We rapporteren een stage-top, flexibele omgevingskamer voor time-lapse beeldvorming van levende cellen met behulp van rechtop gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie met verzonden signaaldetectie. Lipidedruppeltjes werden afgebeeld in SKOV3-cellen behandeld met oliezuur gedurende maximaal 24 uur met een tijdsinterval van 3 minuten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een flexibele kamer voor time-lapse live-cell imaging met gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Stimulated Raman scattering (SRS) microscopie is een labelvrije chemische beeldvormingstechnologie. Live-cell beeldvorming met SRS is aangetoond voor vele biologische en biomedische toepassingen. Langdurige time-lapse SRS-beeldvorming van levende cellen is echter niet op grote schaal toegepast. SRS-microscopie maakt vaak gebruik van een waterdompelobjectief met hoog numeriek diafragma (NA) en een hoge NA-oliedompelcondensor om beeldvorming met hoge resolutie te bereiken. In dit geval is de opening tussen het objectief en de condensor slechts enkele millimeters. Daarom kunnen de meeste commerciële podiumomgevingskamers niet worden gebruikt voor SRS-beeldvorming vanwege hun grote dikte met een stijve glazen afdekking. Dit artikel beschrijft het ontwerp en de fabricage van een flexibele kamer die kan worden gebruikt voor time-lapse live-cell imaging met verzonden SRS-signaaldetectie op een rechtopstaand microscoopframe. De flexibiliteit van de kamer wordt bereikt door een zacht materiaal te gebruiken - een dunne natuurlijke rubberen film. De nieuwe behuizing en het ontwerp van de kamer kunnen eenvoudig worden toegevoegd aan een bestaande SRS-beeldvormingsopstelling. De tests en voorlopige resultaten tonen aan dat het flexibele kamersysteem stabiele, langdurige, time-lapse SRS-beeldvorming van levende cellen mogelijk maakt, die in de toekomst voor verschillende bioimaging-toepassingen kan worden gebruikt.
Inleiding
Optische microscopie wordt gebruikt om de microstructuren van monsters te observeren. Optische beeldvorming is snel, minder invasief en minder destructief dan andere technologieën1. Live-cell imaging met optische microscopie is ontwikkeld om de dynamiek van gekweekte levende cellen over een lange periode vast te leggen2. Verschillende soorten optische contrasten bieden verschillende informatie over biologische monsters. Optische fasemicroscopie toont bijvoorbeeld het subtiele verschil in de brekingsindices in het monster3. Fluorescentiemicroscopie wordt veel gebruikt om specifieke biomoleculen of ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Bouw de microscoop omgevingsbehuizing
OPMERKING: Deze omgevingsbehuizing met grote microscoop wordt gebruikt om de temperatuur van het microscooplichaam en de beeldomgeving te stabiliseren op 37 °C te regelen (figuur 1A).
- Markeer de locaties van de voeten van het SRS-microscoopframe en het gemotoriseerde podium met behulp van een markeerpen op de optische tafel. Monteer twee irismembranen voor de galvanometerscanner van de microscoop en pas deze aan om de pomp en Stokes-laserstralen door het midden van de irismembranen te laten gaan.
- Verwijder het microscoopframe en het podium uit de opti....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
We fabriceerden en assembleerden het flexibele kamersysteem voor time-lapse SRS-beeldvorming (figuur 1 en figuur 2) en evalueerden vervolgens de prestaties van het systeem. De temperatuur in de omgevingsruimte van de microscoop bereikte binnen 1 uur de verwachte 37 °C, wat de kamertemperatuur niet significant beïnvloedde (figuur 3A). De temperatuur in de flexibele kamer bereikte 37 °C in 1,5 uur en werd gedurende ten minste 24 uur s.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Time-lapse live-cell SRS-microscopie is een alternatieve beeldvormingstechniek voor het volgen van moleculen op een labelvrije manier. In vergelijking met fluorescentie-etikettering is SRS-beeldvorming vrij van fotobleken, waardoor moleculen op lange termijn kunnen worden gemonitord. Tot op heden is het live cell imaging-systeem op een rechtopstaande SRS-microscopie echter niet in de handel verkrijgbaar. In dit werk werd een live cell imaging-systeem met een stabiele thermisch geïsoleerde microscoopbehuizingsdoos en een .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.
Dankbetuigingen
We willen het 2019 Undergraduate Senior Design Team (Suk Chul Yoon, Ian Foxton, Louis Mazza en James Walsh) aan de Binghamton University bedanken voor het ontwerp, de fabricage en het testen van de microscoopbehuizingsdoos. We bedanken Scott Hancock, Olga Petrova en Fabiola Moreno Olivas van Binghamton University voor nuttige discussies. Dit onderzoek werd ondersteund door de National Institutes of Health onder awardnummer R15GM140444.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Een lab-gebouwde SRS microscoop | https://rdcu.be/cP6ve | ||
| HF2LI 50 MHz lock-in versterker | Zurich Instruments | HF2LI | |
| Iris diafragma | Thorlabs Inc | SM1D12 | |
| Kinematische spiegelmontage | Thorlabs Inc | KM100 | |
| Microscoopframe | Nikon Inc | FN-1 | |
| Gemotoriseerde microscoopstandaard | Prior Scientific | Z-Deck | |
| Olie-immersie condensor (C-AA Achromat/Aplanat, NA 1.4) | Nikon Inc | MBL71405 | |
| Water-immersie objectief (CFI75 Apo 25XC W 1300) | Nikon Inc | MRD77225 | |
| Materialen en onderdelen voor de microscoopbehuizing (31' x 29' x 28' L x B x H) | |||
| Airtherm verwarmingsmodule | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SAT-1W | |
| Airtherm verwarmingscontroller, CO2 en luchtvochtigheidsmonitor | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SMT-1W | |
| Lucht/CO2 mengmodule | World Precision Instruments (WPI) | ECU-HOC-W | |
| Flexibele luchtleidingsslang (2-1/2' ID, 2-3/4' OD) | McMaster-Carr | 56675K71 | |
| Hoge temperatuur glas-mica keramiek, makkelijk te bewerken (6' x 6', 1/4' dikte) | McMaster-Carr | 8489K62 | |
| Polycarbonaat platen (dikte 0,25') | McMaster-Carr | 8574K286 | |
| Siliconenrubber platen (36' x 36', dikte 1/8') | McMaster-Carr | 5827T43 | |
| Materialen en onderdelen voor de Flexibele kamer | |||
| Heet plaat | McMaster-Carr | 31745K11 | |
| Hoge-zuiverheid inline filter, 1/4 NPT | McMaster-Carr | 6645T18 | |
| Boorzaag (snijdiameter 1-7/8 inch) | McMaster-Carr | 4066A34 | |
| Boorzaag (snijdiameter 50 mm) | McMaster-Carr | 4556A19 | |
| Hoge temperatuur siliconenrubber slang, zacht, 2 mm ID, 5 mm OD | McMaster-Carr | 5054K313 | |
| Inline filter (1/4 NPT, 40 micron) | McMaster-Carr | 98385K843 | |
| Multifunctionele 6061 Aluminium ronde buis (1/8' wanddikte, 4' OD) | McMaster-Carr | 9056K42 | |
| Multifunctionele 6061 Aluminium ronde buis (3/4' wanddikte, 3-3/4' OD) | McMaster-Carr | 9056K47 | |
| Multifunctionele 6061 Aluminium staaf (12' x 12', dikte 1/4') | McMaster-Carr | 8975K142 | |
| Multifunctionele 6061 Aluminium staaf (8' x 8', dikte 3/8') | McMaster-Carr | 9246K21 | |
| Objectief neusstuk (enkel) | Nikon Inc | FN-MN-H | |
| Monsterhouder (gemodificeerd) | Prior Scientific | HZ202 | |
| Ultradunne natuurlijke rubberfilm (dikte 0,01') | McMaster-Carr | 8611K13 | |
| Vacuüm-afdichtbare glazen pot | McMaster-Carr | 3231T44 | |
| Software | |||
| MATLAB | MathWorks | ||
| ImageJ (Fiji) | imagej.net | ||
| ScanImage | Vidrio Technologies, LLC | SRS beeldvormingssoftware | |
| Materialen voor live-celbeeldvorming | |||
| Sterile kweekschalen met glasbodem (Dia.x H, 50 x 7 mm) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70674-02 | |
| DMEM celkweekmedium | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| Foetaal bovien serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| LysoSensor fluorescerende kleurstof DND-189 | ThermoFisher Scientific | L7535 (Invitrogen) | |
| Oleïnezuur | MilliporeSigma | 364525 | |
| SKOV3 cellijn | ATCC | HTB-77 |
Referenties
- Mertz, J. Introduction to Optical Microscopy. , Cambridge University Press. (2019).
- Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
- Park, Y., Depeursinge, C., Popescu, G.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
