Dit artikel presenteert een protocol voor oculaire microdissectie bij knaagdieren. Het proces omvat de enucleatie van de oogbol samen met het nictitating membraan (d.w.z. het derde ooglid). Dit wordt dan gevolgd door de scheiding van de achterste en voorste oogschelpen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De oculaire microdissectie van het knaagdieroog omvat de segmentatie van de enucleated oogbol met het aangehechte nictitating membraan, of derde ooglid, om de voorste en achterste oogschelpen te verkrijgen. Met deze techniek kunnen de subdelen van het oog, inclusief het hoornvliesweefsel, neuraal weefsel, retinale pigmentepitheel (RPE) weefsel en lens, worden verkregen voor wholemounts, cryo-sectie en / of eencellige suspensies van een specifiek oogweefsel. De aanwezigheid van het derde ooglid biedt unieke en significante voordelen, omdat het het behoud van de oriëntatie van het oog ten goede komt, wat belangrijk is voor het begrijpen van de oogfysiologie na een gelokaliseerde interventie of in studies met oculaire analyse met betrekking tot de ruimtelijke topografie van het oog.
Bij deze methode enucleeerden we de oogbol bij de oogkas samen met het derde ooglid door voorzichtig en langzaam door de extraoculaire spieren te snijden en de oogzenuw door te snijden. De oogbol werd met behulp van een microblade door de corneale limbus gestoken. De incisie werd gebruikt als het punt van binnenkomst, waardoor langs de cornea-sclerale overgang kon worden gesneden door microscharen door het incisiepunt in te brengen. Kleine en continue sneden langs de omtrek werden gemaakt totdat de kopjes gescheiden waren. Deze kunnen verder worden ontleed door de doorschijnende laag van het neurale netvlies voorzichtig af te pellen met behulp van een Colibri-hechttang om het neurale netvlies en de RPE-lagen te verkrijgen. Verder werden drie/vier equidistante sneden gemaakt van de periferie loodrecht op het optische centrum totdat de oogzenuw werd bereikt. Hierdoor werden de halfronde kopjes in een roosvorm geopend zodat ze plat vielen en gemakkelijk gemonteerd konden worden. Deze techniek is in ons lab gebruikt voor cornea wholemounts en retinale secties. De aanwezigheid van het derde ooglid bakent de nasale-temporele oriëntatie af, wat de studie van verschillende celtherapie-interventies na transplantatie mogelijk maakt en dus de gerichte fysiologische validatie die van vitaal belang is voor visualisatie en nauwkeurige weergave in dergelijke studies.
Inleiding
Oculaire dissectie is een belangrijke techniek in oogheelkundig onderzoek en heeft onderzoekers in staat gesteld om toegang te krijgen tot de segmenten van het oog voor gerichte studies. Eerder vertrouwden oculaire onderzoekers op het oogweefsel van zieke personen voor hun studies. Het geleidelijk groeiende aantal stammen van oogheelkundige knaagdiermodellen1 in de loop der jaren heeft echter de behoefte aan menselijk oogweefsel verminderd. Deze muizenstammen hebben een dieper begrip van oogziekten en interventies mogelijk gemaakt. Toch hebben ze ook een behoefte aan innovatieve technieken van oculaire microdissectie gegenereerd. De kleine omva....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Deze procedure werd goedgekeurd door de Institutional Animal Ethics Committee van het National Institute of Immunology, New Delhi. Het serienummer van de goedkeuring is IAEC#480/18. De experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de regelgevingsrichtlijnen van het Comité voor controle en toezicht op dierproeven, ministerie van Visserij, Veeteelt en Zuivel, regering van India, onder toezicht van een professionele dierenarts bij de SAF, NII.
1. Voorbereiding
- Verwijd de knaagdierogen met een druppel van 0,8% tropicamide en 5% fenylefrine oftalmische oplossingen in elk oog. Plaats het dier gedurende 30 minute....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een hele verzameling rd1 muis oog/hoornvliesweefsel werd voorbereid om potentiële lymfe-angiogenese in het voorste/hoornvliesweefsel in een zieke toestand te bestuderen. Het aangehechte conjunctivale weefsel van het derde ooglid fungeerde als een positieve controle, omdat het hoornvlies geen lymfevaten heeft. Voor het onderzoek werd het hoornvliesweefsel ontleed met het bindvlies en gefixeerd met 4% PFA, gevolgd door permeabilisatie en blokkering. Het weefsel werd vervolgens gekleurd met een primair antilichaam tegen de .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Oculaire microdissectie is een moeilijke taak gebleken vanwege de kleine omvang en bolvorm van het knaagdieroog, en het knaagdieroog vereist innovatieve technieken voor een efficiënte hantering8.
In de huidige gedemonstreerde methode wordt de enucleated muisoogbol verkregen met het derde ooglid bevestigd voor een effectieve en eenvoudige hantering. Met behulp van het derde ooglid kan de oogbol volledig worden geïmmobiliseerd, waardoor de dissectie gemakkelijk en met mi.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dr. Alaknanda Mishra, Department of Cell Biology and Human Anatomy, University of California Davis, USA, trainde ons in deze methode aan het National Institute of Immunology, New Delhi. Dit werk werd ondersteund door de kernsubsidie ontvangen van het Department of Biotechnology, Government of India aan het National Institute of Immunology, New Delhi. P.S. kreeg een onderzoeksbeurs van de afdeling Biotechnologie.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
```html
```
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Acetaminophen (Biocetamol) | EG Pharmaceuticals | Geen specifiek catalogusnummer (lokale aankoop) | |
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | Geen specifiek catalogusnummer (lokale aankoop) | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemische analyser voor leverfunctietest |
| Betadine (Povidon-Jodiumoplossing) | Win-Medicare; India | Geen specifiek catalogusnummer (lokale aankoop) | |
| Biologische veiligheidskast (klasse I) | Kartos international; India | Geen specifiek catalogusnummer (lokale aankoop) | |
| Heldere veld microscoop | Olympus, Japan | LX51 | |
| CBA/J ingebreide muizen | The Jackson Laboratory | Stock No. 000654 | |
| Cefotaxime (Taxim) | AlKem; India | cefotaxime natriuminjectie, geen specifiek catalogusnummer (lokale aankoop) | |
| Celzevener | Sigma; VS | CLS431752 | |
| Collageenase Type I | Gibco by Life Technologies | 17100-017 | |
| Wattenstaafjes | Pure Swabs Pvt Ltd; India | Geen specifiek catalogusnummer (lokale aankoop) | |
| DPX-medium | Sigma; VS | 6522 | |
| Drape Sheet | JSD Surgicals, Delhi, India | Geen specifiek catalogusnummer (lokale aankoop) | |
| Eosine Y-oplossing, alcoholisch | Sigma; VS | HT110132 | |
| Pincetten | Major Surgicals; India | Geen specifiek catalogusnummer (lokale aankoop) | |
| Gasanesthesiesysteem | Ugo Basile; Italië | 211000 | |
| Glucose | Himedia, India | GRM077 | |
| Haarverwijderingscrème (Veet) | Reckitt Benckiser, India | Geen specifiek catalogusnummer (lokale aankoop) | |
| Hematoxylinfoplossing, Mayer's | Sigma; VS | MHS16 | |
| Heparine-natriumzout | Himedia; India | RM554 | |
| Hyaluronidase uit schapentesten | Sigma; VS | H6254 | |
| I.V. Cannula (Plusflon) | Mediplus, India | Ref 1732411420 | |
| Insuline-spuit | BD; VS | REF 303060 | |
| Isofluraan (Forane) | Asecia Queenborough | Geen B506 | Inhalatieanesthesie |
| Ketamine (Ketamax) | Troikaa Pharmaceuticals Ltd. | Ketaminehydrochloride IP, geen specifiek catalogusnummer (lokale aankoop) | |
| Meloxicam (Melonex) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | Geen specifiek catalogusnummer (lokale aankoop) | |
| Micronaaldhouders recht & gebogen | Mercian; Engeland | BS-13-8 | |
| Micronaaldhouders recht & gebogen | Mercian; Engeland | BS-13-8 | |
| Microtoom | Histo-Line Laboratories, Italië | MRS3500 | |
| Nylondraad | Mighty; India | Geen specifiek catalogusnummer (lokale aankoop) | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Refresh Tears/Eyemist Gel | Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India | P3060 | Geen specifiek catalogusnummer |
| RPMI | Himedia; India | Geen specifiek catalogusnummer (lokale aankoop) | |
| Scalpel | Major Surgicals; India | Geen specifiek catalogusnummer (lokale aankoop) | |
| Scharen | Major Surgicals; India | Geen specifiek catalogusnummer (lokale aankoop) | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | Geen specifiek catalogusnummer (lokale aankoop) | |
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | Geen specifiek catalogusnummer (lokale aankoop) | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation; VS | Geen specifiek catalogusnummer | |
| Sucrose | Sigma; VS | S0389 | |
| Chirurgisch mes nr. 22 | La Medcare, India | Geen specifiek catalogusnummer (lokale aankoop) | |
| Chirurgisch bord | Locaal gemaakt | Geen specifiek catalogusnummer (lokale aankoop) | |
| Chirurgisch wit plakband | 3M India; India | 1530-1 | Micropore chirurgisch plakband |
| Hechtdraad | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| Spuiten (1 ml, 26 G) | Dispo Van; India | Geen specifiek catalogusnummer (lokale aankoop) | |
| Trimmer (Klipper) | Philips | NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005 | |
| Weegmachine | Braun | Geen specifiek catalogusnummer (lokale aankoop) | |
| William's E Media | Himedia; India | AT125 | |
| Xylazine (Xylaxin) | Indian Immunologicals Limited | Sedativum, pre-anestheticum, pijnstiller en spierverslapper |
Referenties
- Choi, Y., et al. Studying cancer immunotherapy using patient-derived xenografts (PDXs) in humanized mice. Experimental and Molecular Medicine. 50 (8), 1-9 (2018).
- Sutherland, C., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
