk van de geanalyseerde kracht-afstandscurven.
  7. Bepaling van de indrukdiepte
    OPMERKING: Afhankelijk van de gebruikte data-analysetool kan dit proces verschillen. De onderzoeker kan de indrukdiepte eenvoudig aflezen door een reeks stappen te volgen die zijn opgenomen in het data-analyseprogramma.
    1. Open elk van de gegenereerde kracht-afstandscurven in de data-analysesoftware en selecteer het Hertz fit-model als het analyseproces.
    2. Pas de optie Basislijnverschuiving aftrekken toe om de verticale afbuigingsas (y-as) op nul te zetten en selecteer de functie Verschuiving + kantelen .
    3. Gebruik de functie Contactpunt zoeken om het contactpunt automatisch te identificeren, dat automatisch naar een x-coördinaat van nul wordt gebracht.
    4. Trek de afstand die uitsluitend rekening houdt met de vrijdragende doorbuiging af van de ruwe piëzohoogte tijdens de inkeping met behulp van de functie Verticale tippositie .
    5. Selecteer de optie Elasticiteit aanpassen om de verwerkte kracht-afstandscurve weer te geven en selecteer het gebied van de grafiek zodat het wordt uitgelijnd met de meest negatieve waarde op de verticale tippositie-as (x-as ).
    6. Lees en documenteer de inspringing in het vak X Min op het tabblad Parameter. Sla de resultaten op en documenteer ze.

4. Statistische analyse

  1. Open de statistische software. Selecteer Nieuwe gegevensset in het vervolgkeuzemenu.
  2. Open het tabblad Variabele weergave nadat u het gegevenssetbestand hebt geselecteerd. Definieer de numerieke variabelen voor elke categorie van cellulaire patronen: enkele strings = SS, dubbele strings = DS, kleine clusters = SC, grote clusters = BC, diffuus en de Young's moduli.
  3. Voer op het tabblad Gegevensweergave de gemeten Young's moduli-gegevens in voor elk van de overeenkomstige cellulaire patrooncategorieën. Analyseer de gegevensdistributie door Analyseren te selecteren in de menubalk en vervolgens Verkennende gegevensanalyse.
  4. Selecteer Young's Moduli als de afhankelijke variabele en Cellulair Patroon als de factorlijst. Een boxplot dat wordt gebruikt voor de resultatensectie wordt weergegeven tussen de resultaten in het uitvoerbestand.
  5. Als u een statistische analyse wilt uitvoeren, kiest u Afhankelijke steekproeven in de sectie Niet-parametrische test van het tabblad Analyseren in de menubalk. Selecteer Young's Moduli als Testvelden en Cellulair Patroon als Groepen onder het tabblad Velden. Druk op Uitvoeren.
    OPMERKING: De resultaten worden weergegeven in het uitvoerbestand. Voor de statistische analyse wordt een Friedman-test uitgevoerd.
  6. Neem de p-waarden van de niet-parametrische test op in de boxplot die in stap 4.4 is gemaakt. Sla de resultaten op door in de menubalk op Bestand te klikken en Opslaan te selecteren.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van een zelfgemaakt snijapparaat waren we in staat om kleine (4 mm x 1 mm) kraakbeenschijven te explanteren en te genereren uit verse menselijke condylen met een enkel cellulair ruimtelijk patroon30 van enkele snaren (SS, Figuur 2A), dubbele snaren (DS), kleine clusters (SC), grote clusters (BC; Figuur 2A) en diffuus (Figuur 2B). Een representatieve kraakbeenexplantatie is afgebeeld in

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Als progressieve en multifactoriële ziekte veroorzaakt artrose structurele en functionele veranderingen in het gewrichtskraakbeen. In de loop van artrose gaan stoornissen in mechanische kenmerken gepaard met structurele en biochemische veranderingen aan het oppervlak van het gewrichtskraakbeen27,31. De vroegste pathologische gebeurtenissen die optreden bij artrose zijn proteoglycaandepletie in combinatie met verstoring van het collageennetwerk32...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken de orthopedisch chirurgen van de afdeling Orthopedische Chirurgie van het Universitair Ziekenhuis van Tübingen voor het ter beschikking stellen van de weefselmonsters.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Amphotericin BMerck KGaA, Darmstadt, Germany1397-89-3
Atomic force microscop (AFM) head CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlin, GermanyJPK00518
Biocompatible sample glue Bruker Nano GmbH, Berlin, GermanyH000033
Calcein AMCayman, Ann Arbor, Michigan, USA14948Celmembraanachtige steriele vlek, gebruikt voor sortering van kraakbeenschijf - beeldvorming van bovenaf
CantileverBruker Nano GmbH, Berlin, GermanySAA-SPH-5UMFrequentie Nom: 30KHz, k: 0.2N/m, lengte nom: 115μm, breedte nom: 40μm,  geometrie: rechthoekige, cilindrische punt met een eindradius van 5μm
Cartilage ctting device Zelf gemaakt n/aSnijplastic apparaat met voorgedefinieerde gaten van 4mmx1mm
CDD camera geïntegreerd in de AFMThe Imaging Source Europe GmbH, Bremen, GermanyDFK 31BF03
CDD camera geïntegreerd in de fluorescentiemicroscoopLeica Biosystems, Wetzlar, GermanyDFC3000G
CryotomeLeica Biosystems, Wetzlar, GermanyCM3050S 
Data Processing Software voor de AFMBruker Nano GmbH, Berlin, Germanyn/aVersie 5.0.86,  kan gratis worden gedownload van de volgende website https://customers.jpk.com
Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany41966052
Fluorescentiemicroscoop (Leica DMi8)Leica Biosystems, Wetzlar, Germany11889113
Glasblok cantilever houderBruker Nano GmbH, Berlin, GermanySP-90-05Extra lange glasblok met hoekige vlakken, speciaal ontworpen voor gebruik met de JPK PetriDishHeaterTM (Bruker).
Omgekeerde fasecontrastmicroscoop (geïntegreerd in de AFM)AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, GermanyL201306_03
Leibovitz's L-15 medium zonder L-glutamine Merck KGaA, Darmstadt, GermanyF1315
Microscoop glasplatenSigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USACLS294775X50
Montagemedium met DAPIibidi GmbH, Gräfelfing, Germany50011Montage media met nucleair DAPI (4′,6-diamidino-2-fenylindole) tegenkleuring gebruikt voor zijbeeldvorming van kraakbeenschijven
Penicilline-StreptomycineSigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USAP4333
Petrischaal verwarmer geassocieerd met AFM (Petrischaal Heater)Bruker Nano GmbH, Berlin, GermanyT-05-0117
SchelpFeather Medical Products, Osaka, Japan2023-01
Siliconen rokBruker Nano GmbH, Berlin, Germanyn/aBeschermende siliconenmembraan (D55x0.25) die op de basis van de basis van de glasblok wordt geplaatst om condens van het medium in de AFM-kop te voorkomen.
Statistisch programma - SPSSIBM, Armonk, New York, USASPSS Statistics 22Vesion 280.0.0.0 (190)
Weefselcultuur schalen TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, SwitzerlandTPP93040
Tissue-tek O.C.T. CompoundSakura Finetek, Alphen aan den Rijn, NetherlandsSA6255012Wateroplosbaar inbeddingsmedium 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Allison, D. P., Mortensen, N. P., Sullivan, C. J., Doktycz, M. J. Atomic force microscopy of biological samples. Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 2 (6), 618-634 (2010).
  2. Deng, X., et al. Application of atomic force microscopy in cancer research. Journal of Nanobiotechnology. 16 (1), 102(2018).
  3. Radmacher, M. Studying the mechanics of cellular processes by atomic force microscopy. Methods in Cell Biology. 83, 347-372 (2007).
  4. Charras, G. T., Horton, M. A. Single cell mechanotransduction and its modulation analyzed by atomic force microscope indentation. Biophysical Journal. 82 (6), 2970-2981 (2002).
  5. Rabinovich, Y., et al. Atomic force microscopy measurement of the elastic properties of the kidney epithelial cells. Journal of Colloid and Interface Science. 285 (1), 125-135 (2005).
  6. Dufrêne, Y. F. Using nanotechniques to explore microbial surfaces. Nature Reviews Microbiology. 2 (6), 451-460 (2004).
  7. Cykowska, A., Danalache, M., Bonnaire, F. C., Feierabend, M., Hofmann, U. K. Detecting early osteoarthritis through changes in biomechanical properties - A review of recent advances in indentation technologies in a clinical arthroscopic setup. Journal of Biomechanics. 132, 110955(2022).
  8. Gavara, N. A beginner's guide to atomic force microscopy probing for cell mechanics. Microscopy Research and Technique. 80 (1), 75-84 (2017).
  9. Fuchs, J., Kuhnert, R., Scheidt-Nave, C. 12-Monats-Prävalenz von Arthrose in Deutschland. Journal of Health Monitoring. 2, 55-60 (2017).
  10. Felson, D. T. Osteoarthritis of the knee. New England Journal of Medicine. 354 (8), 841-848 (2006).
  11. Ganz, R., Leunig, M., Leunig-Ganz, K., Harris, W. H. The etiology of osteoarthritis of the hip. Clinical Orthopaedics and Related Research. 466 (2), 264-272 (2008).
  12. Saxby, D. J., Lloyd, D. G. Osteoarthritis year in review 2016: Mechanics. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (2), 190-198 (2017).
  13. Buckwalter, J. A., Mankin, H. J. Articular cartilage: Degeneration and osteoarthritis, repair, regeneration, and transplantation. Instructional Course Lectures. 47, 487-504 (1998).
  14. Braun, H. J., Gold, G. E. Diagnosis of osteoarthritis: Imaging. Bone. 51 (2), 278-288 (2012).
  15. Guermazi, A., Roemer, F. W., Burstein, D., Hayashi, D. Why radiography should no longer be considered a surrogate outcome measure for longitudinal assessment of cartilage in knee osteoarthritis. Arthritis Research & Therapy. 13 (6), 247(2011).
  16. Guermazi, A., et al. Different thresholds for detecting osteophytes and joint space narrowing exist between the site investigators and the centralized reader in a multicenter knee osteoarthritis study--Data from the Osteoarthritis Initiative. Skeletal Radiology. 41 (2), 179-186 (2012).
  17. Bedson, J., Croft, P. R. The discordance between clinical and radiographic knee osteoarthritis: A systematic search and summary of the literature. BMC Musculoskeletal Disorders. 9 (1), 116(2008).
  18. Dashefsky, J. H. Arthroscopic measurement of chondromalacia of patella cartilage using a microminiature pressure transducer. Arthroscopy. 3 (2), 80-85 (1987).
  19. Berkenblit, S. I., Frank, E. H., Salant, E. P., Grodzinsky, A. J. Nondestructive detection of cartilage degeneration using electromechanical surface spectroscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 116 (4), 384-392 (1994).
  20. Appleyard, R. C., Swain, M. V., Khanna, S., Murrell, G. A. The accuracy and reliability of a novel handheld dynamic indentation probe for analysing articular cartilage. Physics in Medicine and Biology. 46 (2), 541-550 (2001).
  21. Hsieh, C. H., et al. Surface ultrastructure and mechanical property of human chondrocyte revealed by atomic force microscopy. Osteoarthritis and Cartilage. 16 (4), 480-488 (2008).
  22. Stolz, M., et al. Early detection of aging cartilage and osteoarthritis in mice and patient samples using atomic force microscopy. Nature Nanotechnology. 4 (3), 186-192 (2009).
  23. Tschaikowsky, M., et al. Proof-of-concept for the detection of early osteoarthritis pathology by clinically applicable endomicroscopy and quantitative AI-supported optical biopsy. Osteoarthritis and Cartilage. 29 (2), 269-279 (2021).
  24. Tschaikowsky, M., et al. Hybrid fluorescence-AFM explores articular surface degeneration in early osteoarthritis across length scales. Acta Biomaterialia. 126, 315-325 (2021).
  25. Eaton, P., Batziou, K. Artifacts and Practical Issues in Atomic Force Microscopy. Atomic Force Microscopy: Methods and Protocols. Santos, N. C., Carvalho, F. A. , Springer. New York, NY. 3-28 (2019).
  26. Danalache, M., et al. Exploration of changes in spatial chondrocyte organisation in human osteoarthritic cartilage by means of 3D imaging. Scientific Reports. 11, 9783(2021).
  27. Danalache, M., et al. Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organisation in osteoarthritic cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).
  28. Danalache, M., Erler, A. L., Wolfgart, J. M., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Biochemical changes of the pericellular matrix and spatial chondrocyte organization-Two highly interconnected hallmarks of osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 38 (10), 2170-2180 (2020).
  29. Danalache, M., Tiwari, A., Sigwart, V., Hofmann, U. K. Application of atomic force microscopy to detect early osteoarthritis. Journal of Visualized Experiments. (159), e61041(2020).
  30. Rolauffs, B., et al. Proliferative remodeling of the spatial organization of human superficial chondrocytes distant from focal early osteoarthritis. Arthritis and Rheumatism. 62 (2), 489-498 (2010).
  31. Wilusz, R. E., DeFrate, L. E., Guilak, F. Immunofluorescence-guided atomic force microscopy to measure the micromechanical properties of the pericellular matrix of porcine articular cartilage. Journal of The Royal Society Interface. 9 (76), 2997-3007 (2012).
  32. Guilak, F., Ratcliffe, A., Lane, N., Rosenwasser, M. P., Mow, V. C. Mechanical and biochemical changes in the superficial zone of articular cartilage in canine experimental osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 12 (4), 474-484 (1994).
  33. Billinghurst, R. C., et al. Enhanced cleavage of type II collagen by collagenases in osteoarthritic articular cartilage. The Journal of Clinical Investigation. 99 (7), 1534-1545 (1997).
  34. Wu, P. J., et al. Detection of proteoglycan loss from articular cartilage using Brillouin microscopy, with applications to osteoarthritis. Biomedical Optics Express. 10 (5), 2457-2466 (2019).
  35. Loparic, M., et al. Micro- and nanomechanical analysis of articular cartilage by indentation-type atomic force microscopy: Validation with a gel-microfiber composite. Biophysical Journal. 98 (11), 2731-2740 (2010).
  36. Moshtagh, P. R., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. The elastic modulus of articular cartilage at nano-scale and micro-scale measured using indentation type atomic force microscopy. Osteoarthritis and Cartilage. 22, 359-360 (2014).
  37. Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis. Journal of Biomechanics. 19, 109409(2019).
  38. Houtman, E., et al. Human osteochondral explants: Reliable biomimetic models to investigate disease mechanisms and develop personalized treatments for osteoarthritis. Rheumatology and Therapy. 8 (1), 499-515 (2021).
  39. Anderson, J. R., Phelan, M. M., Foddy, L., Clegg, P. D., Peffers, M. J. Ex vivo equine cartilage explant osteoarthritis model: A metabolomics and proteomics study. Journal of Proteome Research. 19 (9), 3652-3667 (2020).
  40. Chen, C. T., Torzilli, P. A. In vitro cartilage explant injury models. Post-Traumatic Arthritis: Pathogenesis, Diagnosis and Management. Olson, S. A., Gauilak, F. , Springer. New York, NY. 29-40 (2015).
  41. Thudium, C. S., Engstrom, A., Groen, S. S., Karsdal, M. A., Bay-Jensen, A. -C. An ex vivo tissue culture model of cartilage remodeling in bovine knee explants. Journal of Visualized Experiments. (153), e59467(2019).
  42. Rolauffs, B., Williams, J., Grodzinsky, A., E Kuettner, K., Cole, A. Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints. Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).
  43. Deveza, L. A., Loeser, R. F. Is osteoarthritis one disease or a collection of many. Rheumatology. 57, 34-42 (2018).
  44. Stolz, M., et al. Dynamic elastic modulus of porcine articular cartilage determined at two different levels of tissue organization by indentation-type atomic force microscopy. Biophysical Journal. 86 (5), 3269-3283 (2004).
  45. Sicard, D., Fredenburgh, L. E., Tschumperlin, D. J. Measured pulmonary arterial tissue stiffness is highly sensitive to AFM indenter dimensions. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 74, 118-127 (2017).
  46. Krieg, M., et al. Atomic force microscopy-based mechanobiology. Nature Reviews Physics. 1 (1), 41-57 (2019).
  47. Gavara, N. Combined strategies for optimal detection of the contact point in AFM force-indentation curves obtained on thin samples and adherent cells. Scientific Reports. 6, 21267(2016).
  48. Mow, V. C., Kuei, S. C., Lai, W. M., Armstrong, C. G. Biphasic creep and stress relaxation of articular cartilage in compression? Theory and experiments. Journal of Biomechanical Engineering. 102 (1), 73-84 (1980).
  49. Armstrong, C. G., Lai, W. M., Mow, V. C. An analysis of the unconfined compression of articular cartilage. Journal of Biomechanical Engineering. 106 (2), 165-173 (1984).
  50. Deng, L., et al. Fast and slow dynamics of the cytoskeleton. Nature Materials. 5 (8), 636-640 (2006).
  51. Fischer-Friedrich, E., et al. Rheology of the active cell cortex in mitosis. Biophysical Journal. 111 (3), 589-600 (2016).
  52. Gould, T. E., Jesunathadas, M., Nazarenko, S., Piland, S. G. Chapter 6 - Mouth Protection in Sports. Materials in Sports Equipment (Second Edition). Subic, A. , Woodhead Publishing. Sawston, Cambridge. 199-231 (2019).
  53. Kontomaris, S. V., Malamou, A. Hertz model or Oliver & Pharr analysis? Tutorial regarding AFM nanoindentation experiments on biological samples. Materials Research Express. 7 (3), 033001(2020).
  54. Guz, N., Dokukin, M., Kalaparthi, V., Sokolov, I. If cell mechanics can be described by elastic modulus: study of different models and probes used in indentation experiments. Biophysical Journal. 107 (3), 564-575 (2014).
  55. Wu, C. -E., Lin, K. -H., Juang, J. -Y. Hertzian load-displacement relation holds for spherical indentation on soft elastic solids undergoing large deformations. Tribology International. 97, 71-76 (2016).
  56. Westbrook, J. H., Conrad, H. The Science of Hardness Testing and its Research Applications. , American Society for Metal. Metals Park, Ohio. (1973).
  57. Pritzker, K. P. H., et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: Grading and staging. Osteoarthritis and Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).
  58. Stylianou, A., Kontomaris, S. V., Grant, C., Alexandratou, E. Atomic force microscopy on biological materials related to pathological conditions. Scanning. 2019, 8452851(2019).
  59. Sokolov, I. Atomic force microscopy in cancer cell research. Cancer Nanotechnology. 1, 1-17 (2007).
  60. Emad, A., et al. Relative microelastic mapping of living cells by atomic force microscopy. Biophysical Journal. 74 (3), 1564-1578 (1998).
  61. Crick, S. L., Yin, F. C. Assessing micromechanical properties of cells with atomic force microscopy: Importance of the contact point. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 6 (3), 199-210 (2007).
  62. Shoelson, B., Dimitriadis, E. K., Cai, H., Kachar, B., Chadwick, R. S. Evidence and implications of inhomogeneity in tectorial membrane elasticity. Biophysical Journal. 87 (4), 2768-2777 (2004).
  63. Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. Journal of Biomechanical Engineering. 129 (3), 430-440 (2007).
  64. Rudoy, D., Yuen, S. G., Howe, R. D., Wolfe, P. J. Bayesian change-point analysis for atomic force microscopy and soft material indentation. Journal of the Royal Statistical Society: Series C (Applied Statistics). 59 (4), 573-593 (2010).
  65. Benítez, R., Moreno-Flores, S., Bolós, V. J., Toca-Herrera, J. L. A new automatic contact point detection algorithm for AFM force curves. Microscopy Research and Technique. 76 (8), 870-876 (2013).
  66. Timashev, P. S., et al. Cleaning of cantilevers for atomic force microscopy in supercritical carbon dioxide. Russian Journal of Physical Chemistry B. 8 (8), 1081-1086 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Atomic Force MicroscopyMicro IndentationArticular Cartilage ExplantsOsteoarthritis ProgressionCartilage Mechanical PropertiesFluorescence ImagingYoung s ModulusForce Distance CurvesSample PreparationCantilever Calibration

Related Articles