Methodenartikel

Karakterisering van een pathogene Escherichia coli-stam afgeleid van Oreochromis spp. Boerderijen met behulp van whole-genome sequencing

DOI:

10.3791/64404

⸱

23 december 2022

 ,  ,  , 
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, 2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

In dit artikel

Erratum-melding

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De haalbaarheid van whole-genome sequencing (WGS) strategieën met behulp van benchtop instrumenten heeft de genoomondervraging van elke microbe van volksgezondheidsrelevantie in een laboratoriumomgeving vereenvoudigd. Een methodologische aanpassing van de workflow voor bacteriële WGS wordt beschreven en een bioinformatica pijplijn voor analyse wordt ook gepresenteerd.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquacultuur is een van de snelst groeiende voedselproducerende sectoren ter wereld en tilapia (Oreochromis spp.) landbouw vormt de belangrijkste zoetwatervisvariëteit die wordt gekweekt. Omdat aquacultuurpraktijken gevoelig zijn voor microbiële besmetting afgeleid van antropogene bronnen, is uitgebreid antibioticagebruik nodig, wat ertoe leidt dat aquacultuursystemen een belangrijke bron worden van antibioticaresistente en pathogene bacteriën van klinische relevantie, zoals Escherichia coli (E. coli). Hier werden de antimicrobiële resistentie, virulentie en mobiloomkenmerken van een pathogene E. coli-stam , hersteld van in het binnenland gekweekte Oreochromis spp., opgehelderd door middel van whole-genome sequencing (WGS) en in silico-analyse . Antimicrobiële gevoeligheidstests (ASAT) en WGS werden uitgevoerd. Bovendien werden fylogenetische groep, serotype, multilocussequentietypering (MLST), verworven antimicrobiële resistentie, virulentie, plasmide en profaaginhoud bepaald met behulp van diverse beschikbare webtools. Het E. coli-isolaat vertoonde alleen intermediaire gevoeligheid voor ampicilline en werd gekarakteriseerd als ONT:H21-B1-ST40-stam door op WGS gebaseerde typering. Hoewel slechts één antimicrobieel resistentie-gerelateerd gen werd gedetecteerd [mdf(A)], werden verschillende virulentie-geassocieerde genen (VAGs) van het atypische enteropathogene E. coli (aEPEC) pathotype geïdentificeerd. Bovendien werd de lading plasmide replicons uit grote plasmidegroepen en 18 profaag-geassocieerde regio's gedetecteerd. Kortom, de WGS-karakterisering van een aEPEC-isolaat, hersteld van een viskwekerij in Sinaloa, Mexico, biedt inzicht in het pathogene potentieel en het mogelijke risico voor de menselijke gezondheid van het consumeren van rauwe aquaculturele producten. Het is noodzakelijk om next-generation sequencing (NGS) technieken te gebruiken voor het bestuderen van micro-organismen in het milieu en om een één gezondheidskader aan te nemen om te leren hoe gezondheidsproblemen ontstaan.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquacultuur is een van de snelst groeiende voedselproducerende sectoren ter wereld en de productiepraktijken zijn bedoeld om te voldoen aan de stijgende vraag naar voedsel voor menselijke consumptie. De wereldwijde aquacultuurproductie is verdrievoudigd van 34 miljoen ton (Mt) in 1997 tot 112 Mt in 20171. De belangrijkste soortengroepen, die bijdroegen aan bijna 75% van de productie, waren zeewier, karpers, tweekleppigen, meervallen en tilapia (Oreochromis spp.) 1. Het verschijnen van ziekten veroorzaakt door microbiële entiteiten is echter onvermijdelijk vanwege de intensieve viskweek, wat leidt tot potentiële economische verliezen2.

Antibioticagebruik in viskweekpraktijken staat bekend om het voorkomen en behandelen van bacteriële infecties, de belangrijkste beperkende factor in productiviteit 3,4. Niettemin hopen residuele antibiotica zich op in aquacultuursedimenten en water, waardoor selectieve druk wordt uitgeoefend en de vis-geassocieerde en de verblijvende bacteriële gemeenschappen worden gewijzigd 5,6,7,8. Bijgevolg dient de aquacultuuromgeving als reservoir voor antimicrobiële resistentiegenen (ARG's) en de verdere opkomst en verspreiding van antibioticaresistente bacteriën (ARB) in het omringende milieu9. Naast de bacteriële pathogenen die vaak worden waargenomen bij het kweken van vissen, worden leden van de Enterobacteriaceae-familie vaak aangetroffen, waaronder menselijke pathogene stammen van Enterobacter spp., Escherichia coli, Klebsiella spp. en Salmonella spp.10. E. coli is het meest voorkomende micro-organisme geïsoleerd uit vismeel en water in de viskweek 11,12,13,14,15.

E. coli is een veelzijdige gramnegatieve bacterie die het maagdarmkanaal van zoogdieren en vogels bewoont als een commensaal lid van hun darmmicrobiota. E. coli bezit echter een zeer adaptief vermogen om te koloniseren en te volharden in verschillende milieuniches, waaronder bodem, sedimenten, voedsel en water16. Vanwege de genwinst en -verlies door het fenomeen horizontale genoverdracht (HGT), is E. coli snel geëvolueerd tot een goed aangepast antibioticumresistente ziekteverwekker, die een breed spectrum van ziekten bij mens en dier kan veroorzaken17,18. Op basis van de oorsprong van de isolatie worden pathogene varianten gedefinieerd als intestinale pathogene E. coli (InPEC) of extra-intestinale pathogene E. coli (ExPEC). Bovendien zijn InPEC en ExPEC onderverdeeld in goed gedefinieerde pathotypes op basis van ziektemanifestatie, genetische achtergrond, fenotypische eigenschappen en virulentiefactoren (VFs)16,17,19.

Traditionele kweek- en moleculaire technieken voor pathogene E. coli-stammen hebben de snelle detectie en identificatie van verschillende pathotypen mogelijk gemaakt. Ze kunnen echter tijdrovend, bewerkelijk en vaak een hoge technische training vereisen19. Bovendien kan geen enkele methode worden gebruikt om alle pathogene varianten van E. coli betrouwbaar te bestuderen vanwege de complexiteit van hun genetische achtergrond. Momenteel zijn deze nadelen overwonnen met de komst van high-throughput sequencing (HTS) -technologieën. Whole-genome sequencing (WGS) benaderingen en bioinformatische hulpmiddelen hebben de exploratie van microbieel DNA betaalbaar en op grote schaal verbeterd, waardoor de diepgaande karakterisering van microben in één run is vergemakkelijkt, inclusief nauw verwante pathogene varianten 20,21,22. Afhankelijk van de biologische vragen kunnen verschillende bioinformatica-tools, algoritmen en databases worden gebruikt om gegevensanalyse uit te voeren. Als het hoofddoel bijvoorbeeld is om de aanwezigheid van ARGs, VFs en plasmiden te beoordelen, kunnen tools zoals ResFinder, VirulenceFinder en PlasmidFinder, samen met hun bijbehorende databases, een goed startpunt zijn. Carriço et al.22 gaven een gedetailleerd overzicht van de verschillende bioinformatica-software en gerelateerde databases die worden toegepast voor microbiële WGS-analyse, van ruwe datavoorbewerking tot fylogenetische inferentie.

Verschillende studies hebben het brede nut van WGS aangetoond voor genoomondervraging met betrekking tot antimicrobiële resistentieattributen, pathogeen potentieel en het volgen van de opkomst en evolutionaire relaties van klinisch relevante varianten van E. coli afkomstig van verschillende oorsprong 23,24,25,26 . WGS heeft de identificatie mogelijk gemaakt van moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de fenotypische resistentie tegen antimicrobiële stoffen, inclusief die zeldzame of complexe resistentiemechanismen. Dit gebeurt door het detecteren van verworven ARG-varianten, nieuwe mutaties in geneesmiddeldoelgenen of promotorregio's27,28. Bovendien biedt WGS het potentieel om antimicrobiële resistentieprofielen af te leiden zonder voorafgaande kennis over het resistentiefenotype van een bacteriestam29. Als alternatief heeft WGS de karakterisering van de mobiele genetische elementen (MGE's) met zowel antimicrobiële resistentie als virulentiekenmerken mogelijk gemaakt, wat de bacteriële genoomevolutie van bestaande pathogenen heeft aangedreven. De toepassing van WGS tijdens het onderzoek naar de Duitse E. coli-uitbraak in 2011 resulteerde bijvoorbeeld in het blootleggen van de unieke genomische kenmerken van een schijnbaar nieuw E. coli-pathotype; interessant is dat die uitbraakstammen afkomstig waren van de enteroaggregatieve E. coli (EGA) -groep, die de profaag verwierf die codeert voor het Shiga-toxine van het enterohemorragische E. coli (EHEC) pathotype30.

Dit werk presenteert een methodologische aanpassing van de workflow voor bacteriële WGS met behulp van een benchtop sequencer. Bovendien wordt een bioinformatica-pijplijn geleverd met behulp van webgebaseerde tools om de resulterende sequenties te analyseren en onderzoekers met beperkte of geen bioinformatica-expertise verder te ondersteunen. De beschreven methoden maakten het mogelijk om de antimicrobiële resistentie, virulentie en mobiloomkenmerken van een pathogene E. coli-stam ACM5, geïsoleerd in 2011 uit in het binnenland gekweekt Oreochromis spp. in Sinaloa, Mexico, opte helderen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: De E. coli-stam ACM5 werd teruggevonden door het vismonster te verwerken en te kweken voor fecale coliforme (FC) bepaling12. Tijdens de visbemonstering vertoonden vissen geen klinische tekenen van ziekte, bacteriële of schimmelinfectie en heerste een gemiddelde temperatuur van 22,3 °C. Na isolatie werd het E. coli-isolaat onderworpen aan biochemische tests en gecryopreserveerd in hersenhartinfusie (BHI) bouillon met DMSO (8% v / v) als cryoprotectief middel.

1. Reactivering van bevroren E. coli ACM5-stamcultuur

  1. Open van de bevroren bacteriële voorraad de buis en gebruik een steriele lus, pipetpunt of tandenstoker om het oppervlak van de bevroren bacteriecultuur te schrapen.
  2. Strooi de bacteriën op een Luria-Bertani (LB) agarplaat en incubeer bij 37 ± 2 °C gedurende 24 uur.

2. Bepaling van antibacteriële gevoeligheid

OPMERKING: De hier beschreven antimicrobiële gevoeligheidstests komen overeen met de schijfdiffusiemethode op basis van de richtlijnen van het Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (M02 Ed13:2018)31. E. coli ATCC 25922 stam is vereist voor kwaliteitscontrole doeleinden.

  1. Entvoorbereiding volgens koloniesuspensiemethode
    1. Streep vanaf de in stap 1.2 geïncubeerde LB-plaat een of twee kolonies op een Mueller-Hinton (MH) agarplaat en incubeer bij 37 ± 2 °C gedurende 18-24 uur.
    2. Gebruik een steriele lus om twee of drie kolonies te plukken uit het vers gesubkweekte E. coli-isolaat op MH-agarplaat en resuspenseer ze in 3 ml steriele MH-bouillon of 0,85% (w / v) zoutoplossing, grondig mengen door vortexing om een uniforme bacteriële suspensie te verkrijgen.
    3. Gebruik een UV-zichtbare spectrofotometer (zie Materiaaltabel) en pas de bacteriële suspensie aan op troebelheid die vergelijkbaar is met een 0,5 MacFarland-standaard (equivalent aan ongeveer 1-2 x 108 cellen / ml). Als de bacteriële suspensie te licht of te zwaar is, voeg dan meer E. coli-kolonies of MH-bouillon toe. Gebruik het bereide entmateriaal binnen 15 minuten na bereiding.
  2. Inenting van de test agar platen
    1. Dompel een steriel wattenstaafje in de aangepaste bacteriële suspensie. Draai het wattenstaafje meerdere keren en druk het stevig op de binnenwand van de buis om overtollig vocht uit het wattenstaafje te verwijderen.
    2. Ent een MH-agarplaat door het wattenstaafje 3x over het gehele agaroppervlak te strijken en de plaat telkens 60° te draaien. Wattenstaaf ook de rand van de agar om een gelijkmatige verdeling van het entmateriaal te garanderen.
    3. Laat het deksel van de petrischaal 3-5 minuten op een kier staan om vocht te laten verdampen.
  3. Toepassing van de antimicrobiële schijf op geënte agarplaten
    1. Verdeel gelijkmatig en druk elke antimicrobiële schijf (zie Materiaaltabel) op het oppervlak van de geënte agarplaten om volledig contact te garanderen. Keer de platen binnen 15 minuten na het aanbrengen van de schijf om en incubeer bij 35 ± 2 °C gedurende 16-18 uur.
      OPMERKING: Maximaal 12 en zes schijven moeten worden gebruikt in petrischalen van respectievelijk 150 mm en 100 mm.
  4. Meet na incubatie de zone van remmingsgroottes met behulp van een Vernier-remklauw en interpreteer de resulterende diameters volgens de CLSI-breekpuntcriteria (M100 - Tabel 2A)32.

3. Genomisch DNA (gDNA) extractie en kwantificering

  1. Genomische DNA-extractie
    1. Resuspenseer een lus vol vers gekweekte E. coli-kolonies in 5 ml LB-bouillon en incubeer een nacht in een schuddende incubator (180 tpm) bij 37 ± 2 °C.
    2. Centrifugeer de bacteriële suspensie bij 3.500 x g gedurende 5 minuten en gooi het supernatant voorzichtig weg.
    3. Extraheer gDNA volgens de richtlijnen van de DNA-extractiekit (zie materiaaltabel).
    4. Controleer de zuiverheid van het gDNA door de optische dichtheid te meten bij 260/280 nm (verhouding: >1,8) en 260/230 nm (verhouding: 2,0-2,2) met behulp van een UV-zichtbare spectrofotometer. Voer 0,8% agarose gel-elektroforese uit om de gDNA-integriteit te verifiëren.
  2. Genomische DNA-kwantificering
    OPMERKING: Gebruik alleen dunwandige, heldere PCR-buizen van 0,5 ml die zijn goedgekeurd door de fabrikant van de fluorescentietestkit (zie materiaaltabel).
    1. Stel het vereiste aantal buizen in voor monsters en testnormen. Bereid de werkende testoplossing voor door component A en component B in de kit te mengen, volgens de richtlijnen van de fabrikant.
    2. Bereid de testnormen voor door 190 μL van de werkoplossing en 10 μL van elke standaard aan de juiste buis toe te voegen (er zijn twee normen vereist).
    3. Voeg 198 μL van de werkoplossing en 2 μL van het DNA-monster toe aan de juiste buis. Meng krachtig door alle buizen gedurende 5 s te vortexen. Pas op dat je geen bubbels creëert.
    4. Incubeer alle buizen gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Meet de fluorescentie van alle buizen op basis van de richtlijnen van de fabrikant met behulp van de fluorometer (zie Materiaaltabel).
    5. Pas de concentratie van het gDNA-monster goed aan voor de volgordebepaling.

4. Voorbereiding van de DNA-bibliotheek

OPMERKING: DNA-bibliotheekvoorbereiding en -sequencing werden uitgevoerd volgens de richtlijnen en protocollen van de fabrikant (zie materiaaltabel). De beginnende gDNA-concentratie is 4,0 ng.

  1. Tagmentatie, PCR-versterking en indexering
    1. Voeg in een buis van 0,2 ml 2,5 μL tagmentatiebuffer en 2 μL input gDNA (2,0 ng/μL) toe. Meng voorzichtig door te pipetteren.
    2. Voeg 1 μL versterkingsbuffer toe en meng voorzichtig door te pipetteren. Draai af op 280 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur.
    3. Plaats de monsters in een thermocycler (zie Materiaaltabel) en voer het volgende PCR-programma uit: 55 °C gedurende 5 minuten en houd ze vervolgens op 10 °C. Wanneer de monsters 10 °C bereiken, ga dan onmiddellijk verder om de reactie te neutraliseren.
    4. Voeg 1 μL neutraliserende buffer toe aan de monsterbuizen en meng voorzichtig door te pipetteren. Draai af op 280 x g gedurende 1 min en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    5. Voeg 1,7 μL van elke indexadapter (d.w.z. indexen i7 en i5) en 3 μL indexerende PCR-mastermix toe. Meng voorzichtig door te pipetteren. Draai af op 280 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur.
    6. Plaats de monsters in de thermocycler en voer als volgt een tweede PCR-reactie uit: 72 °C gedurende 3 min, 95 °C gedurende 30 s, 18 cycli van 95 °C gedurende 10 s, 55 °C gedurende 30 s, 72 °C gedurende 30 s, 72 °C gedurende 5 minuten en vasthouden op 10 °C.
  2. Versterkte bibliotheek opruimen
    1. Meng door vortexing van de commerciële magnetische kraaloplossing (zie Tabel van materialen) op basis van de richtlijnen van de fabrikant.
    2. Breng het gelabelde/geïndexeerde gDNA-monster over in een nieuwe buis van 1,5 ml en voeg 0,6 μL magnetische kralen toe voor elke μL van het uiteindelijke volume van het gDNA-monster (≈13 μL). Meng voorzichtig door te pipetteren en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Plaats de monsterbuizen gedurende 2 minuten op een magnetisch rek (zie Materiaaltabel) totdat het supernatant is opgeruimd. Verwijder en gooi het supernatant voorzichtig weg zonder de kralen te storen.
    4. Voeg 200 μL vers bereide 80% ethanol toe zonder te mengen. Incubeer gedurende 30 s totdat het eluaat is verdwenen en verwijder en gooi het supernatant voorzichtig weg zonder de kralen te storen.
    5. Voer een tweede wasstap uit. Voeg 200 μL 80% ethanol toe aan de kralen en incubeer gedurende 30 s. Nadat het eluaat is opgeklaard, verwijdert u het supernatant en gooit u het weg en droogt u de kralen gedurende 10 minuten aan de lucht.
    6. Voeg 15 μL 10 mM tris buffer (pH 8) toe aan de kralen en meng voorzichtig door te pipetteren. Incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Plaats de monsterbuizen opnieuw op het magnetische rek gedurende 2 minuten, zodat het supernatant kan worden gewist.
    7. Breng voorzichtig 14 μL van het supernatant over van de monsterbuis naar een nieuwe buis van 0,2 ml. Dit is de opgeschoonde bibliotheek.
      OPMERKING: Op dit punt kan de opgeschoonde bibliotheek maximaal 7 dagen bij -20 °C worden bewaard.
  3. Bibliotheek normalisatie
    1. Ga verder met het kwantificeren van de opgeschoonde bibliotheken door fluorescentietest zoals beschreven in stap 3.2, met uitzondering van stap 3.2.5.
    2. Visualiseer de opgeschoonde bibliotheken op een 1% agarose gel-elektroforese om de gemiddelde fragmentgroottes te bepalen.
    3. Bereken de molariteitswaarde van de bibliotheek met behulp van de volgende vergelijking:
      figure-protocol-1
    4. Bereken met behulp van de molariteitswaarde de juiste volumes resuspensiebuffer (RSB) en opgeschoonde bibliotheken om de individuele bibliotheek te verdunnen met een startconcentratie van 10 nM.

5. Bibliotheekpooling, denaturalisatie en sequencer initiëren

  1. Ontdooi de reagenspatroon volgens de aanwijzingen van de fabrikant. Haal de stroomcel uit de koelkast (4 °C) en breng deze op kamertemperatuur voordat u deze opvolgt.
  2. Pool 5 μL van elke genormaliseerde bibliotheek (10 nM) in een low-bind 1,5 ml buis. Verdun de gepoolde bibliotheek op 4 nM met het juiste volume RSB.
  3. Voeg 5 μL van de gepoolde bibliotheek (4 nM) en 5 μL 0,2 N NaOH toe in een nieuwe buis met lage binding van 1,5 ml. Kort mengen door vortexing, spin naar beneden op 280 x g gedurende 1 min en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de gepoolde bibliotheek in enkele strengen te denatureren.
  4. Meng voorzichtig 10 μL gedenatureerde gepoolde bibliotheek en 990 μL vooraf gechilleerde hybridisatiebuffer door pipetteren en op ijs plaatsen totdat de uiteindelijke verdunning voor het laden van de sequencer is uitgevoerd. De concentratie van de gedenatureerde gepoolde bibliotheek is 20 pM.
  5. Ontdooi en bereid een controlebibliotheek (zie materiaaltabel) in een concentratie van 4 nM door 2 μL controlebibliotheek (10 nM) en 3 μL nucleasevrij water te mengen.
  6. Meng 5 μL van de controlebibliotheek (4 nM) en 5 μL vers bereid 0,2 N NaOH. Kort mengen door vortexing, spin naar beneden op 280 x g gedurende 1 min en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de besturingsbibliotheek in enkele strengen te denatureren.
  7. Meng voorzichtig 10 μL gedenatureerde controlebibliotheek en 990 μL vooraf gechilleerde hybridisatiebuffer door pipetteren en plaats op ijs totdat de uiteindelijke verdunning voor het laden van de sequencer is voltooid. De concentratie van de gedenatureerde controlebibliotheek is 20 pM.
  8. Combineer in een nieuwe low-bind buis van 1,5 ml 594 μL van de gedenatureerde gepoolde bibliotheek bij 20 pM en 6 μL van de gedenatureerde controlebibliotheek bij 20 pM. Meng goed.
  9. Verdun de uiteindelijke bibliotheekmix (20 pM) tot een uiteindelijke belastingsconcentratie van 1,2 pM in een volume van 600 μL met behulp van de vooraf voorgeschreven hybridisatiebuffer.
  10. Voordat u het uiteindelijke bibliotheekmengsel op de reagenscartridge laadt, voert u een extra thermische voorbehandeling uit om een efficiënte belasting in de stroomcel te bereiken. Incubeer de uiteindelijke bibliotheekmix gedurende 2 min bij 96 °C. Keer de buis om te mengen en plaats de buis gedurende 5 minuten op ijs.
  11. Laad 500 μL van de uiteindelijke bibliotheekmix in het ontworpen reservoir op de reagenspatroon. Start de volgorde volgens de richtlijnen. Laad de flowcel en de reagenscartridge en stel de sequencingrun in.

6. Analyse van sequentiegegevens

OPMERKING: Raadpleeg aanvullend bestand 1 voor een verdere beschrijving van de algemene voorbewerking van WGS-gegevens, software, parameterinstellingen en sequentieanalyse van het E. coli-genoom .

  1. Maak verbinding met de sequencing-gegevensserver en download de FASTQ-bestanden.
  2. Evalueer de initiële kwaliteit van onbewerkte sequentiegegevens met software van derden. Verwijder restadaptersequenties, basissen van lage kwaliteit (Aanvullend bestand 1).
  3. Verzamel de op kwaliteit gecontroleerde sequencinggegevens in contig- of steigerniveau met behulp van software van derden (zie Aanvullend bestand 1).
  4. Voer genoomannotatie uit door het FASTA-bestand met het geassembleerde genoom in te dienen bij de RAST-server (https://rast.nmpdr.org/).
  5. Upload het FASTA-bestand naar de webplatforms Center for Genome Epidemiology (CGE) (http://www.genomicepidemiology.org/services/) en ClermonTyping (http://clermontyping.iame-research.center/index.php) om epidemiologische kenmerken, ARG's, VAGs en plasmiden te identificeren (zie aanvullend bestand 1).
  6. Upload het FASTA-bestand naar de PHASTER-server om prophagesequenties te identificeren (https://phaster.ca/).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De antimicrobiële gevoeligheid werd bepaald door de schijfdiffusiemethode en geïnterpreteerd door CLSI-breekpuntcriteria voor 12 antibiotica verspreid over zes verschillende antimicrobiële klassen, dat wil zeggen aminoglycosiden, β-lactams, fluoroquinolonen, nitrofuranen, fenicolen en folaatrouteantagonisten. De E. coli ACM5 vertoonde gevoeligheid voor alle antibiotica behalve één β-lactamgeneesmiddel. Vier β-lactamgeneesmiddelen werden getest: ampicilline, carbenicilline, cefalotheïne en cefotaxime. Onder deze ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie presenteert een aanpassing van de bacteriële WGS-workflow met behulp van een benchtop sequencer en een pijplijn voor genomische karakterisering van een pathogene E. coli-variant . Afhankelijk van het gebruikte sequencingplatform kunnen de doorlooptijden (TATs) voor natte laboratoriumprocedures (bacteriekweek, gDNA-extractie, bibliotheekvoorbereiding en sequencing) en sequentieanalyse variëren, vooral als langzaam groeiende bacteriën worden bestudeerd. Volgens het hierboven beschreven protocol voor WG...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aan de Nationale Raad voor Wetenschap en Technologie van Mexico (CONACyT door zijn acroniem in het Spaans) voor de doctoraatsbeurs toegekend aan José Antonio Magaña-Lizárraga [nr. 481143].

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Accublock Mini digital dry bathLabnetD0100Dry bath voor incubatie van buisjes
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63881Magneetkralen in oplossing voor DNA-bibliotheekzuivering
DeNovix DS-11DeNovix Inc.UV-Vis spectrofotometer om de kwaliteit van de geëxtraheerde gDNA te controleren
DNA LoBind TubesEppendorf00301084181,5 mL PCR-buisjes voor DNA-bibliotheek pooling
DynaMag-2 MagnetInvitrogen, Thermo Fisher Scientific12321DMagneetrek voor microtubes gebruikt tijdens magnetische kralen-gebaseerde DNA-zuivering
Gram-negative Multibac I.D.Diagnostic research (Mexico)PT-35Commerciële standaard antibioticumschijven voor antimicrobiële gevoeligheidstesten
MiniSeq Mid Output Kit (300-cycles)IlluminaFC-420-1004Reagenscartridge voor paired-end sequencing (2x150)
MiniSeq System InstrumentIlluminaSY-420-1001Benchtop sequencer gebruikt voor Next-generation sequencing
MiniSpin centrifugeEppendorf5452000816Standaard centrifuge voor buisjes
Nextera XT DNA Library Preparation KitIlluminaFC-131-1024Reagentia om DNA-bibliotheken voor sequencing uit te voeren. Bevat Box 1 en Box 2 reagentia voor 24 monsters
Nextera XT Index Kit v2IlluminaFC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004Index set A, B, C, D
PhiX Control v3IlluminaFC-110-3001DNA-bibliotheekcontrole voor sequencing
Precision waterbathLabCare America51221081Waterbad shaker gebruikt voor bacteriële kweek
Qubit 1X dsDNA HS Assay KitInvitrogen, Thermo Fisher ScientificQ33231Reagentia voor fluorescentie-gebaseerde DNA-kwantificeringsassay
Qubit 2.0 FluorometerInvitrogen, Thermo Fisher ScientificQ32866Fluorometer gebruikt voor fluorescentie assay
Qubit Assay tubesInvitrogen, Thermo Fisher ScientificQ328560,5 mL PCR-buisjes voor fluorescentie-gebaseerde DNA-kwantificeringsassay
SimpliAmp Thermal CyclerApplied Biosystems, Thermo Fisher ScientificA24811Thermocycler gebruikt voor DNA-bibliotheek amplificatie
Spectronic GENESYS 10 VisThermo335900Spectofotometer gebruikt voor bacteriële suspensie bij antimicrobiële gevoeligheidstesten
ZymoBIOMICS DNA Miniprep KitZymo Research Inc.D4300Kit voor genomische DNA-extractie (50 preparaten)

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Naylor, R. L., et al. A 20-year retrospective review of global aquaculture. Nature. 591 (7851), 551-563 (2021).
  2. Quesada, S. P., Paschoal, J. A. R., Reyes, F. G. R. Considerations on the aquaculture development and on the use of veterinary drugs: special issue for fluoroquinolones-a review. Journal of Food Science. 78 (9), 1321-1333 (2013).
  3. Defoirdt, T., Sorgeloos, P., Bossier, P. Alternatives to antibiotics for the control of bacterial disease in aquaculture. Current Opinion in Microbiology. 14 (3), 251-258 (2011).
  4. Stentiford, G. D., et al. New paradigms to help solve the global aquaculture disease crisis. PLOS Pathogens. 13 (2), 1006160(2017).
  5. Chen, H., et al. Tissue distribution, bioaccumulation characteristics and health risk of antibiotics in cultured fish from a typical aquaculture area. Journal of Hazardous Materials. 343, 140-148 (2018).
  6. Zhou, M., et al. Antibiotics control in aquaculture requires more than antibiotic-free feeds: A Tilapia farming case. Environmental Pollution. 268, 115854(2021).
  7. Feng, Y., et al. Ecological effects of antibiotics on aquaculture ecosystems based on microbial community in sediments. Ocean & Coastal Management. 224, 106173(2022).
  8. Shen, X., Jin, G., Zhao, Y., Shao, X. Prevalence and distribution analysis of antibiotic resistance genes in a large-scale aquaculture environment. Science of The Total Environment. 711, 134626(2020).
  9. Su, H., et al. Contamination of antibiotic resistance genes (ARGs) in a typical marine aquaculture farm: source tracking of ARGs in reared aquatic organisms. Journal of Environmental Science and Health, Part B. 55 (3), 220-229 (2020).
  10. Oliveira, R. V., Oliveira, M. C., Pelli, A. Disease infection by Enterobacteriaceae family in fishes: a review. Journal of Microbiology & Experimentation. 4 (5), 00128(2017).
  11. Barbosa, M. M. C., et al. Sorologia e suscetibilidade antimicrobiana em isolados de Escherichia coli de pesque-pagues. Arquivos do Instituto Biológico. 81 (1), 43-48 (2014).
  12. Valenzuela-Armenta, J. A., et al. Microbiological analysis of Tilapia and water in aquaculture farms from Sinaloa. Biotecnia. 20 (1), 20-26 (2018).
  13. Reza, R. H., Shipa, S. A., Naser, M. N., Miah, M. F. Surveillance of Escherichia coli in a fish farm of Sylhet, Bangladesh. Bangladesh Journal of Zoology. 48 (2), 335-346 (2021).
  14. Liao, C. -Y., et al. Antimicrobial resistance of Escherichia coli From aquaculture farms and their environment in Zhanjiang, China. Frontiers in Veterinary Science. 8, 806653(2021).
  15. Dewi, R. R., et al. Prevalence and antimicrobial resistance of Escherichia coli, Salmonella and Vibrio derived from farm-raised Red Hybrid Tilapia (Oreochromis spp.) and Asian Sea Bass (Lates calcarifer, Bloch 1970) on the west coast of Peninsular Malaysia. Antibiotics. 11 (2), 136(2022).
  16. Leimbach, A., Hacker, J., Dobrindt, U. E. coli as an all-rounder: the thin line between commensalism and pathogenicity. Current Topics in Microbiology and Immunology. 358, 3-32 (2013).
  17. Kaper, J. B., Nataro, J. P., Mobley, H. L. T. Pathogenic Escherichia coli. Nature Reviews Microbiology. 2 (2), 123-140 (2004).
  18. Croxen, M. A., Finlay, B. B. Molecular mechanisms of Escherichia coli pathogenicity. Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 26-38 (2010).
  19. Croxen, M. A., et al. Recent advances in understanding enteric pathogenic Escherichia coli. Clinical Microbiology Reviews. 26 (4), 822-880 (2013).
  20. Bertelli, C., Greub, G. Rapid bacterial genome sequencing: methods and applications in clinical microbiology. Clinical Microbiology and Infection. 19 (9), 803-813 (2013).
  21. Lynch, T., Petkau, A., Knox, N., Graham, M., Van Domselaar, G. A primer on infectious disease bacterial genomics. Clinical Microbiology Reviews. 29 (4), 881-913 (2016).
  22. Carriço, J. A., Rossi, M., Moran-Gilad, J., Van Domselaar, G., Ramirez, M. A primer on microbial bioinformatics for nonbioinformaticians. Clinical Microbiology and Infection. 24 (4), 342-349 (2018).
  23. Magaña-Lizárraga, J. A., et al. Draft genome sequence of Escherichia coli M51-3: a multidrug-resistant strain assigned as ST131-H30 recovered from infant diarrheal infection in Mexico. Journal of Global Antimicrobial Resistance. 19, 311-312 (2019).
  24. Pérez-Vázquez, M., et al. Emergence of NDM-producing Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Spain: phylogeny, resistome, virulence and plasmids encoding blaNDM-like genes as determined by WGS. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 74 (12), 3489-3496 (2019).
  25. Massella, E., et al. Snapshot study of whole genome sequences of Escherichia coli from healthy companion animals, livestock, wildlife, humans and food in Italy. Antibiotics. 9 (11), 782(2020).
  26. Magaña-Lizárraga, J. A., et al. Genomic profiling of antibiotic-resistant Escherichia coli isolates from surface water of agricultural drainage in north-western Mexico: detection of the international high-risk lineages ST410 and ST617. Microorganisms. 10 (3), 662(2022).
  27. Saracino, I. M., et al. Next Generation sequencing for the prediction of the antibiotic resistance in Helicobacter pylori: a literature review. Antibiotics. 10 (4), 437(2021).
  28. Ghosh, A., Saha, S. Survey of drug resistance associated gene mutations in Mycobacterium tuberculosis, ESKAPE and other bacterial species. Scientific Reports. 10 (1), 8957(2020).
  29. Su, M., Satola, S. W., Read, T. D. Genome-based prediction of bacterial antibiotic resistance. Journal of Clinical Microbiology. 57 (3), 01405-01418 (2019).
  30. Brzuszkiewicz, E., et al. Genome sequence analyses of two isolates from the recent Escherichia coli outbreak in Germany reveal the emergence of a new pathotype: Entero-Aggregative-Haemorrhagic Escherichia coli (EAHEC). Archives of Microbiology. 193 (12), 883-891 (2011).
  31. CLSI Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests. 13th ed. CLSI standard M02. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute. , Available from: https://clsi.org/standards/products/microbiology/documents/m02/ (2018).
  32. CLSI Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. 31st ed. CLSI supplement M100. Clinical and Laboratory Standards Institute. , Available from: https://clsi.org/standards/products/microbiology/documents/m100/ (2021).
  33. Ewing, B., Green, P. Base-calling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Research. 8 (3), 186-194 (1998).
  34. Quainoo, S., et al. Whole-genome sequencing of bacterial pathogens: the future of nosocomial outbreak analysis. Clinical Microbiology Reviews. 30 (4), 1015-1063 (2017).
  35. Desai, A., et al. Identification of optimum sequencing depth especially for de novo genome assembly of small genomes using next generation sequencing data. PLoS ONE. 8 (4), 60204(2013).
  36. Nishino, K., Yamada, J., Hirakawa, H., Hirata, T., Yamaguchi, A. Roles of TolC-dependent multidrug transporters of Escherichia coli in resistance to β-lactams. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (9), 3030-3033 (2003).
  37. Li, M., et al. The resistance mechanism of Escherichia coli induced by ampicillin in laboratory. Infection and Drug Resistance. 12, 2853-2863 (2019).
  38. Ménard, L. -P., Dubreuil, J. D. Enteroaggregative Escherichia coli heat-stable enterotoxin 1 (EAST1): a new toxin with an old twist. Critical Reviews in Microbiology. 28 (1), 43-60 (2002).
  39. Dubreuil, J. D. EAST1 toxin: An enigmatic molecule associated with sporadic episodes of diarrhea in humans and animals. Journal of Microbiology. 57 (7), 541-549 (2019).
  40. Goldstein, S., Beka, L., Graf, J., Klassen, J. L. Evaluation of strategies for the assembly of diverse bacterial genomes using MinION long-read sequencing. BMC Genomics. 20 (1), 23(2019).
  41. Guerrero, A., Gomez-Gil, B., Lizarraga-Partida, M. L. Genomic stability among O3:K6 V. parahaemolyticus pandemic strains isolated between 1996 to 2012 in American countries. BMC Genomic Data. 22 (1), 38(2021).
  42. FAO Applications of Whole Genome Sequencing (WGS) in food safety management. Food and Agriculture Organization of the United Nations. , Available from: https://www.fao.org/documents/card/es/c/61e44b34-b328-4239-b59c-a9e926e327b4/ (2016).
  43. Rantsiou, K., et al. Next generation microbiological risk assessment: opportunities of whole genome sequencing (WGS) for foodborne pathogen surveillance, source tracking and risk assessment. International Journal of Food Microbiology. 287, 3-9 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing
Posted by JoVE Editors on 2/02/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing. The Authors section was updated from:

José Antonio Magaña-Lizárraga1,
Bruno Gómez-Gil2,
Julissa Enciso-Ibarra2,
María Elena Báez-Flores1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, Ciudad Universitaria
2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

to:

José Antonio Magaña-Lizárraga1,
Bruno Gómez-Gil2,
Julissa Enciso-Ibarra2,
María Elena Báez-Flores1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa
2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

Trefwoorden

Antimicrobial ResistanceTilapia FarmingPathogenic BacteriaNext Generation SequencingAquaculture MicrobiologyPlasmid AnalysisVirulence GenesProphage Detection

Gerelateerde artikelen