Methodenartikel

AirID-gebaseerde nabijheidsetikettering voor eiwit-eiwitinteractie in planten

DOI:

10.3791/64428

⸱

16 september 2022

 ,  ,  ,  , 
1College of Bioscience and Biotechnology, Yangzhou University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een stapsgewijs protocol voor het uitvoeren van het proximity-labeling (PL)-experiment in komkommer (Cucumis sativus L.) met behulp van AT4G18020 (APRR2)-AirID-eiwit als model. De methode beschrijft de constructie van een vector, de transformatie van een construct door agro-infiltratie, biotine-infiltratie, eiwitextractie en zuivering van biotine-gelabelde eiwitten door middel van affiniteitszuiveringstechniek.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In zoogdiercellen en -planten zijn benaderingen van nabijheidsetikettering (PL) met behulp van gemodificeerd ascorbaatperoxidase (APEX) of de Escherichia coli-biotineligase BirA (bekend als BioID) succesvol gebleken bij het identificeren van eiwit-eiwitinteracties (PPI's). APEX, BioID en TurboID, een herziene versie van BioID, hebben naast waardevolle technologieën ook enkele beperkingen. De recent ontwikkelde AirID, een nieuwe versie van BioID voor nabijheidsidentificatie in eiwit-eiwitinteracties, heeft deze beperkingen overwonnen. Eerder werd AirID gebruikt in diermodellen, terwijl de huidige studie het gebruik van AirID in planten aantoont, en de resultaten bevestigden dat AirID beter presteert in plantsystemen in vergelijking met andere PL-enzymen zoals BioID en TurboID voor eiwitetikettering die proximaal zijn van de doeleiwitten. Hier is een stapsgewijs protocol voor het identificeren van eiwitinteractiepartners met behulp van AT4G18020 (APRR2) eiwit als model. De methoden beschrijven de constructie van vector, de transformatie van construct door agro-infiltratie, biotinetransformatie, extractie van eiwitten en verrijking van biotine-gelabelde eiwitten door middel van affiniteitszuiveringstechniek. De resultaten concluderen dat AirID een nieuw en ideaal enzym is voor het analyseren van PPI's in planten. De methode kan worden toegepast om andere eiwitten in planten te bestuderen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Verschillende cellulaire eiwitten werken onder het biologisch regulerende systeem, en eiwit-eiwitinteracties (PPI's) maken deel uit van dit systeem en vormen de basis van veel cellulaire processen. Naast PPI's wordt de functie van natuurlijke eiwitten posttranslationeel bevorderd via verschillende modificaties, zoals de vorming van complex, ubiquitinatie en fosforylering. Daarom is het bestuderen van PPI's belangrijk voor het begrijpen van de mogelijke functie van doeleiwitten. PPI's zijn uitgevoerd met behulp van verschillende technologieën, zoals massaspectrometrie-analyse na immunoprecipitatie (IP-MS-analyse)1, gist-twee-hybride systeem (Y2H)2, ook celvrije arrays3. Deze methoden onderzochten verschillende essentiële bevindingen op het gebied van onderzoek. Deze methoden hebben echter enkele nadelen; Y2H is bijvoorbeeld een tijdrovende, dure strategie die het noodzakelijk maakt om de Y2H-bibliotheek van de doelsoort op te bouwen.

Bovendien maakt de Y2H-techniek gebruik van gist, een heteroloog eencellig eukaryoot organisme, dat de cellulaire toestand van hogere eukaryote cellen niet nauwkeurig kan weergeven. De IP-MS is ongeschikt voor eiwitten met een hoge hydrofobiciteit en vertoont een lage efficiëntie bij het opvangen van zwakke PPI's. Verschillende essentiële eiwitten in planten, zoals nucleotide-bindende domein en leucine-rijke repeat-bevattende (NLR) eiwitten en receptorachtige kinasen (RLK's) worden op een laag niveau tot expressie gebracht en interageren meestal tijdelijk met andere eiwitten; Daarom is het gebruik van deze methoden onvoldoende om de mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan de regulatie van deze eiwitten3.

Een nieuwe techniek genaamd proximity-biotinylatie (PB) helpt onderzoekers bij het identificeren van PPI's. PB is afhankelijk van PL-enzymen, die zich hechten aan het eiwit van belang (POI), en wanneer partnereiwit in de buurt van POI komt, hecht de PL een chemisch biotinelabel aan het partnereiwit. Verder kan het gelabelde eiwit worden geïdentificeerd en kan het snel weten welk partnereiwit zich hecht aan het doeleiwit5. Eerdere studies hebben aangetoond dat BioID en TurboID succesvolle hulpmiddelen zijn voor PPI's, vooral in planten, maar ze hebben bepaalde beperkingen4. BioID heeft een hoog gehalte aan biotine nodig voor het labelen van partnereiwitten, wat meer dan 16 uur duurt. In vergelijking met BioID is de TurboID voordeliger omdat het eiwit in 10 minuten labelt en het partnereiwit bij kamertemperatuur (RT) kan labelen. Het is onder bepaalde omstandigheden ook giftig voor cellen en labelt die eiwitten die geen interactie vertonen met het eiwit van belang.

Om deze problemen op te lossen, is AirID, ontwikkeld door Kido et al., efficiënter dan de rest van de etiketteringsenzymen, hoewel de sequentieovereenkomst 82% is tussen BioID en AirID5. Om de efficiëntie van AirID te controleren, voerden we een experiment uit door gebruik te maken van een POI met bekende medewerkers. Dit experiment bevestigde dat AirID ongetwijfeld geassocieerde eiwitten in plantencellen kon labelen. AirID is een waardevol enzym voor het analyseren van PPI's in vitro en in cellen. Het creëert minder toxiciteit en is minder foutief in tijdrovende processen dan TurboID om niet-partners te taggen, wat leidt tot het doden van de cel. Het toont aan dat AirID concurrerender is dan andere etiketteringsenzymen voor nabijheidsbiotinylering. Het is nauwkeuriger, heeft meer potentieel in tijdrovende processen en is minder toxisch in vitro en in levende cellen. Het huidige protocol beschrijft de identificatie van interagerende eiwitten van APRR2 met behulp van AirID als PL-enzym; bovendien kan de methode worden toegepast op andere eiwitten om PPI's in plantensoorten te onderzoeken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bereiding van plantmateriaal

  1. Cucumis sativus (komkommer) wordt gebruikt voor experimentele analyse. Leg de zaden in water, incubeer ze gedurende 20 minuten bij 50 °C en leg de zaden vervolgens 12-16 uur op filtreerpapier op een petrischaal.
  2. Breng de zaden daarna over naar potten met aarde (commercieel gekocht) en kweek ze in een klimaatkamer bij een temperatuur van 23 °C en 16 uur licht en 8 uur donkere fotoperiode.
  3. Houd de planten 3-4 weken in de klimaatkamer totdat de planten 3 of 4 bladstadia hebben bereikt voor een succesvolle agro-infiltratie.

2. AirID construeren

  1. Gebruik APRR2 als doeleiwit en construeer APRR2-AirID onder de Bloemkoolmozaïekvirus 35S-promotor (p35S: APRR2-AirID). Introduceer het in de Gateway-compatibele binaire vector pEarleyGate1006 (geleverd door Dr. Kathrin Schrick, Kansas State University), en synthetiseer het PL-enzym rechtstreeks volgens de volgorde in aanvullend bestand 1.

3. Bereiding van competente cellen

  1. Bereiding van DH5α-competente cellen
    1. Inoculeer de 2 ml LB (10 g/l trypton, 5 g/l gistextract en 10 g/l NaCl; pH = 7,0.) met E.Coli DH5α-cellen (rechtstreeks uit de bevroren bouillon zonder te ontdooien) en laat ze een nacht groeien (O/N) bij 37 °C.
    2. Inoculeer vers 0,1%-0,5% inoculum van de O/N-cultuur in 100 ml LB Medium en kweek de cellen tot OD600 tussen 0,4-0,6 bereikt en incubeer de cultuur vervolgens bij 4 °C gedurende 30 minuten.
    3. Neem de cultuur in twee centrifugebuisjes van 50 ml en draai ze gedurende 5 minuten bij 4 °C rond op 2500 x g.
    4. Gooi het supernatant weg, resuspendeer de cellen in 10 ml 0,1 M ijskoud CaCl2 en zet ze 15 minuten op ijs. Pelleteer de cellen met een centrifuge van 2500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    5. Resuspendeer de cellen in 1 ml ijskoude 0,1 M CaCl2 + 20% glycerol, aliquot 100 μL in elk buisje van 1,5 ml en bewaar ze onmiddellijk bij -80 °C.
  2. Bereiding van GV3101 competente cellen
    1. Inoculeer 2 ml LB (met 50 μg/ml gentamycine en 25 μg/ml rifampicine) met een enkele GV3101-kolonie. Incubeer de cultuur O/N bij 28 °C en schud bij 250 omw/min.
    2. Inoculeer 200 ml LB met 1 ml verzadigde nachtcultuur. Schud de cultuur bij 250 omw/min en incubeer bij 28 °C tot de OD600 gelijk is aan 0,5.
    3. Breng de cultuur over in vier voorgekoelde steriele centrifugebuisjes van 50 ml en zet deze 30 minuten op ijs.
    4. Pellet de cellen op 2500 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatans weg en leg de pellets op ijs.
    5. Resuspendeer de cellen in 10 ml 0,1 M ijskoude CaCl2-oplossing . Bundel de cellen samen in een voorgekoelde Oakridge-buis van 50 ml.
    6. Pellet de cellen op 1.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatans weg en resuspendeer de cellen in 10 ml ijskoude CaCl2-oplossing . Zet 30 minuten op ijs.
    7. Pellet de cellen op 1.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatans weg en resuspendeer de cellen in 2 ml 0,1 M ijskoude CaCl2-oplossing .
    8. doseer de cellen in een aliquot van 50 μl in voorgekoelde steriele polypropyleen buisjes. Bewaar de cellen bij -80 °C.

4. Agro-infiltratie

  1. Breng eerst het plasmide over naar agrobacterium
    1. Breng 2,5 μl van het plasmide dat is gegenereerd uit stap 2.1 over naar de competente cellen van de agrobacterium tumefaciens GV3101-stam en incubeer gedurende 30 minuten op ijs.
    2. Breng de buis met het plasmide en de competente cellen gedurende 3 minuten over in vloeibare stikstof.
    3. Hitteschok bij 37 °C gedurende 5 minuten in een incubator en leg de buis vervolgens 2 minuten op ijs.
    4. Voeg 1.000 μL LB-medium (10 g/l trypton, 5 g/l gistextract en 10 g/l NaCl; pH = 7,0) toe aan de agrobacterie en incubeer gedurende 1 uur bij 30 °C en 118 rpm.
    5. Centrifugeer op 3.000 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C.
    6. Gooi de bovenste 800 μL van de oplossing weg en meng de resterende oplossing. Plak het vervolgens op LB (zoals vermeld in stap 4.1.4 toegevoegd met agar en 50 μg/ml kanamycine voor plasmide en 50 μg/ml gentamycine en 25 μg/ml rifampicine voor GV3010-competente cellen). Incubeer de platen gedurende 48 uur bij 30 °C.
      OPMERKING: Het is beter om enkele kolonies te kiezen en PCR uit te voeren om het gen van belang te bevestigen7.
  2. Pak enkele bacteriekolonies van de platen en doe ze in LB-media plus geschikte antibiotica (zie stap 4.1.6). Incubeer bij 30 °C en 218 tpm gedurende 36-48 uur.
  3. Centrifugeer de cellen bij 3.000 x g gedurende 2 minat 4 °C. Resuspendeer de cellen tot OD600 = 1,0 in agro-infiltratiebuffer (10 mM MgCl2, 10 mM MES, pH = 5,6, 250 μM acetosyringon).
  4. Infiltreer het entmateriaal (gegenereerd uit stap 4.3) in de (abaxiale) epidermis met behulp van een naaldloze spuit van 1 ml.
    OPMERKING: Het is beter om het hele blad te infiltreren en ervoor te kiezen om te repliceren. Gebruik voor 4-5 planten één constructie. Voor elk blad is 1,5 ml geresuspendeerde agrobacteriën voldoende.
  5. Houd de planten gedurende 36 uur in de klimaatkamer met een 16 uur licht (ongeveer 75 μmol·m-2·s-1) en 8 uur donkere fotoperiode bij 23 °C.
  6. Infiltreer na 36 uur constructinfiltratie 1 ml 5 μM biotine (in 10 mM MgCl2-oplossing ) in de reeds geïnfiltreerde bladeren van het construct.
  7. Onderhoud de behandelde planten nog 4-12 uur voordat u het bladweefsel oogst.
    OPMERKING: Volgens de vorige studie piekt het doeleiwit na 36 uur, dus kies 36 hpi-biotine-infiltraties 4,6. De incubatietijd voor biotine hangt af van het doelonderzoek, maar volgens het huidige experiment is een incubatietijd van 8 uur geschikter voor het labelen van eiwitten.

5. Monsterneming

NOTITIE: Alle materialen voor monsterafname moeten steriel zijn om keratinebesmetting te voorkomen, en alle protocolstappen moeten worden uitgevoerd in een contaminatievrije omgeving.

  1. Snijd de geïnfiltreerde bladeren en breng ze snel over naar vloeibare stikstof om eiwitafbraak te voorkomen.
  2. Voer de pre-detectie van eiwit uit door middel van immunoblotanalyses6; dit wordt ten zeerste aanbevolen vóór co-immunoprecipitatie (Co-IP).

6. Totale eiwitextractie uit blad

  1. Maal de bladeren fijn met een vijzel, voeg snel 2 ml 1x PBS-BSA PH 7.4 toe en maal langzaam.
  2. Neem een conische buis van 15 ml, plaats een filter voor snelfiltratiemateriaal bovenop de conische buis, breng het monstermengsel over naar de buis via het filter voor snelfiltratiemateriaal en bewaar het op ijs.
  3. Breng de monsters over in een buisje van 2 ml en voeg een cocktail van 1% eiwitremmers toe.
  4. Meng de inhoud door 7-8 keer naar boven en naar beneden te draaien en centrifugeer op 1.000 x g gedurende 2 min bij 4 °C.
  5. Breng het bovenste oplosmiddel van de monsters over in nieuwe buisjes van 2 ml, voeg 10% β-D-maltoside (β-D.M.) toe en plaats ze 5 minuten op ijs. Centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.

7. Breng de ontziltingskolom in evenwicht

  1. Centrifugeer de kolom bij 1.000 x g gedurende 1 minuut bij 4 °C.
    NOTITIE: Markeer één kant van de kolom en zorg ervoor dat de gemarkeerde kant naar buiten wijst tijdens alle centrifugeerprocessen.
  2. Verwijder de boven- en onderklep van de kolom en centrifugeer gedurende 2 minuten bij 4 °C bij 1.000 x g .
  3. Gooi de vloeibare oplossing uit de opvangbuis van de kolom en voeg 5 ml 1x PBS-buffer toe om te wassen.
  4. Centrifugeer de kolom bij 1.000 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C.
  5. Herhaal de stappen 7.3 en 7.4 minstens vijf keer.

8. Magnetische kralen wassen

  1. Neem een buisje van 1,5 ml en voeg 50 μL streptavidine-C1-geconjugeerde magnetische kralen toe.
  2. Voeg 1 ml 1x PBS-BSA toe om te wassen, meng grondig en plaats gedurende 3 minuten op de magneetstandaard. Gooi de supernatant weg.
  3. Herhaal stap 8.2 minstens drie keer.
  4. Plaats na elke wasbeurt de buis op het magnetische rek om de kralen naar één kant van de buis te adsorberen om de wasbuffer te verwijderen.

9. Verrijking van gebiotinyleerde eiwitten

  1. Voeg 2 ml van de monsters toe aan de kolom en centrifugeer gedurende 8 minuten bij 4 °C bij 1.000 x g .
  2. Voeg 1 ml van het ontzoute eiwitextract toe aan 50 μL streptavidine-C1-geconjugeerde magnetische kralen om ze in evenwicht te brengen.
  3. Plaats de buis op de rotator op normale snelheid zodat de oplossing grondig mengt en gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT) incubeert.
  4. Plaats de kralen 3 minuten op het magnetische rek bij RT, of totdat ze zich aan één kant van de buis verzamelen, om het supernatant voorzichtig te verwijderen.
  5. Voeg 1 ml wasbuffer I (2% SDS in water) toe, draai 2 minuten op RT op een rotator en herhaal stap 9.4.
  6. Plaats de buis op de rotator op RT gedurende 2 minuten na het toevoegen van 1 ml wasbuffer II (50 mM HEPES: pH = 7.5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.1% deoxycholzuur [w/v] en 1% Triton X-100). Herhaal stap 9.4.
  7. Voeg 1 ml wasbuffer III toe (10 mM Tris-HCl: pH = 7,4, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 0,1% deoxycholzuur [w/v], 1% NP40 [v/v]) en draai met een shaker gedurende 2 minuten op RT. Herhaal vervolgens stap 9.4.
  8. Om het wasmiddel te verwijderen, voegt u 1,7 ml 50 mM Tris-HCl (pH = 7,5) toe en herhaalt u stap 9.4. Herhaal deze stap nog een keer.
  9. Was de parels zes keer gedurende 2 minuten in 1 ml ammoniumbicarbonaatbuffer van 50 mM bij RT en herhaal stap 9.4.
  10. Voeg 50 μL van het eiwitextract met 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 12% (m/v) sucrose (Suc), 2% (w/v) lithiumlaurylsulfaat en 1,5% (w/v) dithiothreitol toe aan de korrels, hitteschok in de incubator bij 100 °C gedurende 5 minuten en volg stap 9.4. Bewaar het supernatans bij -80 °C voor LC-MS/MS-analyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Volgens eerder onderzoek is het komkommergen APRR2 het kandidaat-gen dat de kleur van witte onrijpe vruchten regelt8. Hier werd een protocol ontwikkeld met behulp van AirID als een nabijheidslabelenzym om het interagerende partnereiwit van APRR2 in komkommer te vinden. Het construct werd overgebracht naar de komkommerbladeren en na 36 uur na infiltratie werd biotine overgebracht. Na 48 uur werden de monsters genomen voor western blot-analyse om de succesvolle transformatie te bev...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In het huidige experiment werd AirID gebruikt voor nabijheidslabeling, die Kido et al. ontwikkelden door middel van een algoritme van voorouderlijke enzymreconstructie met behulp van een grote genoomdataset en vijf conventionele BirA-enzymen5. Willekeurige mutaties werden gebruikt in traditionele evolutionaire eiwitengineering om de activiteit te verbeteren 9,10 omdat willekeurige mutaties geen dynamische sequentieveranderingen kunnen vero...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaarden dat er geen sprake was van belangenverstrengeling.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (Grant No. 32000197 to X.H.), de Special Financial Grant van de China Postdoctoral Science Foundation (Grant No. 2019T120467 to X.H.)

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AcetosyringoneBeijing solaribo science and technology Co.LtdS1519
Acryyl/Bis 30% oplossingSangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd1510KA4528
AgarBioFroxx GmbHD64683
Agarosetsingke (Shanghai) Co.LtdTSJ001
AmmoniumbicarbonaatSangon Biotech (Shanghai) Co.LtdG313BA0018
BiotineBBI life SciencesG908BA0012
CaCl2BBI life SciencesE209BA0008
Competent cellen GV3101Gemaakt in het huidige experiment
OntzoutingskolomThermo scientificWC321753
DesoxycholzuurSangon Biotech (Shanghai) Co.LtdG818BA0029
DH5α competente cellenGemaakt in het huidige experimentE.coli DH5α
β-D-maltosideBeijing Scolario Science and Tech Co.LtdS818
EDTASangon Biotech (Shanghai) Co.LtdE104BA0029
GlycineSangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd161BA0031
HEPESBeijing solaribo science and technology Co.LtdH8090
LiClSangon Biotech (Shanghai) Co.LtdH209BA0003
MESBeijing solaribo science and technology Co.LtdM8019
MiraClothEMD Milipore Corp/MERCK kgAa Darmstadt, Germenay3429963Snel filter materiaal filter
MgCl2Beijing solaribo science and technology Co.Ltd20200819
NaClSangon Biotech (Shanghai) Co.LtdH324BA0003
NP40Sangon Biotech (Shanghai) Co.LtdN8030
Eiwitinhibitor cocktailBeijing Scolario Science and Tech Co.LtdS3450
PVDFBIO-RAD5820172
SDSBeijing Scolario Science and Tech Co.LtdS1015
SilwetSangon Biotech (Shanghai) Co.LtdS9430
Streptavidine-C1-geconjugeerde magnetische kralenEnriching Biotechnology7E511E1Magnetische kralen
TEMEDServicebioG2056
Triton X-100Sangon Biotech (Shanghai) Co.LtdGB03BA007
Tris-HClSangon Biotech (Shanghai) Co.LtdF828BA0020
TryptonThermo scientificLP0042

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Han, J., et al. The identification of novel protein-protein interactions in liver that affect glucagon receptor activity. PloS One. 10 (6), 0129226(2015).
  2. Zhao, S., et al. Screening and identification of host proteins interacting with Theileria annulata cysteine proteinase (TaCP) by yeast-two-hybrid system. Parasites & Vectors. 10 (1), 536(2017).
  3. Zhang, Y., et al. A highly efficient agrobacterium-mediated method for transient gene expression and functional studies in multiple plant species. Plant Communications. 1 (5), 100028(2020).
  4. Zhang, Y., et al. TurboID-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks. Journal of Visualized Experiments. (159), e60728(2020).
  5. Kido, K., et al. AirID, a novel proximity biotinylation enzyme, for analysis of protein-protein interactions. eLife. 9, 54983(2020).
  6. Hu, X., et al. Overexpressing 7-hydroxymethyl chlorophyll a reductase alleviates non-programmed cell death during dark-induced senescence in intact Arabidopsis plants. Biomolecules. 11 (8), 1143(2021).
  7. Ammiraju, J., et al. The Oryza bacterial artificial chromosome library resource: construction and analysis of 12 deep-coverage large-insert BAC libraries that represent the 10 genome types of the genus Oryza. Genome Research. 16 (1), 140-147 (2006).
  8. Liu, C., et al. Albino Leaf 2 is involved in the splicing of chloroplast group I and II introns in rice. Journal of Experimental Botany. 67 (18), 5339-5347 (2016).
  9. Branon, T. C., et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID. Nature Biotechnology. 36 (9), 880-887 (2018).
  10. Nakano, S., Niwa, M., Asano, Y., Ito, S. Following the evolutionary track of a highly specific l-Arginine oxidase by reconstruction and biochemical analysis of ancestral and native enzymes. Applied and Environmental Microbiology. 85 (12), 00459(2019).
  11. Gingras, A. -C., Abe, K. T., Raught, B. Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles. Current Opinion in Chemical Biology. 48, 44-54 (2019).
  12. Odeh, H. M., Coyaud, E., Raught, B., Matunis, M. J. The SUMO-specific isopeptidase SENP2 is targeted to intracellular membranes via a predicted N-terminal amphipathic α-helix. Molecular Biology of the Cell. 29 (15), 1878-1890 (2018).
  13. Motani, K., Kosako, H. Activation of stimulator of interferon genes (STING) induces ADAM17-mediated shedding of the immune semaphorin SEMA4D. Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7717-7726 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

AirID nabijheidslabelinglabeling van planteneiwittenverrijking van gebiotineerde eiwittenstreptavidine magnetische kralenagro infiltratietechniekWestern blot analyseLC MS MS analyseaffiniteitszuiveringextractie van komkommereiwitten

Gerelateerde artikelen