Een methode om α-synucleïnetoxiciteit en -aggregatie te bestuderen met behulp van een gehumaniseerd gistmodel

Summary

Een in vivo fysiologisch model van α-synucleïne is nodig om de pathogenese van de ziekte van Parkinson te bestuderen en te begrijpen. We beschrijven een methode om de cytotoxiciteit en geaggregeerde vorming van α-synucleïne te monitoren met behulp van een gehumaniseerd gistmodel.

Abstract

De ziekte van Parkinson is de tweede meest voorkomende neurodegeneratieve aandoening en wordt gekenmerkt door progressieve celdood veroorzaakt door de vorming van Lewy-lichamen die verkeerd gevouwen en geaggregeerde α-synucleïne bevatten. α-synucleïne is een overvloedig presynaptisch eiwit dat de handel in synaptische blaasjes reguleert, maar de accumulatie van de eiwithoudende insluitsels resulteert in neurotoxiciteit. Recente studies hebben aangetoond dat verschillende genetische factoren, waaronder bacteriële chaperonnes, de vorming van α-synucleïneaggregaten in vitro kunnen verminderen. Het is echter ook belangrijk om het anti-aggregatie-effect in de cel te monitoren om dit toe te passen als een potentiële behandeling voor de patiënten. Het zou ideaal zijn om neuronale cellen te gebruiken, maar deze cellen zijn moeilijk te hanteren en het duurt lang om het anti-aggregatiefenotype te vertonen. Daarom is een snel en effectief in vivo instrument nodig voor de verdere evaluatie van de in vivo anti-aggregatieactiviteit. De hier beschreven methode werd gebruikt om het anti-aggregatiefenotype in de gehumaniseerde gist Saccharomyces cerevisiae, die menselijke α-synucleïne tot expressie bracht, te controleren en te analyseren. Dit protocol demonstreert in vivo hulpmiddelen die kunnen worden gebruikt voor het monitoren van α-synucleïne-geïnduceerde cellulaire toxiciteit, evenals de vorming van α-synucleïneaggregaten in cellen.

Introduction

De ziekte van Parkinson (PD) is een ernstig probleem voor vergrijzende samenlevingen wereldwijd. De aggregatie van α-synucleïne is nauw verbonden met PD en eiwitaggregaten van α-synucleïne worden veel gebruikt als moleculaire biomarker voor het diagnosticeren van de ziekte¹. α-synucleïne is een klein zuur eiwit (140 aminozuren lang) met drie domeinen, namelijk de N-terminale lipide-bindende α-helix, het amyloïde-bindende centrale domein (NAC) en de C-terminale zure staart². Het verkeerd vouwen van α-synucleïne kan spontaan optreden en leidt uiteindelijk tot de vorming van amyloïde aggregaten genaamd....

Protocol

1. Voorbereiding van media en oplossingen

1. Media voorbereiding
   1. Om YPD-medium te bereiden, lost u 50 g YPD-poeder op in dH₂O om een laatste volume van 1 L. Autoclaaf voor sterilisatie te maken. Bewaren bij kamertemperatuur (RT).
   2. Om YPD agar medium te maken, lost u 50 g YPD-poeder en 20 g agar op in 1 L dH₂O. Autoclaaf voor sterilisatie. Na het afkoelen op petrischalen gieten. Bewaren bij 4 °C.
   3. Om SC te maken met raffinose (SRd)-Ura medium, los 6,7 g giststikstofbase op met ammoniumsulfaat en zonder aminozuren in 795 ml dH₂O. Autoclaaf voor sterilisatie. Voeg voor gebruik 100 ml 20% ....

Results

Van de hoge expressie van α-synucleïne is bekend dat deze verband houdt met neuronale celdood en PD in modelsystemen van PD. Deze studie beschrijft drie methoden om de cytotoxiciteit van α-synucleïne en de focivorming van geaggregeerde α-synucleïne in gist te monitoren. Hier werd de α-synucleïne overexpressie in gist en werden de fenotypen van wild-type α-synucleïne en drie varianten van α-synucleïne bekend als familiale mutanten van PD onderzocht (figuur 1 en de tabel met materialen.......

Discussion

Gezien de complexiteit van verschillende cellulaire systemen bij mensen, is het voordelig om gist te gebruiken als een model voor het bestuderen van menselijke neurodegeneratieve ziekten. Hoewel het bijna onmogelijk is om de complexe cellulaire interacties van het menselijk brein met behulp van gist te onderzoeken, hebben gistcellen vanuit een eencellig perspectief een hoge mate van gelijkenis met menselijke cellen in termen van de genomische sequentie homologie en fundamentele eukaryote cellulaire processen

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well plate	SPL	30096
Agarose	TAESHIN	0158
Bacto Agar	BD Difco	214010
Breathe-easy	diversified biotech	BEM-1	Gas permeable sealing membrane for microtiter plates
cover glasses	Marienfeld		24 x 60 mm
Culture tube	SPL	40014
Cuvette	ratiolab	2712120
D-(+)-Galactose	sigma	G0625
D-(+)-Glucose	sigma	G8270
D-(+)-Raffinose pentahydrate	Daejung	6638-4105
Incubator (shaking)	Labtron		model: SHI1
Incubator (static)	Vision scientific		model: VS-1203PV-O
LiAc	sigma	L6883
Microplate reader	Tecan	30050303 01	Model: Infinite 200 pro
multichannel pipette 20-200 µL	gilson	FA10011
multichannel pipette 2-20 µL	gilson	FA10009
Olympus microscope	Olympus	IX-53
PEG	sigma	P4338	average mol wt 3,350
Petridish	SPL	10090
pRS426			Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. & Hieter, P. Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors. Gene. 110 (1), 119-122 (1992).
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A30P			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A53T			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein E46K			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein WT			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
Reservoir	SPL	23050
Spectrophotometer	eppendorf	6131 05560
W303a			Present from James Bardwell
Yeast nitrogen base w/o amino acids	Difco	291940
Yeast synthetic drop-out medium supplements without uracil	sigma	Y1501
YPD	Condalab	1547.00