Karakterisering van een pathogene Escherichia coli-stam afgeleid van Oreochromis spp. Boerderijen met behulp van whole-genome sequencing

Summary

De haalbaarheid van whole-genome sequencing (WGS) strategieën met behulp van benchtop instrumenten heeft de genoomondervraging van elke microbe van volksgezondheidsrelevantie in een laboratoriumomgeving vereenvoudigd. Een methodologische aanpassing van de workflow voor bacteriële WGS wordt beschreven en een bioinformatica pijplijn voor analyse wordt ook gepresenteerd.

Abstract

Aquacultuur is een van de snelst groeiende voedselproducerende sectoren ter wereld en tilapia (Oreochromis spp.) landbouw vormt de belangrijkste zoetwatervisvariëteit die wordt gekweekt. Omdat aquacultuurpraktijken gevoelig zijn voor microbiële besmetting afgeleid van antropogene bronnen, is uitgebreid antibioticagebruik nodig, wat ertoe leidt dat aquacultuursystemen een belangrijke bron worden van antibioticaresistente en pathogene bacteriën van klinische relevantie, zoals Escherichia coli (E. coli). Hier werden de antimicrobiële resistentie, virulentie en mobiloomkenmerken van een pathogene E. coli-stam , hersteld van in het binnenland gekweekte Oreochromis spp., opgehelderd door middel van whole-genome sequencing (WGS) en in silico-analyse . Antimicrobiële gevoeligheidstests (ASAT) en WGS werden uitgevoerd. Bovendien werden fylogenetische groep, serotype, multilocussequentietypering (MLST), verworven antimicrobiële resistentie, virulentie, plasmide en profaaginhoud bepaald met behulp van diverse beschikbare webtools. Het E. coli-isolaat vertoonde alleen intermediaire gevoeligheid voor ampicilline en werd gekarakteriseerd als ONT:H21-B1-ST40-stam door op WGS gebaseerde typering. Hoewel slechts één antimicrobieel resistentie-gerelateerd gen werd gedetecteerd [mdf(A)], werden verschillende virulentie-geassocieerde genen (VAGs) van het atypische enteropathogene E. coli (aEPEC) pathotype geïdentificeerd. Bovendien werd de lading plasmide replicons uit grote plasmidegroepen en 18 profaag-geassocieerde regio's gedetecteerd. Kortom, de WGS-karakterisering van een aEPEC-isolaat, hersteld van een viskwekerij in Sinaloa, Mexico, biedt inzicht in het pathogene potentieel en het mogelijke risico voor de menselijke gezondheid van het consumeren van rauwe aquaculturele producten. Het is noodzakelijk om next-generation sequencing (NGS) technieken te gebruiken voor het bestuderen van micro-organismen in het milieu en om een één gezondheidskader aan te nemen om te leren hoe gezondheidsproblemen ontstaan.

Introduction

Aquacultuur is een van de snelst groeiende voedselproducerende sectoren ter wereld en de productiepraktijken zijn bedoeld om te voldoen aan de stijgende vraag naar voedsel voor menselijke consumptie. De wereldwijde aquacultuurproductie is verdrievoudigd van 34 miljoen ton (Mt) in 1997 tot 112 Mt in 2017¹. De belangrijkste soortengroepen, die bijdroegen aan bijna 75% van de productie, waren zeewier, karpers, tweekleppigen, meervallen en tilapia (Oreochromis spp.) ¹. Het verschijnen van ziekten veroorzaakt door microbiële entiteiten is echter onvermijdelijk vanwege de intensieve viskweek, wat leidt tot potentiële ....

Protocol

OPMERKING: De E. coli-stam ACM5 werd teruggevonden door het vismonster te verwerken en te kweken voor fecale coliforme (FC) bepaling¹². Tijdens de visbemonstering vertoonden vissen geen klinische tekenen van ziekte, bacteriële of schimmelinfectie en heerste een gemiddelde temperatuur van 22,3 °C. Na isolatie werd het E. coli-isolaat onderworpen aan biochemische tests en gecryopreserveerd in hersenhartinfusie (BHI) bouillon met DMSO (8% v / v) als cryoprotectief middel.

1. Reactivering van bevroren E. coli ACM5-stamcultuur

1. Open van de bevroren bacteriële voorraad d....

Results

De antimicrobiële gevoeligheid werd bepaald door de schijfdiffusiemethode en geïnterpreteerd door CLSI-breekpuntcriteria voor 12 antibiotica verspreid over zes verschillende antimicrobiële klassen, dat wil zeggen aminoglycosiden, β-lactams, fluoroquinolonen, nitrofuranen, fenicolen en folaatrouteantagonisten. De E. coli ACM5 vertoonde gevoeligheid voor alle antibiotica behalve één β-lactamgeneesmiddel. Vier β-lactamgeneesmiddelen werden getest: ampicilline, carbenicilline, cefalotheïne en cefotaxime. Onder deze .......

Discussion

Deze studie presenteert een aanpassing van de bacteriële WGS-workflow met behulp van een benchtop sequencer en een pijplijn voor genomische karakterisering van een pathogene E. coli-variant . Afhankelijk van het gebruikte sequencingplatform kunnen de doorlooptijden (TATs) voor natte laboratoriumprocedures (bacteriekweek, gDNA-extractie, bibliotheekvoorbereiding en sequencing) en sequentieanalyse variëren, vooral als langzaam groeiende bacteriën worden bestudeerd. Volgens het hierboven beschreven protocol voor WG.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accublock Mini digital dry bath	Labnet	D0100	Dry bath for incubation of tubes
Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter	A63881	Magnetic beads in solution for DNA library purification
DeNovix DS-11	DeNovix Inc.		UV-Vis spectophotometer to check the quality of the gDNA extracted
DNA LoBind Tubes	Eppendorf	0030108418	1.5 mL PCR tubes for DNA library pooling
DynaMag-2 Magnet	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	12321D	Magnetic microtube rack used during magnetic beads-based DNA purification
Gram-negative Multibac I.D.	Diagnostic reseach (Mexico)	PT-35	Commercial standard antibiotic disks for antimicrobial susceptibility testing
MiniSeq Mid Output Kit (300-cycles)	Illumina	FC-420-1004	Reagent cartdrige for paired-end sequencing (2x150)
MiniSeq System Instrument	Illumina	SY-420-1001	Benchtop sequencer used for Next-generation sequencing
MiniSpin centrifuge	Eppendorf	5452000816	Standard centrifuge for tubes
Nextera XT DNA Library Preparation Kit	Illumina	FC-131-1024	Reagents to perform DNA libraries for sequencing. Includes Box 1 and Box 2 reagents for 24 samples
Nextera XT Index Kit v2	Illumina	FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004	Index set A, B, C, D
PhiX Control v3	Illumina	FC-110-3001	DNA library control for sequencing
Precision waterbath	LabCare America	51221081	Water bath shaker used for bacterial culture
Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	Q33231	Reagents for fluorescence-based DNA quantification assay
Qubit 2.0 Fluorometer	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	Q32866	Fluorometer used for fluorescence assay
Qubit Assay tubes	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	Q32856	0.5 mL PCR tubes for fluorescence-based DNA quantification assay
SimpliAmp Thermal Cycler	Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific	A24811	Thermocycler used for DNA library amplification
Spectronic GENESYS 10 Vis	Thermo	335900	Spectophotometer used for bacterial suspension in antimicrobial susceptibility testing
ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit	Zymo Research Inc.	D4300	Kit for genomic DNA extraction (50 preps)