Het verouderende slakkenhuis in beeld brengen met light-sheet fluorescentiemicroscopie

Summary

Er werd een lichtplaatmicroscoop ontwikkeld om het hele slakkenhuis in beeld te brengen en te digitaliseren.

Abstract

Doofheid is de meest voorkomende zintuiglijke beperking en treft ongeveer 5% of 430 miljoen mensen wereldwijd volgens de Wereldgezondheidsorganisatie¹. Veroudering of presbycusis is een primaire oorzaak van perceptief gehoorverlies en wordt gekenmerkt door schade aan haarcellen, spiraalvormige ganglionneuronen (SGN's) en de stria vascularis. Deze structuren bevinden zich in het slakkenhuis, dat een complexe, spiraalvormige anatomie heeft van vliezige weefsels die in vloeistof zijn gesuspendeerd en omgeven door bot. Deze eigenschappen maken het technisch moeilijk om histopathologische veranderingen te onderzoeken en te kwantificeren. Om aan deze behoefte te voldoen, ontwikkelden we een lichtplaatmicroscoop (TSLIM) die het hele slakkenhuis in beeld kan brengen en digitaliseren om de studie van structuur-functierelaties in het binnenoor te vergemakkelijken. Goed uitgelijnde seriële secties van het hele slakkenhuis resulteren in een stapel afbeeldingen voor driedimensionale (3D) volumeweergave en segmentatie van individuele structuren voor 3D-visualisatie en kwantitatieve analyse (d.w.z. lengte, breedte, oppervlak, volume en aantal). Cochleae vereisen minimale verwerkingsstappen (fixatie, ontkalking, uitdroging, kleuring en optische clearing), die allemaal compatibel zijn met daaropvolgende beeldvorming met hoge resolutie door scanning en transmissie-elektronenmicroscopie. Omdat alle weefsels in de stapels aanwezig zijn, kan elke structuur afzonderlijk of ten opzichte van andere structuren worden beoordeeld. Omdat beeldvorming fluorescerende sondes gebruikt, kunnen immunohistochemie en ligandbinding bovendien worden gebruikt om specifieke structuren en hun 3D-volume of -verdeling binnen het slakkenhuis te identificeren. Hier gebruikten we TSLIM om slakkenhuizen van oude muizen te onderzoeken om het verlies van haarcellen en spiraalvormige ganglionneuronen te kwantificeren. Daarnaast werden geavanceerde analyses (bijv. clusteranalyse) gebruikt om lokale reducties van spiraalvormige ganglionneuronen in het kanaal van Rosenthal langs het 3D-volume te visualiseren. Deze benaderingen tonen het vermogen van TSLIM microscopie aan om structuur-functierelaties binnen en tussen slakkenhuizen te kwantificeren.

Introduction

Het slakkenhuis is het perifere sensorische orgaan voor het gehoor bij zoogdieren. Het heeft een complexe spiraalvormige anatomie van herhalende sensorische en ondersteunende cellen die anatomisch gespecialiseerd zijn om geluidstrillingen te detecteren en deze naar de hersenen door te geven voor de perceptie van het gehoor. De belangrijkste sensorische elementen zijn de binnenste en buitenste haarcellen en hun innervervende zenuwvezels waarvan de cellichamen het spiraalvormige ganglion vormen, dat zich in het kanaal van Rosenthal bevindt (figuur 1). Deze sensorische en neurale structuren zijn tonotopisch zo gerangschikt dat hoogfrequente ....

Protocol

Alle procedures en het gebruik van levende dieren zijn beoordeeld en goedgekeurd (Protocol ID # 2010-38573A) door de University of Minnesota Institutional Care and Use Committee (IACUC) en onderzoekers die deze dieren gebruiken, zijn grondig getraind en getest door de Research Animal Resources (RAR) Dierenartsen voordat ze toegang hebben tot de dierfaciliteiten. Zowel mannelijke als vrouwelijke muizen werden gebruikt in deze studie.

1. Cochlea-verwijdering voor fixatie en weefselverwerking voor beeldvorming

1. Euthanaseer een muis met behulp van CO 2-inhalatie. Onthoofd de muis met een schaar en maak een d....

Results

Omdat het thema van dit speciale nummer het in beeld brengen van de effecten van veroudering in het slakkenhuis is, zal een jong (3 maanden oud, HS2479, CBA-stammuis) en oud (23 maanden oud, HS2521, C57-stammuis) slakkenhuis als voorbeeld worden gebruikt. Opgemerkt moet worden dat TSLIM in staat is om een verscheidenheid aan exemplaren af te beelden, waaronder slakkenhuizen van mensen, zoogdieren, andere knaagdieren en vissen, evenals andere organen zoals de hersenen.

Johnson et al.

Discussion

Optische doorsnede door lichtplaatmicroscopie voor onderzoek van cochleaire structuren is niet mechanisch destructief zoals andere meer traditionele histologische methoden, en het biedt een volledig digitaal beeld van cochleaire structuren ten opzichte van elkaar. Eerdere methoden zoals oppervlaktepreparaten van het orgaan van Corti¹⁴ leverden een kaart op van haarcelverlies langs de lengte van het basilaire membraan, maar SGN-verlies kon niet worden beoordeeld omdat het weefsel was ontleed om het.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amira 3D Rendering Software	ThermoFisher Scientific		Address: 501 90th Ave NW, Coon Rapids, MN 55433
benzyl benzoate (W213810)	Sigma-Aldrich, Inc.		Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178
Bondic	Bondic		Address: 235 Industrial Parkway S., Unit 18 Aurora, ON L4G 3V5 Canada
Ethanol 95% and 100%	University of Minnesota		Address: General Storehouse, Minneapolis, MN 55455
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)  (E5134)	Sigma-Aldrich, Inc.		Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178
LabVIEW graphical program and Vision	National Instruments		Address: 11500 N Mopac Expwy Austin, TX 78759-3504
methyl salicylate (M6742)	Sigma-Aldrich, Inc.		Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178
Olympus MVX10 dissection microscope	Olympus Corp		Address: 3500 Corporate Parkway, Center Valley, PA 18034
Rhodamine B isothiocynate, (283924)	Sigma-Aldrich, Inc.		Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178
Starna Flurometer Cell (3-G-20)	Starna Cells		Address: PO Box 1919, Atascadero, CA 82423