Een schaalbare, op cellen gebaseerde methode voor de functionele beoordeling van Ube3a-varianten

Summary

Een eenvoudige en schaalbare methode werd ontwikkeld om de functionele betekenis van missense-varianten in Ube3a te beoordelen, een gen waarvan het verlies en de winst van functie verband houden met zowel het Angelman-syndroom als de autismespectrumstoornis.

Abstract

Het toegenomen gebruik van sequencing in de geneeskunde heeft miljoenen coderende varianten in het menselijk genoom geïdentificeerd. Veel van deze varianten komen voor in genen die geassocieerd zijn met neurologische ontwikkelingsstoornissen, maar de functionele betekenis van de overgrote meerderheid van de varianten blijft onbekend. Het huidige protocol beschrijft de studie van varianten voor Ube3a, een gen dat codeert voor een E3 ubiquitine ligase gekoppeld aan zowel autisme als angelmansyndroom. Duplicatie of drievoud van Ube3a is sterk gekoppeld aan autisme, terwijl de deletie ervan het Angelman-syndroom veroorzaakt. Het begrijpen van de valentie van veranderingen in UBE3A-eiwitactiviteit is dus belangrijk voor klinische resultaten. Hier wordt een snelle, op cellen gebaseerde methode beschreven die Ube3a-varianten koppelt aan een Wnt-padverslaggever. Deze eenvoudige test is schaalbaar en kan worden gebruikt om de valentie en omvang van activiteitsveranderingen in elke Ube3a-variant te bepalen. Bovendien maakt de faciliteit van deze methode het mogelijk om een schat aan structuurfunctie-informatie te genereren, die kan worden gebruikt om diepgaande inzichten te krijgen in de enzymatische mechanismen van UBE3A.

Introduction

Recente technologische ontwikkelingen hebben de sequencing van exomen en genomen routine gemaakt in klinische omgevingen ^1,2. Dit heeft geleid tot de ontdekking van een groot aantal genetische varianten, waaronder miljoenen missense-varianten die meestal één aminozuur in een eiwit veranderen. Het begrijpen van de functionele betekenis van deze varianten blijft een uitdaging, en slechts een klein deel (~2%) van de bekende missense varianten heeft een klinische interpretatie ^1,3.

Een prominent voorbeeld van dit probleem is Ube3a, een gen dat codeert voor een E3-ubiquitineligase dat zich richt op substraateiwitten voor afbraak⁴. Ube3a bevindt zich binnen chromosoom 15q11-13 en wordt uitsluitend uitgedrukt uit het maternale erfelijke allel ^5,6,7. Observaties uit de ziektegenetica suggereren sterk dat onvoldoende of overmatige activiteit van het UBE3A-enzym verschillende neurologische ontwikkelingsstoornissen veroorzaakt. Deletie van maternale chromosoom 15q11-13 veroorzaakt Angelman-syndroom (AS)⁸, een aandoening die wordt gekenmerkt door ernstige intellectuele achterstand, motorische stoornissen, epileptische aanvallen, een gelukkige houding met frequent glimlachen en dysmorfe gelaatstrekken ^8,9,10. Daarentegen veroorzaakt duplicatie of tripplicatie van maternale chromosoom 15q11-13 het Dup15q-syndroom, een heterogene aandoening die wordt erkend als een van de meest voorkomende syndromale vormen van autisme 11,12,13. Bovendien zijn er honderden missense-varianten geïdentificeerd in Ube3a, waarvan de meerderheid wordt beschouwd als varianten van onzekere betekenis (VUS) omdat hun functionele en klinische betekenis onbekend zijn. Er is dus veel interesse in het ontwikkelen van methoden die Ube3a-varianten empirisch kunnen beoordelen om te bepalen of ze bijdragen aan neurologische ontwikkelingsziekten.

Het UBE3A-enzym behoort tot de HECT-domeinfamilie (homoloog aan E6-AP C-terminus) van E3-ubiquitine-ligases die allemaal het gelijknamige HECT-domein bezitten, dat de biochemische machinerie bevat die nodig is om geactiveerd ubiquitine uit E2-enzymen te accepteren en over te brengen naar substraateiwitten¹⁴. Historisch gezien is de karakterisering van E3-enzymen gebaseerd op gereconstitueerde in vitro systemen die een ensemble van gezuiverde eiwitten vereisen ^4,15,16. Dergelijke methoden zijn traag en arbeidsintensief en niet vatbaar voor het beoordelen van de activiteit van een groot aantal varianten. In eerder werk werd UBE3A geïdentificeerd om de Wnt-route in HEK293T-cellen te activeren door de functie van het proteasoom te moduleren om de afbraak van β-catenine¹⁷ te vertragen. Dit inzicht maakt het gebruik van Wnt-pathway-verslaggevers mogelijk als een efficiënte en snelle methode om zowel verlies- als gain-of-function-varianten van Ube3a¹⁸ te identificeren. Het onderstaande protocol beschrijft in detail een methode om Ube3a-varianten te genereren, evenals een op luciferase gebaseerde verslaggever om veranderingen in de activiteit van Ube3a-varianten te beoordelen.

Protocol

1. Mutagenese klonen om Ube3a varianten te genereren

1. Kloon alle Ube3a-varianten in het pCIG2-plasmide (figuur 1A), een bicistronische vector die een kip-β-actinepromotor en een interne ribosoominvoerplaats (IRES) bevat voor EGFP-expressie¹⁹. Ube3a-constructies van volledige lengte bevatten een N-terminale Myc-tag-reeks en worden gekloond in pCIG2 met behulp van een 5 'SacI-site en een 3'XmaI-site. Bovendien worden natuurlijk voorkomende EcoRI-, EcoRV- en PstI-sites binnen de Ube3a-coderingssequentie ook gebruikt om subklonefragmenten te maken.
   OPMERKING: Gedeïdentificeerde varianten voor Ube3a kunnen worden verkregen via de literatuur en in openbaar toegankelijke repositories zoals de ClinVar-database¹. Aanvullende niet-gerapporteerde varianten kunnen worden verkregen via persoonlijke communicatie met medische centra.
2. Gebruik een aangepaste tweestaps megaprimer mutagenese methode²⁰ om mutaties in het Ube3a-leesframe te introduceren. Ontwerp in de eerste stap het mutagene oligonucleotide dat de gewenste mutatie bevat (het voorbeeld in dit protocol is om een UBE3A Q588E-variant te genereren) geflankeerd door ten minste 30 basenparen (bp) homologie 5′ en 3′ tot de mutatie (figuur 1B en tabel 1).
3. Gebruik het mutagene oligonucleotide samen met een complementair oligonucleotide voor de eerste ronde PCR om een megaprimer van 200-400 bp te genereren die de mutatie bevat (figuur 1C; Tabel 2 en tabel 3). Gebruik de volledige 50 μL van het PCR-reactievolume voor agarose gel-elektroforese met behulp van een 1% gel en daaropvolgende gelzuivering (materiaaltabel). Eluteer het PCR-product in 30 μL gedeïoniseerd H₂O (diH₂O) voor gebruik in de tweede ronde PCR-stap hieronder.
4. Stel de tweede ronde PCR in zoals aangegeven (figuur 1C; Tabel 2 en tabel 3). Deze stap genereert grotere DNA-fragmenten (meestal ~ 1-1,5 kb lang) met de mutatie- en terminale beperkingsplaatsen die geschikt zijn voor subklonen (figuur 1C).
5. Na voltooiing van de PCR-reactie, zuivert u het resulterende product met behulp van een PCR-zuiveringskit (Materiaaltabel). Eluteer in 30 μL en verteer al het gezuiverde product en de pCIG2 Ube3a WT-constructie met de juiste restrictie-enzymen (het voorbeeld toont de spijsvertering met EcoRI en XmaI).
6. Na 2 uur vertering bij 37 °C, los de verteringsproducten op door middel van agarose gel elektroforese (1% gel) en gelzuiver de juiste producten. Stel ligaties in volgens het protocol van de fabrikant (Tabel van Materialen), transformeer de ligatieproducten in een DH10B-bacteriestam (Tabel van Materialen) en plaats vervolgens met ampicilline (100 μg / ml) selectie.
7. Kies de volgende dag twee tot vier kolonies om 3 ml culturen met Luria Bouillon (LB) en 100 μg / ml ampicilline te enten. Laat de culturen een nacht groeien bij 37 °C in een orbitale incubator met schudden (225 rpm).
8. Gebruik de volgende dag 1-1,5 ml van de bacteriecultuur om het plasmide-DNA te miniprepteren (materiaaltabel). Bewaar de resterende cultuur door ze op 4 °C te plaatsen. Screen de miniprepped plasmiden door Sanger sequencing met behulp van een oligonucleotide dat ~200 bp bindt van de gewenste mutatie.
9. Gebruik de bacterieculturen die bij 4 °C zijn opgeslagen om 50 ml culturen opnieuw te enten om het juiste plasmide te midiprepen (Tabel van Materialen). Volledige sequence de Ube3a-coderende sequentie om de juiste sequentie van het DNA te valideren.
10. Creëer werkvoorraden van Ube3a variant plasmiden, evenals de β-catenine geactiveerde reporter (BAR)²¹, TK-Renilla luciferase, ligase-dode Ube3a (UBE3A C820A mutatie), en pCIG2 lege vector in een concentratie van 100 ng/μL met behulp van steriele H₂O voor de daaropvolgende transfectiestappen.

2. Bereiding en transfectie van menselijke embryonale nier 293T (HEK293T) cellen

1. Voer de testen uit in HEK293T-cellen gekweekt in Dulbecco's gemodificeerde Eagle-medium (DMEM) vooraf aangevuld met glutamine, 10% foetaal runderserum (FBS) en antibioticum-antimycotisch middel zoals eerder beschreven¹⁷. Kweek de cellen in een steriele, bevochtigde incubator bij 37 °C met 5% CO₂.
2. Gebruik een bioveiligheidskast om eerst de gesuspendeerde HEK293T-cellen op weefselkweekbehandelde 96-well flat-bottomed platen te plaatsen met een dichtheid van 2,2 × 10⁴ cellen per put in 100 μL kweekmedia en laat ze 's nachts groeien.
3. Transfecteer op de tweede dag de cellen in een bioveiligheidskast met Firefly en Renilla luciferase reporter plasmiden (tabel 4) en Ube3a plasmiden in drievoud. Voer de transfecties uit in 10 μL totaal volume per put met behulp van een verhouding van 10:1:8 van plasmiden (respectievelijk 50 ng BAR, 5 ng TK-Renilla en 40 ng Ube3a plasmide per put), zoals eerder beschreven¹⁸ en 0,4 μL transfectiereagens (tabel 4).
   OPMERKING: Voor elk experiment worden een lege vector (alleen GFP) en een plasmide dat codeert voor ligase-dode Ube3a ook getransfecteerd om als negatieve controles te dienen.
4. Maak een hoofdmengsel voor de transfecties voor elke variant in een microcentrifugebuis van 1,5 ml (tabel 4) en incubeer bij kamertemperatuur (RT) gedurende 15 minuten. Roer na de incubatie voorzichtig het transfectiemengsel door op de buis te tikken en voeg vervolgens 10 μL van het transfectiemengsel rechtstreeks toe aan de bestaande groeimedia in de putten.
5. Breng daarna de cellen terug naar de couveuse en laat de plasmiden gedurende 48 uur tot expressie komen. Vervanging van de groeimedia is niet nodig.
6. Bewaak de transfectie-efficiëntie door GFP-fluorescentie met behulp van een fluorescentiemicroscoop. HEK293T-cellen worden efficiënt getransfecteerd door deze methode en >80% van de cellen zou GFP na 48 uur tot expressie moeten brengen.

3. Meting van luciferase-activiteit

OPMERKING: Luciferase-activiteit wordt beoordeeld met behulp van een in de handel verkrijgbaar systeem dat zowel Firefly als Renilla luciferase (Materiaaltabel) test volgens het protocol van de fabrikant.

1. Zuig de kweekmedia zorgvuldig op uit getransfecteerde HEK293T-cellen en was de cellen vervolgens met koude fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Aspirateer de PBS en lyseer de cellen door 25 μL niet-denaturerende lysisbuffer toe te voegen en incubeer gedurende 15 minuten met zacht schommelen op ijs.
2. Voeg daarna 20 μL van het resulterende lysaat (er is geen centrifugatie nodig) toe aan een nieuwe 96-well testplaat met 100 μL van een Firefly luciferase substraatreagens. Meng het bord voorzichtig door te tikken.
3. Plaats de plaat op een platenlezer en meet de luminescentie met behulp van een topdetector met een leeshoogte van 1 mm en een integratietijd van 1 s.
   OPMERKING: De versterking van de detector moet mogelijk worden aangepast op basis van de sterkte van het signaal.
4. Voeg onmiddellijk na het uitlezen van de Firefly luciferase luminescentie 100 μL Renilla luciferase substraat toe aan de putten. Deze stap dooft tegelijkertijd de Firefly luciferase-activiteit tijdens het beoordelen van renilla luciferase-activiteit. Meng de monsters door voorzichtige beweging van de plaat en meet de luminescentie opnieuw om de Renilla luciferase-activiteit te beoordelen.
   OPMERKING: Hoewel andere platen voor deze test kunnen worden gebruikt, zal het gebruik van platen met zwarte frames en witte putten de meest gevoelige resultaten opleveren, omdat dit het luciferasesignaal versterkt en ruis minimaliseert.
5. Kwantificeer de reacties van de verslaggever als de Firefly luciferase to Renilla luciferase ratio (Firefly/Renilla) en gemiddelde de waarden van de drievoudige metingen. Normaliseer daarna de Firefly/Renilla-waarde voor elke variant tegen de waarden voor wild-type (WT) Ube3a-expressiecellen om de relatieve activiteit van varianteiwitten te vergelijken.

Results

Grootschalige functionele screening van Ube3a missense-varianten identificeert een breed landschap van verlies- en gain-of-function-mutaties
Eerder werk met Ube3a-mutanten suggereerde dat de Wnt-respons kan dienen als een verslaggever van cellulaire UBE3A-eiwitactiviteit. Deze waarnemingen werden uitgebreid en aanvullende validatie-experimenten werden uitgevoerd om te onderzoeken of de BAR-test geschikt is om een reeks UBE3A-activiteiten in de cel te rapporteren. Ten eerste werden HE...

Discussion

Het hier beschreven protocol biedt een efficiënte en schaalbare methode om de enzymatische activiteit van Ube3a-varianten te beoordelen. Er zijn verschillende technische details die een zorgvuldige overweging rechtvaardigen bij het gebruik van deze test. Een overweging is de keuze van Wnt reporter plasmiden die in deze test worden gebruikt. Het hier beschreven protocol maakt specifiek gebruik van de β-catenine activated reporter (BAR)²¹, een reporter die een concatemeer van 12 T-cell fact...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red	Gibco	25300-054
1 Kb DNA ladder	Lambda Biotech	M108-S
100 bp DNA Ladder	Lambda Biotech	M107
10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10 mM ATP	New England BioLabs	B0202A
5x Phusion HF Reaction Buffer	New England BioLabs	B0518S
Antibiotic-Antimycotic Solution	Corning	30004CI
Black/White Isoplate-96 Black Frame White Well plate	PerkinElmer	6005030
Carbenicillin Disodium Salt	Midwest Scientific	KCC46000-5
Countess cell counting chamber  slides	Invitrogen by Thermo Fisher Scientific	C10283
Countess II Automated Cell Counter	life technologies		Celteller
Custom DNA oligos	Integrated DNA Technologies (IDT)
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix	New England BioLabs	N0447S
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate	Gibco	10569044	Basismedium voor het ondersteunen van de groei van de HEK293T-cellijn
DPBS (1x)	Gibco	14190-136
Dual-Luciferase Reporter Assay System	Promega	E1910
EcoRI-HF	New England BioLabs	R3101S	Beperkingsenzym
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated	Gibco	16140071	Fetaal bovien serum
Fisherbrand Surface Treated Tissue Culture Dishes	Fisherbrand	FB012924
FuGENE 6 Transfection Reagent	Promega	E2691
Gel Loading Dye Purple (6x)	New England BioLabs	B7024A
HEK293T cells	ATCC	CRL-3216
High Efficiency ig 10B Chemically Competent Cells	Intact Genomics	1011-12	E. coli DH10B-cellen
HiSpeed Plasmid Midi Kit	Qiagen	12643	Midi prep
pCIG2 plasmid
pGL3 BAR plasmid
Phusion HF DNA Polymerase	New England BioLabs	M0530L	DNA-polymerase
ProFlex 3 x 32 well PCR System	Applied biosystems by life technologies		Thermocycler
pTK Renilla plasmid
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)	Qiagen	27106	Mini prep
QIAquick Gel Extraction Kit (250)	Qiagen	28706	Gel zuivering
QIAquick PCR Purification Kit (250)	Qiagen	28106	PCR-zuivering
rCutSmart Buffer	New England BioLabs	B6004S
SacI-HF	New England BioLabs	R3156S	Beperkingsenzym
Synergy HTX Multi-Mode Reader	BioTek		Plate reader draait op Gen5 software v3.08 (BioTek)
T4 DNA Ligase	New England BioLabs	M0202L	Ligase
TAE Buffer, Tris-Acetate-EDTA, 50x Solution, Electrophoresis	Fisher Scientific	BP13324
Tissue Culture Plate 96 wells, Flat Bottom	Fisherbrand	FB012931
UltraPure Ethidium Bromide Solution	Invitrogen by Thermo Fisher Scientific	15585011
XmaI	New England BioLabs	R0180S	Beperkingsenzym