Een efficiënt clearingprotocol voor de studie van zaadontwikkeling in tomaat (Solanum lycopersicum L.)

Summary

Het tomatenzaad is een belangrijk model voor het bestuderen van genetica en ontwikkelingsbiologie tijdens de voortplanting van planten. Dit protocol is nuttig voor het opruimen van tomatenzaden in verschillende ontwikkelingsstadia om de fijnere embryonale structuur te observeren.

Abstract

Tomaat (Solanum lycopersicum L.) is een van de belangrijkste cash crops wereldwijd. Het tomatenzaad is een belangrijk model voor het bestuderen van genetica en ontwikkelingsbiologie tijdens de voortplanting van planten. Visualisatie van de fijnere embryonale structuur in een tomatenzaad wordt vaak belemmerd door zaadlaagslijm, meercellige gelaagde omhulling en een dikwandig endosperm, dat moet worden opgelost door moeizame inbeddingssectie. Een eenvoudiger alternatief is om weefselzuiveringstechnieken te gebruiken die het zaad bijna transparant maken met behulp van chemische middelen. Hoewel conventionele opruimprocedures diep inzicht bieden in kleinere zaden met een dunnere zaadlaag, blijft het opruimen van tomatenzaden technisch uitdagend, vooral in de late ontwikkelingsstadia.

Hier wordt een snel en arbeidsbesparend clearingprotocol gepresenteerd om de ontwikkeling van tomatenzaad te observeren van 3 tot 23 dagen na de bloei wanneer de embryonale morfologie bijna voltooid is. Deze methode combineert op chloraalhydraat gebaseerde clearingoplossing die veel wordt gebruikt in Arabidopsis met andere modificaties, waaronder het weglaten van Formaline-Aceto-Alcohol (FAA) fixatie, de toevoeging van natriumhypochlorietbehandeling van zaden, verwijdering van het verzachte zaadlaagslijm en wassen en vacuümbehandeling. Deze methode kan worden toegepast voor het efficiënt opruimen van tomatenzaden in verschillende ontwikkelingsstadia en is nuttig bij volledige monitoring van het ontwikkelingsproces van mutante zaden met een goede ruimtelijke resolutie. Dit clearingprotocol kan ook worden toegepast op diepe beeldvorming van andere commercieel belangrijke soorten in de Solanaceae.

Introduction

Tomaat (S. lycopersicum L.) is een van de belangrijkste groentegewassen ter wereld, met een output van 186,8 miljoen ton vlezig fruit van 5,1 miljoen hectare in 2020¹. Het behoort tot de grote Solanaceae-familie met ongeveer 2.716 soorten², waaronder veel commercieel belangrijke gewassen zoals aubergine, paprika's, aardappelen en tabak. De gekweekte tomaat is een diploïde soort (2n = 2x = 24) met een genoomgrootte van ongeveer 900 Mb³. Lange tijd is er veel moeite gedaan voor het domesticeren en veredelen van tomaten door het selecteren van gewenste eigenschappen uit wilde Solanum

Protocol

1. Bereiding van oplossingen

1. Bereid FAA-fixatief voor door 2,5 ml 37% formaldehyde, 2,5 ml ijsazijn en 45 ml 70% ethanol toe te voegen in een centrifugebuis van 50 ml. Vortex en bewaar het bij 4 °C. Bereid FAA-fixatief vers voor gebruik.
   LET OP: 37% formaldehyde is corrosief en mogelijk kankerverwekkend bij blootstelling of inademing. Het fixatief moet worden uitgevoerd in een zuurkast met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen.
2. Bereid de opruimoplossing door 5 ml 100% glycerol, 40 g chloraalhydraat en 10 ml gedestilleerd water toe te voegen in een glazen fles van 100 ml omwikkeld met tinfolie. Los op met een magneetroerde....

Results

Toen tomatenzaden werden geklaard met behulp van een conventionele methode zoals in Arabidopsis, blokkeerden dichte endospermcellen de visualisatie van vroege tomatenembryo's bij 3 DAF en 6 DAF (figuur 3A, B). Naarmate het totale volume van het embryo toenam, was een bolvormig embryo nauwelijks te onderscheiden bij 9 DAF (figuur 3C). Naarmate de zaadgrootte echter bleef toenemen, nam de permeabiliteit af, wat resulteerde in een wazig ha.......

Discussion

In vergelijking met mechanische secties is de clearingtechnologie voordeliger voor driedimensionale beeldvorming omdat deze de integriteit van plantenweefsels of organen behoudt¹⁶. Conventionele clearingprotocollen zijn vaak beperkt tot kleine monsters vanwege de gemakkelijkere penetratie van chemische oplossingen. Tomatenzaad is een problematisch monster voor weefselzuivering omdat het ongeveer 70 keer groter is dan een Arabidopsis-zaad in grootte en meer permeabiliteitsbarrières heeft. .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,000 µL pipette	GILSON	FA10006M
1,000 µL pipette tips	Corning	T-1000-B
2 ml centrifuge tube	Axygen	MCT-200-C
37% formaldehyde	DAMAO	685-2013
5,000 µL pipette	Eppendorf	3120000275
5,000 µL pipette tips	biosharp	BS-5000-TL
50 ml centrifuge tube	Corning	430829
Absolute Ethanol	BOYUAN	678-2002
Bottle glass	Fisher	FB800-100
Chloral Hydrate	Meryer	M13315-100G
Coverslip	Leica	384200
DIC microscope	Zeiss	Axio Imager A1	10x, 20x and 40x magnification
Disinfectant	QIKELONGAN	17-9185
Dissecting needle	Bioroyee	17-9140
Flower nutrient soil	FANGJIE
Forceps	HAIOU	4-94
Glacial Acetic Acid	BOYUAN	676-2007
Glycerol	Solarbio	G8190
Magnetic stirrer	IKA	RET basic
Micro-Tom	Tomato Genetics Resource Center	LA3911
Orbital shaker	QILINBEIER	QB-206
Seeding substrate	PINDSTRUP	LV713/018-LV252	Screening:0-10 mm
Single concave slide	HUABODEYI	HBDY1895
Slide	Leica	3800381
Stereomicroscope	Leica	S8 APO	1x to 4x magnification
Tin foil	ZAOWUFANG	613
Tween 20	Sigma	P1379
Vacuum pump	SHIDING	SHB-III
Vortex meter	Silogex	MX-S