Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een flexibele kamer voor time-lapse live-cell imaging met gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie

1.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64449

⸱

31 augustus 2022

 , 
1Department of Biomedical Engineering, Binghamton University, State University of New York

In dit artikel

Samenvatting

We rapporteren een stage-top, flexibele omgevingskamer voor time-lapse beeldvorming van levende cellen met behulp van rechtop gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie met verzonden signaaldetectie. Lipidedruppeltjes werden afgebeeld in SKOV3-cellen behandeld met oliezuur gedurende maximaal 24 uur met een tijdsinterval van 3 minuten.

Samenvatting

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopie is een labelvrije chemische beeldvormingstechnologie. Live-cell beeldvorming met SRS is aangetoond voor vele biologische en biomedische toepassingen. Langdurige time-lapse SRS-beeldvorming van levende cellen is echter niet op grote schaal toegepast. SRS-microscopie maakt vaak gebruik van een waterdompelobjectief met hoog numeriek diafragma (NA) en een hoge NA-oliedompelcondensor om beeldvorming met hoge resolutie te bereiken. In dit geval is de opening tussen het objectief en de condensor slechts enkele millimeters. Daarom kunnen de meeste commerciële podiumomgevingskamers niet worden gebruikt voor SRS-beeldvorming vanwege hun grote dikte met een stijve glazen afdekking. Dit artikel beschrijft het ontwerp en de fabricage van een flexibele kamer die kan worden gebruikt voor time-lapse live-cell imaging met verzonden SRS-signaaldetectie op een rechtopstaand microscoopframe. De flexibiliteit van de kamer wordt bereikt door een zacht materiaal te gebruiken - een dunne natuurlijke rubberen film. De nieuwe behuizing en het ontwerp van de kamer kunnen eenvoudig worden toegevoegd aan een bestaande SRS-beeldvormingsopstelling. De tests en voorlopige resultaten tonen aan dat het flexibele kamersysteem stabiele, langdurige, time-lapse SRS-beeldvorming van levende cellen mogelijk maakt, die in de toekomst voor verschillende bioimaging-toepassingen kan worden gebruikt.

Inleiding

Optische microscopie wordt gebruikt om de microstructuren van monsters te observeren. Optische beeldvorming is snel, minder invasief en minder destructief dan andere technologieën1. Live-cell imaging met optische microscopie is ontwikkeld om de dynamiek van gekweekte levende cellen over een lange periode vast te leggen2. Verschillende soorten optische contrasten bieden verschillende informatie over biologische monsters. Optische fasemicroscopie toont bijvoorbeeld het subtiele verschil in de brekingsindices in het monster3. Fluorescentiemicroscopie wordt veel gebruikt om specifieke biomoleculen of cellulaire organellen in beeld te brengen. De breedbandexcitatie- en emissiespectra van fluorescentie resulteren echter meestal in spectrale overlapping wanneer meerkleurige beeldvorming wordt uitgevoerd4. Fluorescerende moleculen zijn lichtgevoelig en kunnen worden gebleekt na langdurige, periodieke blootstelling aan licht. Bovendien kan fluorescentielabeling de biodistributie van de moleculen in cellen5 veranderen. SRS-microscopie is een labelvrije chemische beeldvormingstechnologie6. Het contrast van SRS is gebaseerd op de trillingsovergang van specifieke chemische bindingen. De trillingsfrequentie van een chemische binding vertoont vaak een smalle spectrale bandbreedte, waardoor het mogelijk is om meerdere Raman-banden in dezelfde monsters af te beelden7. SRS-microscopie is een uniek hulpmiddel voor beeldvorming van levende cellen en biedt meerdere chemische contrasten op een labelvrije manier8.

Hoewel SRS-beeldvorming van niet-gekleurde cellen voor veel studies is gebruikt, is SRS-beeldvorming van levende cellen op lange termijn niet op grote schaal toegepast. Een reden is dat commerciële open kamers niet direct kunnen worden gebruikt voor SRS-beeldvorming vanwege hun grote dikte 9,10,11,12. Deze kamers met een glazen deksel zijn meestal ontworpen voor brightfield- of fluorescentiebeeldvorming met behulp van een enkel hoog NA-objectief met een achterwaarts detectieschema. SRS-beeldvorming geeft echter de voorkeur aan verzonden detectie met behulp van zowel een hoog NA-objectief als een hoge NA-condensor, waardoor er slechts een zeer korte opening (meestal enkele millimeters) tussen het objectief en de condensor overblijft. Om dit probleem op te lossen, hebben we een flexibele kamer ontworpen met behulp van een zacht materiaal om time-lapse SRS-beeldvorming van levende cellen mogelijk te maken met behulp van een rechtopstaand microscoopframe. In dit ontwerp is het waterdompelobjectief ingesloten in de zachte kamer en kan het vrij bewegen in drie dimensies voor scherpstel- en beeldvormingsdoeleinden.

De optimale temperatuur voor het kweken van de meeste zoogdiercellen is 37 °C, terwijl de kamertemperatuur altijd 10° lager is dan dit. Temperatuur hoger of lager dan 37 °C heeft een dramatisch effect op de celgroeisnelheid13. Daarom is temperatuurregeling van de celkweekomgeving vereist in een live-cell imaging-systeem. Het is bekend dat temperatuurinstabiliteit zal leiden tot onscherpe problemen tijdens langdurige beeldvorming14. Om een stabiele omgeving van 37 °C te bereiken, hebben we een grote behuizingskamer gebouwd om het hele microscoopframe te bedekken, inclusief een thermische isolatielaag onder de microscoop (figuur 1). In de omvangrijke temperatuurregelkamer helpt de kleine flexibele kamer om de fysiologische vochtigheid en pH nauwkeurig te handhaven via de gereguleerde luchtstroom aangevuld met 5% CO 2 (figuur 2). De temperatuur en vochtigheid van de kamers werden gemeten om te bevestigen dat het ontwerp met dubbele kamer de optimale celkweekconditie bood voor celgroei onder langdurige, periodieke SRS-beeldvorming (figuur 3). Vervolgens demonstreerden we de toepassing van het systeem voor time-lapse beeldvorming en het volgen van lipidedruppels (LDs) in SKOV3-kankercellen (figuur 4, figuur 5 en figuur 6).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Bouw de microscoop omgevingsbehuizing

OPMERKING: Deze omgevingsbehuizing met grote microscoop wordt gebruikt om de temperatuur van het microscooplichaam en de beeldomgeving te stabiliseren op 37 °C te regelen (figuur 1A).

  1. Markeer de locaties van de voeten van het SRS-microscoopframe en het gemotoriseerde podium met behulp van een markeerpen op de optische tafel. Monteer twee irismembranen voor de galvanometerscanner van de microscoop en pas deze aan om de pomp en Stokes-laserstralen door het midden van de irismembranen te laten gaan.
  2. Verwijder het microscoopframe en het podium uit de optische tafel.
  3. Leg de siliconen rubberen plaat (grootte: 31 x 29 inch, dikte: 1/8 inch) op de optische tafel (figuur 1B).
  4. Snijd het siliconenrubber langs de markeringen met een mes, verwijder kleine rubberen stukjes en plaats de vierkante MICA-keramische vellen (grootte: 6 x 6 inch, dikte: 1/4 inch) op dezelfde locaties.
    OPMERKING: MICA-keramiek is een gemakkelijk te bewerken materiaal15. Het is zo hard als aluminium, maar is een uitstekende thermische isolator. MICA keramische platen werden gebruikt om de warmteoverdracht van het metalen microscoopframe en het podium naar de roestvrijstalen optische tafel te stoppen. Een paar doorgaande gaten moeten op de MICA-platen worden geboord om het gebruik van 1/4-20 schroeven voor de montage van de voeten van het frame en het podium mogelijk te maken.
  5. Beweeg het microscoopframe en het podium terug naar de optische tafel en lijn de voeten voorzichtig uit op de MICA keramische vellen langs de markeringslijnen. Gebruik 1/4-20 schroeven om het frame en het podium op de tafel te monteren.
  6. Lijn het optische pad van SRS opnieuw uit. Pas de spiegelsteunen van spiegel 1 en spiegel 2 aan om de laserstraal door het midden van de twee voorgemonteerde irismembranen te laten gaan (figuur 2).
    OPMERKING: Technische details van de in het laboratorium gebouwde SRS-microscoop die wordt gebruikt voor het huidige live-cell imaging-werk zijn eerder beschreven16. De pulsbreedte van de pomp en Stokes-balken zijn ~ 3-4 ps met glazen staafdispersie. Het systeem wordt aangestuurd met de ScanImage17 software.
  7. Bovenop deze thermische isolatiefundering, monteer de omgevingsbehuizing om het hele microscoopframe te bedekken met behulp van vijf stukken grote polycarbonaatplaten (grootte: 31 x 29 x 28 inch, dikte: 0,25 inch).
    OPMERKING: De grootte van de behuizingsdoos wordt bepaald op basis van de afmetingen van het microscoopframe en het podium. Het voorpaneel van de microscoopbehuizingsdoos moet tijdelijk worden verwijderd om de flexibele kamer te installeren en de celkweekschaal te laden.
    1. Om de behuizing te monteren, voert u eenvoudig bewerkingswerk uit, waaronder snijden, boren en tappen van schroefgaten aan elke rand van de polycarbonaatplaten. Snijd twee grote gaten met een diameter van 2,6 inch aan de rechter- en linker vellen van de behuizing om respectievelijk in de inlaat- en uitlaatbuis te passen. Snijd een klein gaatje met een diameter van 5 mm op het achterblad om de laserstralen in de behuizing te laten komen.
  8. Sluit de randen en interfaces van de doos af met aluminiumfolietape.
  9. Sluit de flexibele kanaalslang aan op de inlaat en de uitlaatpoorten van de behuizingsdoos om een gecirculeerde warme luchtstroom te laten pompen en regelen door de verwarmingsmodule. Plaats de thermische sensor van de verwarmingsmodule in de flexibele kamer waar de cellen worden gekweekt en afgebeeld. Stel de beoogde temperatuur in op 37 °C.
    OPMERKING: Een diffuser kan worden gebruikt om een meer uniforme luchtstroomverdeling in de omgevingsbehuizing te krijgen.

2. Monteer de flexibele kamer

  1. Monteer het bewerkte holle cilindrische aluminium stuk 1 (materiaal: aluminium 6061) aan het neusstuk van het objectief met behulp van drie stelschroeven (figuur 2).
  2. Monteer het bewerkte holle cilindrische aluminium stuk 2 op de monsterhouder met behulp van vier 1/4-20 schroeven (figuur 2).
    OPMERKING: De monsterhouder moet zodanig worden aangepast dat de kweekschaal met glazen bodem van 50 mm wordt vastgehouden. Boor een doorgaand gat in het midden van de monsterhouder met behulp van een gatenzaag van 1-7/8 inch. Counterbore het gat met behulp van een gatenzaag van 50 mm en houd de diepte van het doorgaande gat ~ 1 mm.
  3. Monteer de monsterhouder met het aluminium stuk 2 op het gemotoriseerde podium en monteer deze met schroeven.
  4. Plaats de natuurrubberen filmhuls (dikte: 0,01 inch; gelijmd met cyanoacrylaatlijm) tussen de twee bewerkte aluminium stukken en monteer deze met behulp van elastiekjes aan elk uiteinde.
  5. Sluit de gecomprimeerde CO2-cilinder aan op de gasmengermodule met behulp van de juiste buizen en connectoren. Stel de CO 2-ingangsdruk in op 20-25 psi. Gebruik een ingebouwde CO 2-sensor en een controller om ervoor te zorgen dat de luchtmixermodule 5% CO2 in de luchtstroom kan regelen en mengen. Gebruik inline filters om de luchtstroom op te ruimen.
  6. Gebruik de juiste buizen en connectoren om de gemengde lucht (met 5% CO2) naar de voorgesteriliseerde waterfles op de hete plaat te leiden en vervolgens de bevochtigde lucht naar de flexibele kamer te leiden. Zet de kookplaat op 37 °C. Bel de luchtstroom in het warme water om de luchtvochtigheid van de luchtstroom te verhogen.

3. Voorbereiding op time-lapse live-cell SRS imaging experimenten

  1. Veeg alle delen van de flexibele kamer schoon met 70% ethanol, inclusief het neusstuk, het waterdompeldoel en de monsterhouder.
  2. Ontsmet het hele behuizingssysteem met behulp van een UV-lamp die gedurende 20 tot 30 minuten in de behuizing is geplaatst.
    OPMERKING: Blijf niet in de laboratoriumruimte tijdens het UV-desinfectieproces voor de veiligheid.
  3. Kweek SKOV3-cellen gedurende 12 uur onder normale fysiologische omstandigheden in een petrischaal met glazen bodem van 50 mm in een reguliere incubator.
    OPMERKING: Start de SKOV3 celkweek18 in een standaard bioveiligheidskast.
  4. Koppel het bewerkte aluminium stuk 2 los van de monsterhouder door de schroeven te verwijderen.
    OPMERKING: Dit is de manier om de flexibele kamer te openen om de celkweekschaal te laden.
  5. Laad de celkweekschaal. Vergeet niet om dompelolie op de bovenkant van de condensor toe te voegen voordat u de celkweekschaal plaatst. Verwijder de deksel van de schaal en immobiliseer de schaal met behulp van de klemmen.
    OPMERKING: Om besmetting te voorkomen, moeten alle bewerkingen met handschoenen worden uitgevoerd.
  6. Verlaag het objectief in de celkweekmedia voor grof scherpstellen. Laat het aluminium stuk 2 zakken om de flexibele kamer te omsluiten en monteer het met schroeven op de monsterhouder.
    OPMERKING: Een 2 mm siliconen rubberen kussenkussen is bevestigd aan de onderkant van het aluminium stuk 2 om de opening goed af te dichten.
  7. Stel de luchttoevoer in met 5% CO 2 en 19% O2 voor normale celcultuur met een luchtdebiet van 200 cc/min.
    OPMERKING: Er kan een lager luchtdebiet worden gebruikt. Het hangt af van hoe goed de flexibele kamer is afgedicht.

4. Voer time-lapse live-cell SRS-beeldvormingsexperimenten uit

  1. Stem de lasergolflengte af op 805 nm om de 2854 cm-1 Raman-verschuiving te richten, die wordt toegeschreven aan de trilling van CH2 chemische bindingen. Gebruik een laag laservermogen om fotoschade aan de cellen te verminderen. Om dit protocol te volgen, gebruikt u ~ 15 mW gemiddeld vermogen van de pomplaser en ~ 7,5 mW van de Stokes-laser (gefixeerd op 1.045 nm) voor langdurige live-cell beeldvorming.
    OPMERKING: Een hoger laservermogen levert een betere SRS-beeldkwaliteit op. Een te hoog laservermogen zal echter fotoschade aan levende cellen veroorzaken. Er is een afweging tussen beeldkwaliteit en fotoschade.
  2. Pas het doel aan en focus het om een goede SRS-beeldvorming van de cellen te bereiken met behulp van de FOCUS-knop op het hoofdbedieningspaneel van de software. Als u snel wilt scherpstellen, stelt u het pixelnummer in op 512 × 512 pixels met een pixelverblijftijd van 4,8 μs in het deelvenster CONFIGURATIE .
  3. Stel het ingangsbereik van de lock-in versterker (meestal 5 mV) in op tweemaal de maximale signaalspanning. Stel het laagdoorlaatfilter in op hetzelfde als de verblijftijd van de pixel (4,8 μs).
    OPMERKING: Verschillende in het lab gebouwde SRS-systemen kunnen verschillende instellingen voor gegevensverzameling gebruiken.
  4. Na het bereiken van een goede scherpstelling, stelt u de beeldresolutie in op 2.048 × 2.048 pixels voor een gezichtsveld van 175 μm2 voor het verkrijgen van beelden van hoge kwaliteit. Controleer de functie OPSLAAN op het paneel HOOFDBEDIENING en controleer het SRS-kanaal op het deelvenster KANALEN . Stel de intervaltijd tussen twee frames in op 180 s (3 min) op het MAIN CONTROLS-kanaal. Stel het acquisitienummer in op 480 voor time-lapse-beeldvorming gedurende 24 uur.
    OPMERKING: Een lagere beeldresolutie kan worden gebruikt op basis van het doel van de experimenten.
  5. Start geautomatiseerde beeldacquisitie met behulp van de LOOP-functie op het MAIN CONTROLS-paneel .
    OPMERKING: Controleer of er sprake is van focale drift als gevolg van temperatuurinstabiliteit in het eerste uur van de beeldvorming. De beeldvorming van het eerste uur is mogelijk niet stabiel. Controleer de scherpstelling elke 2-3 uur tijdens de time-lapse beeldvormingssessie.
  6. Verwerk de verzamelde afbeeldingen met ImageJ19. Gebruik de volgende twee methoden voor LD-kwantificering: (i) de LD/cellichaamsoppervlakteverhouding en (ii) de gemiddelde SRS-intensiteit van totale LD's. Meet het cellichaamgebied door de niet-cellulaire pixels in de SRS-afbeeldingen te drempelen en op nul te zetten bij 2.854 cm-1. Meet het LD-gebied en de intensiteit door de niet-LD-pixels in de SRS-afbeeldingen te drempelen en op nul te zetten.
    OPMERKING: Meer details over SRS-beeldverwerking zijn eerder gemeld16.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

We fabriceerden en assembleerden het flexibele kamersysteem voor time-lapse SRS-beeldvorming (figuur 1 en figuur 2) en evalueerden vervolgens de prestaties van het systeem. De temperatuur in de omgevingsruimte van de microscoop bereikte binnen 1 uur de verwachte 37 °C, wat de kamertemperatuur niet significant beïnvloedde (figuur 3A). De temperatuur in de flexibele kamer bereikte 37 °C in 1,5 uur en werd gedurende ten minste 24 uur s...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Time-lapse live-cell SRS-microscopie is een alternatieve beeldvormingstechniek voor het volgen van moleculen op een labelvrije manier. In vergelijking met fluorescentie-etikettering is SRS-beeldvorming vrij van fotobleken, waardoor moleculen op lange termijn kunnen worden gemonitord. Tot op heden is het live cell imaging-systeem op een rechtopstaande SRS-microscopie echter niet in de handel verkrijgbaar. In dit werk werd een live cell imaging-systeem met een stabiele thermisch geïsoleerde microscoopbehuizingsdoos en een ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Dankbetuigingen

We willen het 2019 Undergraduate Senior Design Team (Suk Chul Yoon, Ian Foxton, Louis Mazza en James Walsh) aan de Binghamton University bedanken voor het ontwerp, de fabricage en het testen van de microscoopbehuizingsdoos. We bedanken Scott Hancock, Olga Petrova en Fabiola Moreno Olivas van Binghamton University voor nuttige discussies. Dit onderzoek werd ondersteund door de National Institutes of Health onder awardnummer R15GM140444.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Een lab-gebouwde SRS microscoophttps://rdcu.be/cP6ve
HF2LI 50 MHz lock-in versterkerZurich InstrumentsHF2LI
Iris diafragmaThorlabs IncSM1D12
Kinematische spiegelmontageThorlabs IncKM100
MicroscoopframeNikon IncFN-1
Gemotoriseerde microscoopstandaardPrior ScientificZ-Deck
Olie-immersie condensor (C-AA Achromat/Aplanat, NA 1.4)Nikon IncMBL71405
Water-immersie objectief (CFI75 Apo 25XC W 1300)Nikon IncMRD77225
Materialen en onderdelen voor de microscoopbehuizing (31' x 29' x 28' L x B x H)
Airtherm verwarmingsmoduleWorld Precision Instruments (WPI)AIRTHERM-SAT-1W
Airtherm verwarmingscontroller, CO2 en luchtvochtigheidsmonitorWorld Precision Instruments (WPI)AIRTHERM-SMT-1W
Lucht/CO2 mengmoduleWorld Precision Instruments (WPI)ECU-HOC-W
Flexibele luchtleidingsslang (2-1/2' ID, 2-3/4' OD)McMaster-Carr56675K71
Hoge temperatuur glas-mica keramiek, makkelijk te bewerken (6' x 6', 1/4' dikte)McMaster-Carr8489K62
Polycarbonaat platen (dikte 0,25')McMaster-Carr8574K286
Siliconenrubber platen (36' x 36', dikte 1/8')McMaster-Carr5827T43
Materialen en onderdelen voor de Flexibele kamer
Heet plaatMcMaster-Carr31745K11
Hoge-zuiverheid inline filter, 1/4 NPTMcMaster-Carr6645T18
Boorzaag (snijdiameter 1-7/8 inch)McMaster-Carr4066A34
Boorzaag (snijdiameter 50 mm)McMaster-Carr4556A19
Hoge temperatuur siliconenrubber slang, zacht, 2 mm ID, 5 mm ODMcMaster-Carr5054K313
Inline filter (1/4 NPT, 40 micron)McMaster-Carr98385K843
Multifunctionele 6061 Aluminium ronde buis (1/8' wanddikte, 4' OD)McMaster-Carr9056K42
Multifunctionele 6061 Aluminium ronde buis (3/4' wanddikte, 3-3/4' OD)McMaster-Carr9056K47
Multifunctionele 6061 Aluminium staaf (12' x 12', dikte 1/4')McMaster-Carr8975K142
Multifunctionele 6061 Aluminium staaf (8' x 8', dikte 3/8')McMaster-Carr9246K21
Objectief neusstuk (enkel)Nikon IncFN-MN-H
Monsterhouder (gemodificeerd)Prior ScientificHZ202
Ultradunne natuurlijke rubberfilm (dikte 0,01')McMaster-Carr8611K13
Vacuüm-afdichtbare glazen potMcMaster-Carr3231T44
Software
MATLABMathWorks
ImageJ (Fiji)imagej.net
ScanImageVidrio Technologies, LLCSRS beeldvormingssoftware
Materialen voor live-celbeeldvorming
Sterile kweekschalen met glasbodem (Dia.x H, 50 x 7 mm)Electron Microscopy Sciences (EMS)70674-02
DMEM celkweekmediumThermoFisher Scientific11965092
Foetaal bovien serum (FBS)ThermoFisher Scientific26140079
LysoSensor fluorescerende kleurstof DND-189ThermoFisher ScientificL7535 (Invitrogen)
OleïnezuurMilliporeSigma364525
SKOV3 cellijnATCCHTB-77

Referenties

  1. Mertz, J. Introduction to Optical Microscopy. , Cambridge University Press. (2019).
  2. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  3. Park, Y., Depeursinge, C., Popescu, G. Quantitative phase imaging in biomedicine. Nature Photonics. 12 (10), 578-589 (2018).
  4. Hu, C. D., Kerppola, T. K. Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis. Nature Biotechnology. 21 (5), 539-545 (2003).
  5. lamo, P., et al. Fluorescent dye labeling changes the biodistribution of tumor-targeted nanoparticles. Pharmaceutics. 12 (11), 1004(2020).
  6. Cheng, J. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), aaa870(2015).
  7. Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).
  8. Hill, A. H., Fu, D. Cellular imaging using stimulated Raman scattering microscopy. Analytical Chemistry. 91 (15), 9333-9342 (2019).
  9. Buđa, R., Vukušić, K., Tolić, I. Methods in Cell Biology. (139), Elsevier. 81-101 (2017).
  10. Chiarelli, T. J., Grieshaber, N. A., Grieshaber, S. S. Live-cell forward genetic approach to identify and isolate developmental mutants in Chlamydia trachomatis. Journal of Visualized Experiments. (160), e61365(2020).
  11. Lemon, W. C., McDole, K. Live-cell imaging in the era of too many microscopes. Current Opinion in Cell Biology. 66, 34-42 (2020).
  12. Birk, S. E., et al. Management of oral biofilms by nisin delivery in adhesive microdevices. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 167, 83-88 (2021).
  13. Watanabe, I., Okada, S. Effects of temperature on growth rate of cultured mammalian cells (L5178Y). Journal of Cell Biology. 32 (2), 309-323 (1967).
  14. Lac, A., Lam, A. L., Heit, B. Fluorescent Microscopy. , Springer. 57-73 (2022).
  15. Grossman, D. G. Machinable glass-ceramics based on tetrasilicic mica. Journal of the American Ceramic Society. 55 (9), 446-449 (1972).
  16. Yuan, Y., Shah, N., Almohaisin, M. I., Saha, S., Lu, F. Assessing fatty acid-induced lipotoxicity and its therapeutic potential in glioblastoma using stimulated Raman microscopy. Scientific Reports. 11 (1), 1-14 (2021).
  17. Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomedical Engineering Online. 2 (1), 1-9 (2003).
  18. Sun, M. W., Yuan, Y. H., Lu, F. K., Di Pasqua, A. J. Physicochemical factors that influence the biocompatibility of cationic liposomes and their ability to deliver DNA to the nuclei of ovarian cancer SK-OV-3 cells. Materials. 14 (2), 416(2021).
  19. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  20. Ozeki, Y., Itoh, K. Stimulated Raman scattering microscopy for live-cell imaging with high contrast and high sensitivity. Laser Physics. 20 (5), 1114-1118 (2010).
  21. Zhang, X., et al. Label-free live-cell imaging of nucleic acids using stimulated Raman scattering microscopy. ChemPhysChem. 13 (4), 1054-1059 (2012).
  22. Stiebing, C., et al. Real-time Raman and SRS imaging of living human macrophages reveals cell-to-cell heterogeneity and dynamics of lipid uptake. Journal of Biophotonics. 10 (9), 1217-1226 (2017).
  23. Miao, K., Wei, L. Live-cell imaging and quantification of PolyQ aggregates by stimulated Raman scattering of selective deuterium labeling. ACS Central Science. 6 (4), 478-486 (2020).
  24. Brzozowski, K., et al. Stimulated Raman scattering microscopy in chemistry and life science -Development, innovation, perspectives. Biotechnology Advances. 60, 108003(2022).
  25. Hislop, E. W., Tipping, W. J., Faulds, K., Graham, D. Label-free imaging of lipid droplets in prostate cells using stimulated Raman scattering microscopy and multivariate analysis. Analytical Chemistry. 94 (25), 8899-8908 (2022).
  26. Chen, T., Yavuz, A., Wang, M. C. Dissecting lipid droplet biology with coherent Raman scattering microscopy. Journal of Cell Science. 135 (5), jcs252353(2022).
  27. Cao, C., Zhou, D., Chen, T., Streets, A. M., Huang, Y. Label-Free digital quantification of lipid droplets in single cells by stimulated Raman microscopy on a microfluidic platform. Analytical Chemistry. 88 (9), 4931-4939 (2016).
  28. Zhang, C., et al. Stimulated Raman scattering flow cytometry for label-free single-particle analysis. Optica. 4 (1), 103-109 (2017).
  29. Suzuki, Y., et al. Label-free chemical imaging flow cytometry by high-speed multicolor stimulated Raman scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (32), 15842-15848 (2019).
  30. Gala de Pablo, J., Lindley, M., Hiramatsu, K., Goda, K. High-throughput Raman flow cytometry and beyond. Accounts of Chemical Research. 54 (9), 2132-2143 (2021).
  31. Cole, R. Live-cell imaging: the cell's perspective. Cell Adhesion & Migration. 8 (5), 452-459 (2014).
  32. Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging. Annals of the New York Academy of Sciences. 1048 (1), 321-330 (2005).
  33. Firestone, L., Cook, K., Culp, K., Talsania, N., Preston Jr, K. Comparison of autofocus methods for automated microscopy. Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 12 (3), 195-206 (1991).
  34. Van Helvert, S., Storm, C., Friedl, P. Mechanoreciprocity in cell migration. Nature Cell Biology. 20 (1), 8-20 (2018).
  35. Zong, C., et al. Plasmon-enhanced stimulated Raman scattering microscopy with single-molecule detection sensitivity. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
  36. Wei, L., et al. Super-multiplex vibrational imaging. Nature. 544 (7651), 465-470 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

SRS microscopietime lapse beeldvormingomgevingskamerhoge numerieke apertuurbeeldvorming van lipidedruppelstweefotonfluorescentiecelkweek
Een flexibele kamer voor time-lapse live-cell imaging met gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.