Methodenartikel

Een oplosbare tetrazolium-gebaseerde reductietest om het effect van antilichamen op Candida tropicalis biofilms te evalueren

DOI:

10.3791/64425

⸱

16 september 2022

 ,  , 
1Department of Biosciences and Bioengineering, Indian Institute of Technology Roorkee

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een 96-well microtiter plaat-gebaseerd protocol met behulp van een 2,3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfofenyl)-5-carboxanilide-2H-tetrazolium (XTT) reductietest wordt hierin beschreven, om de effecten van antilichamen op biofilms gevormd door C. tropicalis te bestuderen. Dit in vitro protocol kan worden gebruikt om het effect van potentiële nieuwe antischimmelverbindingen op de metabole activiteit van Candida-soortencellen in biofilms te controleren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Candida-soorten zijn de vierde meest voorkomende oorzaak van systemische nosocomiale infecties. Systemische of invasieve candidiasis omvat vaak biofilmvorming op geïmplanteerde apparaten of katheters, wat geassocieerd is met verhoogde virulentie en mortaliteit. Biofilms geproduceerd door verschillende Candida-soorten vertonen een verhoogde weerstand tegen verschillende antischimmelmiddelen. Daarom is het nodig om effectieve immunotherapieën of aanvullende behandelingen tegen Candida-biofilms te ontwikkelen. Hoewel de rol van cellulaire immuniteit goed is ingeburgerd bij anti-Candida-bescherming, is de rol van humorale immuniteit minder bestudeerd.

Er is verondersteld dat remming van biofilmvorming en rijping een van de belangrijkste functies van beschermende antilichamen is, en Candida albicans kiembuisantistoffen (CAGTA) hebben aangetoond dat ze in vitro groei en biofilmvorming van C. albicans eerder onderdrukken. Dit artikel schetst een gedetailleerd protocol voor het evalueren van de rol van antilichamen op biofilms gevormd door C. tropicalis. De methodologie voor dit protocol omvat C. tropicalis biofilmvorming in 96-well microtiter platen, die vervolgens werden geïncubeerd in de aan- of afwezigheid van antigeen-specifieke antilichamen, gevolgd door een 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfofenyl)-5-carboxanilide-2H-tetrazolium (XTT) test voor het meten van de metabole activiteit van schimmelcellen in de biofilm.

De specificiteit werd bevestigd door het gebruik van geschikte serumcontroles, waaronder Sap2-specifiek antilichaam-uitgeput serum. De resultaten tonen aan dat antilichamen in het serum van geïmmuniseerde dieren de rijping van candida-biofilm in vitro kunnen remmen. Samenvattend biedt dit artikel belangrijke inzichten met betrekking tot het potentieel van antilichamen bij het ontwikkelen van nieuwe immunotherapieën en synergetische of aanvullende behandelingen tegen biofilms tijdens invasieve candidiasis. Dit in vitro protocol kan worden gebruikt om het effect van potentiële nieuwe antischimmelverbindingen op de metabole activiteit van Candida-soortencellen in biofilms te controleren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Systemische candidiasis is de vierde belangrijke oorzaak van nosocomiale infecties, die wereldwijd worden geassocieerd met hoge morbiditeits- en sterftecijfers. Wereldwijd treft systemische candidiasis ongeveer 700.000 personen1. Candida-soorten, namelijk C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata en C. auris, zijn de meest voorkomende oorzaak van invasieve Candida-infecties 2. Candida-soorten zijn opportunistische pathogenen die biofilms produceren3. Biofilms worden voornamelijk geassocieerd met Candida virulentie, en Candida kan bestand zijn tegen oxidatieve en osmotische stressomstandigheden door biofilmvorming te induceren4. Biofilms moduleren verder de expressie van virulentiefactoren en celwandcomponenten en vormen een exopolymere beschermende matrix, waardoor Candida zich kan aanpassen aan verschillende gastheerniches4. Biofilms dragen bij tot de hechting van gist op gastheerweefsels en medische instrumenten5. Als zodanig is biofilmvorming geassocieerd met een voordeel voor gisten, omdat gistcellen in de biofilms de immuunrespons van de gastheer kunnen ontwijken6. Biofilmvorming beschermt ook de pathogene gisten tegen de werking van antischimmelmiddelen5. Verminderde gevoeligheid van C. albicans biofilms voor amfotericine B is aangetoond door Pierce et al.7,8. Bovendien tonen biofilms antischimmelresistentie tegen fluconazol, wat een effectief beheer van systemische candidiasis schaadt 9,10.

Microben hebben een intrinsieke neiging om zich te hechten aan verschillende biotische en abiotische oppervlakken, wat resulteert in biofilmvorming. Candida albicans, een dimorfe schimmel, komt voor in gist- en hyphale vormen en de biofilmvorming ervan is gekarakteriseerd in verschillende in vitro en in vivo modelsystemen11. De stappen van biofilmvorming omvatten de hechting van Candida-cellen aan het substraat, filamentatie, proliferatie en biofilmrijping11. Aanvankelijk hecht de gistvorm van C. albicans zich aan substraten, waaronder medische hulpmiddelen en menselijk weefsel, gevolgd door filamentatie en proliferatie van C. albicans in hyphale en pseudohyphale vormen, en ten slotte rijping van biofilms ingebed in extracellulaire matrix11. Biofilmvorming draagt grotendeels bij aan C. albicans pathogenese mechanismen12. Candida-soorten vormen resistente biofilms, waardoor hun uitroeiing uitdagendis 13. Een kleine subgroep van de C. albicans biofilmproducerende populatie is beschreven als zeer resistent tegen de antischimmelmiddelen amfotericine B en chloorhexidine14. Van belang is dat gistcellen in biofilms een hoge weerstand vertonen tegen multidrugtherapie in vergelijking met gistcellen in de planktonfase en proliferatiefase14. Er is gesuggereerd dat gistcellen in biofilms zeer tolerant zijn voor antischimmelmiddelen, wat bijdraagt aan de overleving van C. albicans in biofilms14. Deze bestaande cellen waren fenotypische varianten van C. albicans en geen mutanten14. Bovendien zijn cellen van Candida-biofilms die bekend staan als "persistercellen" tolerant voor hoge doses amfotericine-B-behandeling en dragen ze bij aan de overleving van Candida, waardoor ze een grote last vormen van terugkerende systemische Candida-infecties bij personen met een hoog risico15.

De toename van antischimmelresistentie bij Candida-stammen vereist onderzoek naar nieuwe antischimmelmiddelen en immunotherapieën. Zoals blijkt uit de bovengenoemde studies, tonen Candida-biofilms een verminderde gevoeligheid voor antischimmelmiddelen. Daarom is er behoefte aan verbeterde immunotherapieën om candida biofilmvorming onder controle te houden. Eerdere studies hebben aangetoond dat CAGTA effectieve bescherming kan bieden tegen systemische Candida-infecties door de vorming van C. albicans biofilm in vitrote remmen 16. Een andere studie meldde dat immunisatie van muizen met C. albicans rAls3-N-eiwit hoge antilichaamtiters induceert die interfereren met de vorming van C. albicans biofilm in vitro17. Anti-Als3-N antilichamen oefenden ook een remmend effect uit op C. albicans dispersie uit biofilms17. NDV-3A-vaccin op basis van C. albicans wordt momenteel klinisch getest en anti-NDV-3A-sera bleken ook de vorming van C. auris-biofilm te verminderen18. Een recente studie identificeerde remming van biofilmvorming door Sap2-antilichamen als een beschermingsmechanisme in een muizenmodel van systemische candidiasis19.

Dit artikel schetst een gedetailleerd in vitro protocol voor het evalueren van het effect van antigeenspecifieke antilichamen aanwezig in polyklonaal serum verkregen uit verschillende groepen Sap2-gevaccineerde muizen op voorgevormde Candida tropicalis-biofilms . Om dit te bereiken, werd een methode op basis van een XTT-reductietest geoptimaliseerd en ontwikkeld in het laboratorium, die de levensvatbaarheid van biofilm op een snelle, gevoelige en high-throughput manier kan meten, in de aan- of afwezigheid van antilichamen.

De XTT-test wordt gebruikt om cellulaire metabole activiteit te meten als een indicator van de levensvatbaarheid van cellen, cellulaire proliferatie en cytotoxiciteit20. Deze colorimetrische test is gebaseerd op de reductie van een geel tetrazoliumzout, natrium 3'-[1-(fenylaminocarbonyl)-3,4-tetrazolium]-bis (4-methoxy-6-nitro) benzeensulfonzuurhydraat (XTT) tot een oranje formazankleurstof door metabolisch actieve cellen. Omdat alleen levensvatbare cellen XTT kunnen verminderen, is de hoeveelheid verminderde XTT-formazan evenredig met de intensiteit van kleur en levensvatbaarheid van cellen. De gevormde formazankleurstof is wateroplosbaar en wordt direct gekwantificeerd met behulp van een plaatlezer. Vanwege de in water oplosbare aard maakt de XTT-test de studie van intacte biofilms mogelijk, evenals het onderzoek van de gevoeligheid van biofilmgeneesmiddelen, zonder verstoring van de biofilmstructuur21. Bovendien wordt deze methode geïmplementeerd in Candida schimmel levensvatbaarheid beoordelingen vanwege het gebruiksgemak, snelheid, nauwkeurigheid, hoge doorvoer en hoge mate van reproduceerbaarheid 7,22.

Naast de XTT-reductietest zijn er ook tal van alternatieve technieken geïdentificeerd voor het meten van de hoeveelheid biofilm. Sommige hiervan omvatten het gebruik van de MTT-reductietest, kristalvioletkleuring, DNA-kwantificering, kwantitatieve PCR, eiwitkwantificering, droge celgewichtmeting en levensvatbare kolonietelling. Deze procedures variëren sterk in termen van hun tijd- en kostenvereisten. Taff et al. voerden een vergelijkende analyse uit van zeven verschillende Candida biofilm quantitatie assays en vonden dat de XTT assay de meest reproduceerbare, nauwkeurige en efficiënte methode leverde voor de kwantitatieve schatting van C. albicans biofilms23. Kleuringstechnieken zoals kristalviolet hebben bepaalde beperkingen; de kristalviolettest bepaalt indirect de hoeveelheid biofilm door de optische dichtheid van de met kristalvioleten gekleurde biofilmmatrix en cellen te meten. Hoewel de kristalviolettest een goede maat voor de biofilmmassa biedt, geeft het geen maat voor de levensvatbaarheid van de biofilm, omdat het zowel microbiële cellen als de extracellulaire matrixkleurt 24. Dhale et al. rapporteerden verder dat de XTT-reductietest de meest gevoelige, reproduceerbare, nauwkeurige, efficiënte en specifieke methode was om biofilmproductie te detecteren in vergelijking met kristalviolettest25. Literatuurrapporten hebben aangetoond dat de XTT-test goed correleert met de CFU / ml-parameter in de CFU-telmethode. In vergelijking met de XTT-test is de CFU-methode echter arbeidsintensief en traag26. Bovendien is de fractie van losse levende cellen mogelijk niet representatief voor de initiële biofilmpopulatie27. Hoewel de XTT-reductietest de best beschikbare optie lijkt om de levensvatbaarheid te kwantificeren, zijn er een paar beperkingen van deze techniek. Hoewel de XTT-methode nuttig is voor vergelijkingen met één schimmelstam, kan het gebruik ervan beperkt zijn bij het vergelijken van verschillende schimmelstammen en soorten. Interstrain-vergelijkingen kunnen moeilijk zijn bij gebrek aan gedetailleerde standaardisatie, omdat verschillende stammen substraten metaboliseren met verschillende mogelijkheden21.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BALB/c muizen werden ondergebracht in de Small Animal Facility bij IIT Roorkee. Alle dieren werden gehouden in een 12 h:12 h licht:donker cyclus bij 25 °C en werden voorzien van een pelletdieet en water ad libitum. Alle dierprocedures zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Ethics Committee (IAEC) van IIT Roorkee.

1. Bereiding van C. tropicalis

OPMERKING: De schimmel Candida tropicalis behoort tot de pathogenen van risicogroep 2 en is geclassificeerd als een BSL2-micro-organisme. Gebruik altijd gecertificeerde klasse II biologische veiligheidskasten bij het werken met Candida-soorten . Oefen aseptische en steriele technieken tijdens het werken met C. tropicalis en volg de aanbevolen bioveiligheidsprocedures voor een goede verwijdering van deze ziekteverwekker.

  1. Streak C. tropicalis (stam ATCC 750) op een Sabouraud dextrose (SAB) agar plaat.
  2. Bereid een 's nachts gekweekte kweek van C. tropicalis door een enkele kolonie van de SAB-agarplaat in een steriele conische buis van 50 ml met 10 ml SAB-bouillonmedium te enten. U kunt ook een bevroren glycerolvoorraad van C. tropicalis gebruiken en 100 μL van de glycerolvoorraad inenten in een steriele erlenmeyer van 250 ml met 50 ml SAB-bouillonmedium.
  3. Incubeer C. tropicalis cultuur in een orbitale shaker bij 180 rpm bij 30 °C gedurende 24-48 h.
  4. Centrifugeer de schimmelcultuur (cellen in logaritmische fase) bij 2.150 × g gedurende 15 minuten bij 21 °C.
  5. Gooi het supernatant weg en voeg 50 ml steriele 1x PBS toe aan de pellet. Was en resuspendeer de pellet in steriele 1x PBS met zachte vortexing.
  6. Centrifugeer opnieuw bij 2.150 × g gedurende 15 minuten bij 21 °C. Gooi het supernatant weg en resuspendeer de schimmelkorrel in 10 ml steriele 1x PBS.
  7. Bereken de concentratie van cellen door te tellen met een hemocytometer.
  8. Bereid schimmelvoorraden met een uiteindelijke dichtheid van 1,0 × 106 cellen / ml in RPMI 1640 morfolinepropanenulfonzuur (MOPS) medium. Gebruik de celsuspensie uit stap 1.6 onmiddellijk.
    OPMERKING: Om één 96-well plaat op te zetten, is het totale benodigde schimmelbestandvolume 10 ml (100 μL / put). Schaal indien nodig.

2. C. tropicalis biofilmvorming

  1. Bereid Candida-biofilms in een polystyreen microtiterplaat met 96 goed platte bodem zoals eerder beschreven (figuur 1)28,29.
  2. Voeg 100 μL C. tropicalis-cultuur (uit 106 cellen/ml bouillon, bereid zoals hierboven) toe aan een 96-well microtiterplaat met behulp van een meerkanaals pipet (figuur 2A). Houd de laatste twee kolommen (11 en 12) als 'geen schimmel plus serum' en 'geen schimmel en geen serum' negatieve controles door geen schimmelcellen toe te voegen. Vul kolommen 11 en 12 met alleen 100 μL RPMI 1640 MOPS-medium.
  3. Bedek de microtiterplaat met een deksel en aluminiumfolie. Incubeer de plaat gedurende 24 uur bij 37 °C onder stationaire omstandigheden.
  4. De volgende dag ademt u het medium voorzichtig op met een meerkanaals pipet (zonder de biofilms aan te raken of te verstoren). Tik de plaat voorzichtig in omgekeerde positie op vloeiplaten om eventuele resten te verwijderen.
  5. Was de plaat met 200 μL 1x PBS (per putje) met een meerkanaals pipet. Voeg PBS heel voorzichtig toe langs de zijwanden van de put om te voorkomen dat biofilms worden verstoord. Aspirateer de PBS voorzichtig met behulp van een meerkanaals pipet. Herhaal de PBS-was 2x (in totaal drie wasbeurten).
  6. Om overtollige PBS te verwijderen, droogt u de plaat (zonder deksel) gedurende 30 minuten aan de lucht bij kamertemperatuur, in een biologische veiligheidskast.

3. Behandeling van biofilm met antilichamen

OPMERKING: Biofilms kunnen nu worden verwerkt voor het beoordelen van de remming van biofilmrijping door antilichamen. Muizenserum werd gebruikt als bron van polyklonale antilichamen. Verschillende groepen sap2-geïmmuniseerde (Sap2-albicans, Sap2-tropicalis en Sap2-parapsilosis) samen met sham-geïmmuniseerde muizen werden retro-orbitaal gebloed en serum werd geïsoleerd zoals eerder beschreven19. De aanwezigheid van anti-Sap2-antilichamen werd bevestigd met sap2-specifieke ELISA zoals eerder beschreven19.

  1. Voer warmte-inactivatie van het serum (bron van polyklonale antilichamen) uit bij 56 °C gedurende 30 minuten vóór gebruik om de rol van complement in de remmende activiteit uit te sluiten. Inactiveer het serum op warmte voordat u de serumverdunning maakt.
    OPMERKING: Gebruik serum van sham-geïmmuniseerde muizen, preimmune muizen en Sap2-specifiek antilichaam-uitgeput serum als aanvullende controles19. Antilichaam-uitgeput serum werd bereid volgens een eerdere studie19. Onder de seriële verdunningen (1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1,600, 1:3,200, 1:6,400 en 1:12,800) voor serum getest in dit protocol, werd remming van biofilmrijping waargenomen bij 1:25, 1:50 en 1:100; daarom werd 1:50 geselecteerd om een evenwicht te vinden tussen remming en serumconsumptie.
  2. Bereid seriële verdunningen van warmte-geïnactiveerde serummonsters in steriel RPMI 1640 MOPS-medium (1:50). Gebruik een gemeenschappelijke serumverdunning (1:50) voor alle serummonsters die moeten worden getest op remming van biofilmrijping30.
  3. Voeg 100 μL van de geselecteerde serumverdunning toe aan elk putje van de 96-well microtiterplaat. Voeg voor elk monster serumverdunningen in tweevoud toe volgens de bijgevoegde lay-out (figuur 2B).
    1. Voeg in kolom 10 geen serumverdunning toe; voeg alleen RPMI 1640 MOPS-medium toe voor de schimmel-only positieve controle.
      OPMERKING: Kolom 10, rijen G1-G8 en H1-H8 hadden aanvankelijk schimmelcellen in RPMI-MOPS. Hoewel RPMI-MOPS zelfs na 24 uur aan kolom 10 werd toegevoegd, dienden rijen G1-G8 als PBS-controle en rijen H1-H8 als no-serumcontrole na 24 uur.
    2. Voeg in kolom 11 een 1:50 verdunning van serum toe aan alle putten om te dienen als de geen schimmel plus serumnegatieve controle.
    3. Voeg in kolom 12 geen serumverdunning toe aan een put; houd dit als de geen schimmel geen serum negatieve controle.
  4. Bedek de plaat met een deksel en aluminiumfolie. Incubeer de plaat gedurende 24 uur bij 37 °C.

4. Schatting van de metabole activiteit van biofilm

  1. De volgende dag aspirateer het serum voorzichtig met behulp van een meerkanaals pipet (zonder de biofilms aan te raken of te verstoren). Tik de plaat zachtjes in omgekeerde positie op de vlekkenvellen om eventuele restserum te verwijderen.
  2. Was de plaat met 200 μL 1x PBS (per put) met behulp van een meerkanaals pipet en voeg de PBS toe langs de zijwanden van de put om te voorkomen dat de biofilms worden verstoord. Adem de PBS voorzichtig aan met een meerkanaals pipet en herhaal de PBS-was 2x (in totaal drie wasbeurten). Droog de plaat (zonder deksel) gedurende 30 minuten aan de lucht bij kamertemperatuur, in een biologische veiligheidskast om overtollige PBS te drogen.
  3. Bereiding van XTT/menadion:
    1. Bereid XTT in steriel Ringers Lactaat als een 0,5 g/L oplossing. Los 25 mg XTT op in 50 ml filter-gesteriliseerd Ringers Lactaat. Aliquot 10 ml in afzonderlijke buizen bedekt met aluminiumfolie en bewaren bij -80 °C.
    2. Bereid menadion als een bouillon van 10 mM. Los 8,6 mg menadion op in 5 ml aceton en verdeel 50 μL in 100 afzonderlijke microbuisjes. Bewaar de aliquots bij -80 °C.
    3. Bereid XTT/menadione-oplossing vlak voor gebruik door 10 ml XTT in te nemen en 1 μL menadion toe te voegen om een werkoplossing van 1 μM te verkrijgen.
  4. Voeg 100 μL XTT/menadionoplossing toe per putje van de 96-well microtiterplaat. Bedek de plaat met een deksel en aluminiumfolie. Incubeer de plaat gedurende 2 uur bij 37 °C in het donker.
  5. Breng 80 μL van het gekleurde supernatant uit elke put over in een verse 96-well plaat. Lees de plaat af bij 490 nm.
  6. Bereken het gemiddelde van de absorptiewaarden van de putten in kolom 10 (alleen schimmelpositieve controle), die als referentiewaarde zal dienen voor de berekening van het percentage biofilmremming door elk serummonster met behulp van vergelijking (1).
    % Biofilm remming = 100 - figure-protocol-1× 100 (1)

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Candida tropicalis biofilms werden gekweekt in 96-well microtiter platen en in beeld gebracht op 40x met behulp van een omgekeerde microscoop (figuur 1A). De biofilm werd verder gekleurd met kristalviolet en waargenomen bij 40x met behulp van een omgekeerde microscoop (figuur 1B). Scanning elektronenmicroscopie toont een representatief beeld van C. tropicalis biofilm (figuur 1C). Voor het uitvoeren van de biofilm r...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schimmelinfecties veroorzaakt door Candida-soorten worden geassocieerd met hoge morbiditeits- en sterftecijfers wereldwijd. De groeiende dreiging van invasieve schimmelinfectie vereist het vroege beheer van dergelijke levensbedreigende ziekten. De meeste Candida-infecties omvatten de vorming van biofilms, die zich hechten aan een verscheidenheid aan medische hulpmiddelen en verantwoordelijk zijn voor de persistentie en herhaling van schimmelinfecties in ziekenhuisomgevingen31. Bi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de Ramalingaswami-subsidie DBT-843-BIO (Department of Biotechnology, Government of India) en Early Career Research Award SER-1058-BIO (Science and Engineering Research Board, Government of India) aan S.R. De auteurs erkennen een ICMR-JRF-subsidie aan P.C. en DBT-JRF-subsidie aan P.S. De auteurs bedanken Dr. Ravikant Ranjan voor suggesties over het manuscript en technische assistentie door de heer Pradeep Singh Thakur tijdens SEM.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
15 mL conische centrifugeerbuisjesBD Falcon546021
1x PBS-Bereid in labNaCl : 4 g
KCl : 0,1 g
Na2HPO4:  0,72 g
KH2PO4 : 0,12 g
Water 500 mL. Breng pH aan tot 7,4
50 mL conische centrifugeerbuisjesBD Falcon546041
96-well microtiter platenNunc442404
IncubatorGeneriek
MenadioneSigmaM5625
Microtiter Plate ReaderGeneriek
Multikanaals pipet en tipsGeneriek
PetrischalenTarson460090
Ringers Lactate-Bereid in labnatriumchloride 0,6 g natriumlactaat 0,312 g kaliumchloride 0,035 g calciumchloride 0,027 g Water 100 mL. Breng aan tot pH 7,0 
RPMI 1640 MOPSHimediaAT180
Sabouraud dextrose AgarSRL24613
Sabouraud dextrose BrothSRL24835
XTT InvitrogenX6493

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R. O., Denning, D. W. Global and multi-national prevalence of fungal diseases-estimate precision. Journal of Fungi. 3 (4), 57(2017).
  2. Pappas, P., Lionakis, M., Arendrup, M., Ostrosky-Zeichner, L., Kullberg, B. J. Invasive candidiasis. Nature Reviews Disease Primers. 4, 18026(2018).
  3. Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).
  4. Pemmaraju, S. C., Padmapriya, K., Pruthi, P. A., Prasad, R., Pruthi, V. Impact of oxidative and osmotic stresses on Candida albicans biofilm formation. Biofouling. 32 (8), 897-909 (2016).
  5. Cavalheiro, M., Teixeira, M. C. Candida biofilms: threats, challenges, and promising strategies. Frontiers in Medicine. 5, 28(2018).
  6. Roilides, E., Simitsopoulou, M., Katragkou, A., Walsh, T. J. How biofilms evade host defenses. Microbiology Spectrum. 3 (3), 3(2015).
  7. Pierce, C. G., et al. A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing. Nature Protocols. 3 (9), 1494-1500 (2008).
  8. Pierce, C. G., Uppuluri, P., Tummala, S., Lopez-Ribot, J. L. A 96 well microtiter plate-based method for monitoring formation and antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Journal of Visualized Experiments. (44), e2287(2010).
  9. Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., López-Ribot, J. L. Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 49 (6), 973-980 (2002).
  10. Quindós, G. Epidemiology of candidaemia and invasive candidiasis. A changing face. Revista Iberoamericana de Micología. 31 (1), 42-48 (2014).
  11. Tournu, H., Van Dijck, P. Candida biofilms and the host: models and new concepts for eradication. International Journal of Microbiology. 2012, 845352(2012).
  12. Wall, G., Montelongo-Jauregui, D., Vidal Bonifacio, B., Lopez-Ribot, J., Uppuluri, P. Candida albicans biofilm growth and dispersal: contributions to pathogenesis. Current Opinion in Microbiology. 52, 1-6 (2019).
  13. Sardi, J. C. O., Scorzoni, L., Bernardi, T., Fusco-Almeida, A. M., Mendes Giannini, M. J. S. Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options. Journal of Medical Microbiology. 62, 10-24 (2013).
  14. LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3839-3846 (2006).
  15. Galdiero, E., et al. Eradication of Candida albicans persister cell biofilm by the membranotropic peptide gH625. Scientific Reports. 10 (1), 5780(2020).
  16. Carrano, G., et al. Anti-Candida albicans germ tube antibodies reduce in vitro growth and biofilm formation of C. albicans. Revista Iberoamericana de Micología. 36 (1), 9-16 (2019).
  17. Alqarihi, A., Singh, S., Edwards, J. E., Ibrahim, A. S., Uppuluri, P. NDV-3A vaccination prevents C. albicans colonization of jugular vein catheters in mice. Scientific Reports. 9 (1), 6194(2019).
  18. Singh, S., et al. The NDV-3A vaccine protects mice from multidrug resistant Candida auris infection. PLoS Pathogens. 15 (8), 1007460(2019).
  19. Shukla, M., Rohatgi, S. Vaccination with secreted aspartyl proteinase 2 protein from Candida parapsilosis can enhance survival of mice during C. tropicalis-mediated systemic candidiasis. Infection and Immunity. 88 (10), 00312-00320 (2020).
  20. Roehm, N. W., Rodgers, G. H., Hatfield, S. M., Glasebrook, A. L. An improved colorimetric assay for cell proliferation and viability utilizing the tetrazolium salt XTT. Journal of Immunological Methods. 142 (2), 257-265 (1991).
  21. Kuhn, D. M., Balkis, M., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Uses and limitations of the XTT assay in studies of Candida growth and metabolism. Journal of Clinical Microbiology. 41 (1), 506-508 (2003).
  22. Nett, J. E., Cain, M. T., Crawford, K., Andes, D. R. Optimizing a Candida biofilm microtiter plate model for measurement of antifungal susceptibility by tetrazolium salt assay. Journal of Clinical Microbiology. 49 (4), 1426-1433 (2011).
  23. Taff, H. T., Nett, J. E., Andes, D. R. Comparative analysis of Candida biofilm quantitation assays. Medical Mycology. 50 (2), 214-218 (2012).
  24. Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. Journal of Microbiological Methods. 72 (2), 157-165 (2008).
  25. Dhale, R. P., Ghorpade, M. V., Dharmadhikari, C. A. Comparison of various methods used to detect biofilm production of Candida species. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 8 (11), 18-20 (2014).
  26. Moffa, E. B., et al. Interaction between XTT assay and candida albicans or streptococcus mutans viability. Journal of International Oral Health. 8 (1), 12(2016).
  27. Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
  28. Harriott, M. M., Noverr, M. C. Ability of Candida albicans mutants to induce Staphylococcus aureus vancomycin resistance during polymicrobial biofilm formation. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 54 (9), 3746-3755 (2010).
  29. Pierce, C. G., et al. A novel small molecule inhibitor of Candida albicans biofilm formation, filamentation and virulence with low potential for the development of resistance. NPJ Biofilms and Microbiomes. 1, 15012(2015).
  30. Dekkerová, J., Lopez-Ribot, J. L., Bujdáková, H. Activity of anti-CR3-RP polyclonal antibody against biofilms formed by Candida auris, a multidrug-resistant emerging fungal pathogen. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (1), 101-108 (2019).
  31. Muzny, C. A., Schwebke, J. R. Biofilms: an underappreciated mechanism of treatment failure and recurrence in vaginal infections. Clinical Infectious Diseases. 61 (4), 601-606 (2015).
  32. Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. Fungal biofilms and drug resistance. Emerging Infectious Diseases. 10 (1), 14-19 (2004).
  33. Taff, H. T., Mitchell, K. F., Edward, J. A., Andes, D. R. Mechanisms of Candida biofilm drug resistance. Future Microbiology. 8 (10), 1325-1337 (2013).
  34. Singh, R., Kumari, A., Kaur, K., Sethi, P., Chakrabarti, A. Relevance of antifungal penetration in biofilm-associated resistance of Candida albicans and non-albicans Candida species. Journal of Medical Microbiology. 67 (7), 922-926 (2018).
  35. Gulati, M., Ennis, C. L., Rodriguez, D. L., Nobile, C. J. Visualization of biofilm formation in Candida albicans using an automated microfluidic device. Journal of Visualized Experiments. (130), e56743(2017).
  36. Krom, B. P., Willems, H. M. In vitro models for Candida biofilm development. Candida Species. , Humana Press. New York, NY. 95-105 (2016).
  37. Gu, W., Xu, D., Guo, D., Zhang, L., Sun, S. In vivo models for Candida albicans biofilms study, research & reviews. Journal of Microbiology and Biotechnology. 5 (1), 26-31 (2016).
  38. Shukla, M., Chandley, P., Rohatgi, S. The role of B-cells and antibodies against Candida vaccine antigens in invasive candidiasis. Vaccines. 9 (10), 1159(2021).
  39. Bujdáková, H., et al. Antibody response to the 45 kDa Candida albicans antigen in an animal model and potential role of the antigen in adherence. Journal of Medical Microbiology. 57 (12), 1466-1472 (2008).
  40. Bujdáková, H., Paulovicová, E., Paulovicová, L., Simová, Z. Participation of the Candida albicans surface antigen in adhesion, the first phase of biofilm development. FEMS Immunology & Medical Microbiology. 59 (3), 485-492 (2010).
  41. Chupácová, J., Borghi, E., Morace, G., Los, A., Bujdáková, H. Anti-biofilm activity of antibody directed against surface antigen complement receptor 3-related protein-comparison of Candida albicans and Candida dubliniensis. Pathogens and Disease. 76 (1), 127(2018).
  42. Gulati, M., et al. In vitro culturing and screening of Candida albicans biofilms. Current Protocols in Microbiology. 50 (1), 60(2018).
  43. Ramage, G. Comparing apples and oranges: considerations for quantifying candidal biofilms with XTT [2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfo-phenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide] and the need for standardized testing. Journal of Medical Microbiology. 65 (4), 259-260 (2016).
  44. Kovács, R., et al. Synergistic effect of nikkomycin Z with caspofungin and micafungin against Candida albicans and Candida parapsilosis biofilms. Letters in Applied Microbiology. 69 (4), 271-278 (2019).
  45. Fernández-Calderón, M. C., et al. Antifungal and anti-biofilm activity of a new Spanish extract of propolis against Candida glabrata. BMC Complementary Medicine and Therapies. 21 (1), 1-10 (2021).
  46. Li, Z., et al. Synergistic effect of pseudolaric acid B with fluconazole against resistant isolates and biofilm of Candida tropicalis. Infection and Drug Resistance. 13, 2733-2743 (2020).
  47. Chatzimoschou, A., Giampani, A., Meis, J. F., Roilides, E. Activities of nine antifungal agents against Candida auris biofilms. Mycoses. 64 (4), 381-384 (2021).
  48. Haney, E. F., Trimble, M. J., Cheng, J. T., Vallé, Q., Hancock, R. Critical assessment of methods to quantify biofilm growth and evaluate antibiofilm activity of host defence peptides. Biomolecules. 8 (2), 29(2018).
  49. Puri, S., et al. Secreted aspartic protease cleavage of Candida albicans Msb2 activates Cek1 MAPK signaling affecting biofilm formation and oropharyngeal candidiasis. PLoS One. 7, 46020(2012).
  50. Staib, P., et al. Tetracycline-inducible expression of individual secreted aspartic proteases in Candida albicans allows isoenzyme-specific inhibitor screening. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (1), 146-156 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Candida biofilmenantilichaamremmingXTT assaybiofilmvormingantimycoticaserumcontrolesmicrotiterplaatbiofilmrijpingvaccinkandidaten

Gerelateerde artikelen