Extractie, etikettering en zuivering van afstammingsspecifieke cellen uit menselijke antrale follikels

Samenvatting

Hier presenteren we protocollen voor de identificatie en zuivering van eierstokcellen uit antrale follikels. We werken uit over methoden voor het verwerken van hele eierstokken voor de cryopreservatie van corticale strips, terwijl we ook intacte antrale follikels oogsten die enzymatisch worden behandeld om meerdere follikel-residente celtypen vrij te maken, waaronder granulosa, theca, endotheel, hematopoietische en stromale cellen.

Samenvatting

De activering, groei, ontwikkeling en rijping van eicellen is een complex proces dat niet alleen wordt gecoördineerd tussen meerdere celtypen van de eierstok, maar ook over meerdere controlepunten binnen het hypothalamus / hypofyse / ovariumcircuit. Binnen de eierstok groeien meerdere gespecialiseerde celtypen in nauwe associatie met de eicel in de ovariële follikels. De biologie van deze cellen is goed beschreven in de latere stadia, wanneer ze gemakkelijk worden hersteld als bijproducten van geassisteerde reproductieve behandelingen. De diepgaande analyse van kleine antrale follikels die rechtstreeks uit de eierstok zijn geïsoleerd, wordt echter niet vaak uitgevoerd vanwege de schaarste aan menselijk eierstokweefsel en de beperkte toegang tot de eierstok bij patiënten die geassisteerde reproductieve behandelingen ondergaan.

Deze methoden voor het verwerken van hele eierstokken voor de cryopreservatie van corticale strips met de gelijktijdige identificatie / isolatie van eierstokcellen maken de analyse met hoge resolutie van de vroege stadia van antrale follikelontwikkeling mogelijk. We demonstreren protocollen voor het isoleren van discrete celtypen door antrale follikels enzymatisch te behandelen en de granulosa, theca, endotheel, hematopoietische en stromale cellen te scheiden. De isolatie van cellen uit de antrale follikels in verschillende groottes en ontwikkelingsstadia maakt de uitgebreide analyse mogelijk van de cellulaire en moleculaire mechanismen die de follikelgroei en ovariële fysiologie stimuleren en biedt een bron van levensvatbare cellen die in vitro kunnen worden gekweekt om de follikelmicro-omgeving samen te vatten.

Inleiding

De primaire functionele elementen van de menselijke eierstok zijn de follikels, die de groei en ontwikkeling van eicellen regelen. Protocollen voor de isolatie van folliculaire cellen zijn goed vastgesteld in de context van in-vitrofertilisatie , maar deze zijn alleen geschikt voor het verzamelen van cellen uit geluteïniseerde follikels op het punt van het ophalen van eicellen¹. We hebben een protocol ontwikkeld dat de isolatie van discrete celpopulaties mogelijk maakt van antrale follikels in verschillende ontwikkelingsstadia die voortkomen uit inheemse eierstokken of xenogetransplanteerd eierstokweefsel². Hoewel er consensus is dat de bijdragen van follikel-residente cellen aan de teelt van de eicel zeer belangrijk zijn, hebben weinig studies prospectief de unieke fenotypische subtypen geïdentificeerd en geëxtraheerd die aanwezig zijn in de follikels in het antrale stadium. Een dieper begrip van de differentiatiehiërarchie en signaaltransductie tussen gespecialiseerde cellen tijdens de verschillende ontwikkelingsstadia zou ons begrip van ovariële fysiologie onder homeostatische en pathologische omstandigheden kunnen verbreden. Bovendien kan de discriminatie van discrete cellulaire subtypen en hun moleculaire bijdragen aan follikelgroei / rijping een middel zijn om ex vivo surrogaten te genereren die de ovariële functie reconstrueren om de rijping van eicellen te bevorderen en / of endocriene disfunctie te behandelen.

Elk uniek celtype in de eierstok draagt bij aan de complexe functie van de follikel, die effectief functioneert als een discreet mini-orgaan om de groei en rijping van de eicel die het bevat te bevorderen. De eicel, het middelpunt van de follikel, wordt direct omhuld door een continue laag granulosacellen (GC's), waarbij de thecacellen (TC's) een secundaire laag cellen vormen die samen met de eicel en GC's de folliculaire eenheid vormen. Hoewel ingedeeld in twee groepen, bevatten GC's en TC's tal van subtypen. GC's worden geclassificeerd op basis van hun positie binnen de follikel; GC's die de eicel omringen versus die welke grenzen aan het keldermembraan worden respectievelijk aangeduid als oophoreuze en muurschildering-GC's, en deze subtypen vertonen unieke transcriptomische handtekeningen. TC's hebben tal van subtypen die functioneren om steroïdegene, metabole en structurele ondersteuning te bieden. Endotheel-, perivasculaire en immuuncellen spelen een centrale rol bij het handhaven van een normale ovariële fysiologie. Het ovariële stroma dient niet alleen als een substraat voor follikelgroei, maar biedt waarschijnlijk ook een bron van voorlopers die aanleiding geven tot TC's. Dit meerlagige complex van cellulaire subtypen in de eierstok is wat zijn functie als zowel een endocriene als een voortplantingsorgaan mogelijk maakt.

Dit artikel presenteert een protocol voor de identificatie en zuivering van granulosa, theca, stromale, endotheel- en hematopoietische cellen uit antrale follikels. We hebben dit protocol gebruikt om deze eierstokcellen te isoleren en te analyseren met behulp van single-cell sequencing, gevolgd door specifieke kleuring in follikels van verschillende ontwikkelingsstadia. Het protocol biedt een eenvoudige methodologie die repliceerbaar is en de analyse met hoge resolutie van zowel de fysiologie als de pathologie van de eierstok mogelijk maakt.

Protocol

Alle procedures met muizen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) bij Weill Cornell Medicine. Alle xenotransplantatie-experimenten met eierstokweefsel werden uitgevoerd in overeenstemming met de relevante richtlijnen en voorschriften. Beide eierstokken werden geïsoleerd van een 14-jarige hersendode orgaandonor zonder voorgeschiedenis van radio/chemotherapie en geen gedocumenteerde voorgeschiedenis van endocriene of reproductieve aandoeningen. De institutionele beoordelingscommissie (IRB) van Weill Cornell Medicine keurde de verzameling van weefsel goed en goedkeuring van de familie van de orgaandonor werd verkregen na geïnformeerde toestemming met betrekking tot het gebruik van weefsel.

1. Verzameling en behandeling van eierstokweefsel

1. Verzamel hele eierstokken en het bijbehorende weefsel en spoel af in een steriele zoutoplossing.
2. Plaats met een steriel pincet de eierstokken in een steriele container. Giet steriele, gebufferde, koude oplossing (bijv. Leibovitz's L-15 medium) in de container. Zorg ervoor dat het weefsel volledig bedekt is met de vloeistof.
3. Sluit de container en dubbel in de zak met steriele plastic zakken. Vervoer de container op ijs in een geïsoleerde doos (bijv. piepschuim). Breng de monsters zo snel mogelijk over naar het laboratorium dat de eierstokken zal verwerken, bij voorkeur in een tijd van maximaal 5 uur ^3,4.

2. Verwerking van het eierstokweefsel

OPMERKING: Zorg ervoor dat alle reagentia en hulpmiddelen zijn voorbereid voordat het weefsel in het laboratorium aankomt om het ischemische interval zoveel mogelijk te verminderen. De buffers kunnen tot 1 week voor het invriezen worden bereid en tot gebruik in de koelkast worden bewaard.

1. Preparaten voor de verwerking en invriezing van de eierstokken
   1. Zet gesteriliseerde chirurgische hulpmiddelen in de bioveiligheidskast ter voorbereiding op weefselverwerking: één nummer 21 scalpel; één nummer 11 scalpel; scherpe fijne gebogen schaar; een lange tang (~ 150 mm lengte); en twee middelgrote tangen (~110 mm lengte).
   2. Bereid 100 ml weefselverwerkingsmedium (zie de materiaaltabel): Leibovitz's L-15-medium dat antibiotische antimycotische oplossing bevat en wordt gefilterd met een filter van 0,2 μm. Houd het medium gekoeld.
   3. Etiketteer de cryovials, voeg 1,5 ml vriesoplossing (zie de materiaaltabel) toe aan elke injectieflacon en bewaar deze bij 4 °C.
   4. Heb een 6-well plaat bij de hand voor gebruik.
2. Bij aankomst van het weefsel
   1. Spuit de container met 70% ethanoloplossing, veeg grondig af en plaats deze in de bioveiligheidskast.
   2. Draag steriele handschoenen en open de container. Plaats de eierstok in een steriele petrischaal en giet gekoeld medium (vanaf stap 2.1.2) om het weefsel te hydrateren. Zorg ervoor dat de eierstok half ondergedompeld is in het medium.
   3. Verwijder eventuele hechtingen of ander materiaal en ontleed het resterende omliggende weefsel weg van de eierstok.

3. Isolatie van antrale follikels

1. Identificeer individuele follikels voor isolatie. Bij het kiezen van gezonde follikels, sluit alle met bloed gevulde, donkere of niet-symmetrische follikels uit, omdat die waarschijnlijk atretisch zijn.
2. Isoleer de gekozen antrale follikels uit de hele eierstok met behulp van scalpels, waarbij het antrum intact blijft door het corticale weefsel dat de follikel omvat te exciëren.
3. Plaats elke weggesneden intacte antrale follikel in één putje van de 6-putplaat. Gebruik indien nodig voor beschrijvende doeleinden een liniaal die onder de schaal is geplaatst om de follikeldiameter te bepalen.
4. Bisect met behulp van een scalpel de intacte antrale follikel om toegang te krijgen tot de antrale holte en voeg 4 ml enzymatisch celloslatingsmedium toe. Incubeer de plaat in een bevochtigde incubator bij 5% CO₂ en 37 °C gedurende 10 minuten.
5. Herhaal de extractie van extra antrale follikels indien nodig.

4. Isolatie van follikelcellen

1. Voeg na incubatie 4 ml beschikbaar medium toe dat 20% FBS bevat en spoel door herhaalde, krachtige pipettering van het medium over de doorsneden follikels met een P1.000 micropipette.
2. Verzamel het medium en laat het door een filter van 100 μm lopen.
3. Centrifugeer het gefilterde supernatant gedurende 3 minuten bij 300 × g en 4 °C. Zuig het supernatant op en reserveer de celkorrel (verrijkt met GC's) op ijs voor etikettering en fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS).
4. Plaats het resterende weefsel in een mengsel van collagenase (100 U / ml) en dispase (1 U / ml) verdund in een uitgebalanceerde zoutoplossing (bijv. Hanks) en incubeer gedurende 30 minuten bij 5% CO₂ en 37 ° C, waarbij het weefsel mechanisch wordt verstoord door trituratie en krachtig pipetteren (d.w.z. 10-15 gaat door de pipetpunt) tweemaal na 10 minuten en 20 minuten.
5. Herstel media die het weefsel bevatten, spoel door pipetteren door een P1.000 micropipette-tip en zeef door een filter van 100 μm.
6. Centrifugeer gedurende 3 minuten bij 300 × g en 4 °C. Zuig het supernatant op en leg de celkorrel (verrijkt met TC's en stromacellen) op ijs voor etikettering en FACS.

5. Fluorescentie-geactiveerde celsortering

1. Resuspendeer de celpellets in een blokkerende oplossing (PBS + 0,1% FBS) en incubeer gedurende 10 minuten bij 4 °C.
2. Centrifugeer gedurende 3 minuten bij 300 × g en 4 °C en zuig het supernatant op.
3. Resuspendeer de celpellets in een blokkerende oplossing die direct geconjugeerde antilichamen bevat (zie tabel 1 voor geschikte antilichaamcombinaties om GC's en TC's te identificeren) en incubeer gedurende 10 minuten op ijs.
4. Was en centrifugeer de cellen gedurende 3 minuten op 300 × g en 4 °C. Resuspendeer de cellen in FACS-buffer met 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) en voer de celsuspensie door een FACS-instrument om een kleine populatie van de cellen (500-1.000) te vangen met behulp van de fluorescentie-intensiteit van fluorofoor-geconjugeerde antilichamen voor gating.
5. Gebruik voor de identificatie van unieke subpopulaties de volgende gatingstrategieën:
   1. Teken voor de zuivering van GC's een poort rond de CD45+-cellen (figuur 1B) en sluit deze populatie uit van de CD99⁺-populatie (figuur 1A en figuur 1C); verdeel vervolgens de resterende CD99+ fractie verder in PVRL^+/- fracties (figuur 1A en figuur 1C).
   2. Voor de zuivering van TC's en stroma moet de totale ^ENG+ (Figuur 1A) of CD55+ (Figuur 1D) populatie de CD34+ endotheelfractie (Figuur 1E) uitsluiten en de steroidogene (ANPEP⁺) en niet-steroidogene (ANPEP-) cellen onderscheiden. Wees voorzichtig om te compenseren voor doorbloeding tussen fluoroforen die zich dicht bij de emissiespectra bevinden.
6. Om de zuiverheid van de gesorteerde celfractie te valideren, voert u 5% van het totale opgevangen volume door het FACS-instrument en zorgt u ervoor dat cellen de verwachte poorten bevolken en aanwezig zijn met een zuiverheid van >95%.

6. Verwerking van het eierstokschorsweefsel

1. Bisect de rest van de eierstok en snijd de medulla met behulp van een gebogen fijne schaar en scalpels, waarbij u voorzichtig bent om schade aan de ovariële cortex te voorkomen.
2. Ga door met het verwerken en verdunnen van de ovariële cortex door zachtjes te schrapen totdat er minimale medulla overblijft. Zorg ervoor dat u de minimale kracht gebruikt die nodig is.
   OPMERKING: De dikte van het corticale weefsel moet tussen 1 mm en 1,5 mm liggen.
3. Verdeel het corticale weefsel in 2-3 mm brede stroken over de lengte van de eierstok.

7. Eierstokweefsel langzaam bevriezen

1. Voorbereiding voor het invriezen
   1. Breng één corticale strip in elke gekoelde cryogene injectieflacon met vriesoplossing.
   2. Schud de cryogene injectieflacons met de corticale strips op een roterende plaat gedurende 20 minuten bij 4 °C.
2. Langzame bevriezing van het eierstokweefsel⁵
   1. Plaats de cryovialen met eierstokweefsel in een programmeerbare vriezer die begint bij 0 °C.
   2. Koel af met een snelheid van 2 °C/min tot −7 °C.
   3. Houd de cryovialen gedurende 10 minuten op deze temperatuur.
   4. Nucleate ijskristalvorming door elke cryovial aan te raken met een katoenen tip die kort is ondergedompeld in vloeibare stikstof (LN₂).
   5. Laat afkoelen met een snelheid van 0,3 °C/min totdat de monstertemperatuur −40 °C bereikt.
   6. Verhoog de afkoelsnelheid tot 10 °C/min totdat de monstertemperatuur −140 °C bereikt.
   7. Breng de cryovialen over voor opslag in LN₂.

Resultaten

We isoleerden follikels van het oppervlak van de eierstok en behandelden ze enzymatisch om de GC's te isoleren, evenals theca- en stromacellen rond de antrale holte. De cellen werden verzameld en de celfracties werden gesorteerd van de antrale follikels (diameters variërend tussen 0,5 mm en 4 mm) door FACS tot >95% zuiverheid (figuur 1).

Om unieke cellulaire fracties in de menselijke antrale follikels te labelen en te zuiveren, combineerden we enzymatische spijsve...

Discussie

Een betere resolutie van de cellulaire diversiteit in de ovariële follikels is om verschillende redenen klinisch belangrijk. Bij het toepassen van het bovenstaande protocol op de isolatie van de unieke fenotypische subtypen die zich in de follikels van het antrale stadium bevinden, moeten verschillende factoren worden overwogen. Ten eerste is de gezondheid en levensvatbaarheid van het eierstokweefsel waaruit de antrale follikel is afgeleid van cruciaal belang bij het bepalen van de kwaliteit van de cellen en het succes v...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Chemicals, reagents
Antibiotic-Antimycotic 100x	Thermo Fisher Scientific	15240062	Anti-Anti
Antifade Mountant solution	Thermo Fisher Scientific	P36930	ProLong Gold
Collagenase van Clostridium histolyticum	Millipore Sigma	C 2674
DAPI	Thermo Fisher Scientific	D1306
Dispase II, poeder	Thermo Fisher Scientific	17105041
DMSO	Millipore Sigma	D 2650	Dimethyl sulfoxide
DPBS, zonder calcium, zonder magnesium	Thermo Fisher Scientific	14190144
Enzyme Cell Detachment Medium	Thermo Fisher Scientific	00-4555-56	Accutase
Fetaal bovien serum, verhit-inactive	Thermo Fisher Scientific	10438026
Hanks' Balanced Salt solution	Thermo Fisher Scientific	14175079	zonder calcium, zonder magnesium, zonder fenolrood
Leibovitz's L-15 medium	Thermo Fisher Scientific	11415064
Normale zoutoplossing	Quality Biological	114-055-101
Sucrose	Millipore Sigma	S 1888
Freezing Medium (100 mL, gefilterd door een 0,2 micron filter)
- 69,64 mL van Leibovitz's L-15
- 17,66 mL van fetaal bovien serum
- 3,42 g sucrose
- 10,65 mL van DMSO
- 1 mL van antibioticum-antimycotisch
Lab Plasticware en Supplies
6-well Clear Flat Bottom Not Treated	Corning	351146	Falcon
Cell Strainer 100 µm	Fisher scientific	352360	Corning, Falcon
Cryovials	Thermo Fisher Scientific	377267	CryoTube 1,8 mL
Petrischaal, D x H 150 mm x 25 mm	Millipore Sigma	CLS430599	60EA
Rond-Bodem Polystyreen Testbuizen met Cell Strainer Snap Cap, 5 mL	Fisher scientific	352235	Corning, Falcon
Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0,22 µm	Corning	431154
Antilichamen
ANPEP	BioLegend	301703
CD34	R&D Systems	FAB7227A
CD45	BioLegend	304019
CD55	BioLegend	311306
CD 99	BioLegend	371308
PVRL	BioLegend	340404
Chirurgische gereedschappen
lange pincetten ( ~150 mm lengte)	Fisherbrand	12-000-128	Fisher Scientific
middelgrote pincetten ( ~110 mm lengte)	Fisherbrand	12-000-157	Fisher Scientific
nummer 21 scalpel	Andwin Scientific	EF7281H	Fisher Scientific
nummer 11 scalpel	Andwin Scientific	FH/CX7281A	Fisher Scientific
scherpe fijne gebogen schaar	Roboz Surgical	RS-5881
Instrumenten
FACSJazz Flourence activated cell sorter	BD
LSM 710 META Confocal microscope	Zeiss