De dierproeven werden uitgevoerd volgens de principes van het regionaal comité (Ministerium für Energiewende, Landwirtschaft, Umwelt, Natur und Digitalisierung des Landes Schleswig-Holstein, vergunningsnummer: V242-21249/2020 [38-4/20]). De muizen die voor dit onderzoek werden gebruikt, werden verkregen uit een commerciële bron (zie Materiaaltabel). De dieren werden gehouden onder standaardomstandigheden met een 12 uur lichte, 12 uur nachtcyclus; water en voedsel werden ad libitum aangeboden.
1. Verzorging van dieren
- Huis de muizen in gespecialiseerde kooien met beddengoed, nestmateriaal, een schuilplaats en goede toegang tot drinkwater en voedsel.
- Houd de dieren onder continue gespecialiseerde veterinaire controle en behandeling.
OPMERKING: Voor muizen die door externe leveranciers zijn besteld, moet u 7 dagen acclimatisatie garanderen voordat u de procedure start.
2. Voorbereiding van de o-ring
OPMERKING: Een o-ring met een vaste diameter van 0,4 mm wordt aanbevolen om na 2 weken cardiale hypertrofie te induceren. De omvang en ernst van het geïnduceerde cardiale fenotype zijn afhankelijk van de grootte van de o-ringdiameter.
- Voer eerst één snede van de o-ring (zie Tabel van materialen) onder de microscoop uit met een schaar of een scalpel om de plaatsing rond de aorta mogelijk te maken (figuur 1A, B).
- Prik elke ringzijde dicht bij de snede met een naald verbonden met een 8-0 niet-absorbeerbare hechting en trek aan de draad. Snijd en laat 2-3 cm aan de ene kant en 2 cm aan de andere kant om de o-ring rond de aorta in de laatste stap vast te maken (figuur 1C, D).
- Neem vóór de operatie het ligatiehulpmiddel (soortinstrument, zie Tabel met materialen) en trek het uiteinde van de draad (dat langer wordt bewaard) van één ringzijde door het gat van de vernauwing (figuur 1E, F). Leg de ligatiehulp met de bevestigde o-ring opzij voor plaatsing in de volgende stap (stap 6).
- Voor de desinfectie van de ring met de draden, plaats de ring gedurende een half uur in een alcoholoplossing. Leg het daarna op cellulose om te drogen. Bewaar de gedroogde ring in een gesloten kuip of hoesje tot gebruik. Tijdens de operatie, nadat u de draad door het ligatiehulpmiddel hebt getrokken, plaatst u de ring op een schoon oppervlak tot gebruik.

Figuur 1: Het uitvoeren van de o-ringvoorbereiding voor ligatie. (A) Een o-ring met een vaste diameter wordt aan één kant met een schaar of een scalpel gesneden. (B) Afbeelding van een o-ring. (C) Elke o-ringzijde wordt doorboord met een 8-0 prolene draad. (D) O-ring doorboord met twee draden. (E) De draden van één ringzijde van de o-ring worden door het gat van het ligatiehulpmiddel getrokken. (F) Definitieve positie vóór plaatsing: de draden van de ene zijde worden door het gat van het ligatiehulpmiddel geplaatst, terwijl de draden van de andere zijde los worden gehouden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Premedicatie van de muizen en voorbereiding van het werkveld
- Om voldoende analgesie te ontvangen tijdens de operatie, injecteert u de pijnstillende buprenorfine (0,1 mg/kg, zie materiaaltabel) intraperitoneaal 20 minuten voordat u doorgaat naar de operatie.
OPMERKING: Voor deze studie werd de pijnmedicatie gebruikt volgens de aanbevelingen van de Gesellschaft für Versuchstierkunde /Society of Laboratory Animal Science (GV-SOLAS).
- Na premedicatie verdooft u de muis in een inductiekamer met 2% -4% isofluraan gemengd met 0,5-1,0 l / min van 100% O2.
- Scheer de vacht aan de linker thoraxzijde van de verdoofde muis. Plaats de muis na het scheren terug in de met isofluraan gevulde kamer en wacht op voldoende sedatie voordat u het dier intubeert.
OPMERKING: Het juiste tijdstip van de sedatie toont een langzame ademhaling, maar vermijdt snap breathing. Afhankelijk van de isofluraangasinstelling duurt het 2-3 minuten om het juiste niveau van sedatie te bereiken.
- Zet het verwarmingskussen voor de operatie aan om de lichaamstemperatuur van het dier (37 °C) te handhaven. Sluit het verwarmingskussen aan op een rectale sonde (zie Materiaaltabel) om de lichaamstemperatuur van de muis automatisch te handhaven.
4. Intubatie van de muizen
- Bereid de vereiste instrumenten voor (figuur 2A). Desinfecteer de laryngoscoop vóór de operatie door deze ongeveer 1-3 minuten in alcohol te plaatsen en vervolgens een nacht te drogen.
- Rek een elastiekje rond het verwarmingskussen om de muis met de voortanden op de plaat te bevestigen. Plaats de verdoofde muis in rugligging op het verwarmingskussen.
- Plaats het elastiekje over de voortanden van het dier om de nek op de plaat te verlengen.
- Richt een lichtbron op de keel voor een goede zichtbaarheid van de opening van de luchtpijp voor de endotracheale intubatie (figuur 2B).
- Open de mond voorzichtig met één hand en plaats een intubatiehulpmiddel (handgemaakte laryngoscoop, zie Materiaaltafel) (figuur 2A[3]).
- Beweeg met de andere hand en kleine tang voorzichtig de tong om de opening van de luchtpijp vrij te maken.
- Gebruik deze hand ook om de endotracheale buis in de luchtpijp te brengen. Aan de andere kant, houd nog steeds de intubatiehulp vast. Gebruik voor intubatie een canule van 22 G (zie materiaaltabel) (figuur 2A[1]).
- Sluit de positie van de endotracheale buis via een driewegstopkraan aan op een ventilator (zie Materiaaltabel) voor muizen om de juiste endotracheale buispositie (endotracheal) te bevestigen.
- Bewaak de juiste ventilatie volgens de instructies van de fabrikant (getijdenvolume van 200 μL en ademhalingsfrequentie tussen 100-150 ademhalingen/min) (figuur 2C).
- Bevestig voldoende anesthetische diepte door een teenknijflexcontrole (geen reflexrespons).
- Zet de anesthesie-instelling op 2% isofluraan gemengd met 0,5-1,0 l/min 100% O2.
- Breng oogheelkundige zalf aan op de ogen om droogheid tijdens de operatie te voorkomen.
- Desinfecteer met behulp van een wattenstaafje het operatiegebied 3 keer met een in de handel verkrijgbare desinfectiemiddeloplossing (zie Materiaaltabel).

Figuur 2: Intubatie van de muis. (A) Intubatie-instrumenten: (1) Een 22 G i.v. canule wordt gebruikt als endotracheale buis (zonder mandarijn); (2) Tang; (3) Handgemaakte laryngoscoop (vervormde / afgeplatte canule gelijmd met houten stokken en tape). (B) Het uitvoeren van intubatie op het geplaatste verwarmingskussen. (C) Geïntubeerde muis aangesloten op een ventilator. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
5. Chirurgie en voorbereiding voor ringpositionering
OPMERKING: Gebruik steriele materialen en instrumenten om infecties te voorkomen.
- Gebruik een schaar om een 0,5-1 cm lange huidincisie te maken in het midden van een lijn tussen het xyfusproces en de linker oksel. Gebruik een tang om de spierlaag van de onderliggende ribben te scheiden en plaats twee retractors (5 mm lengte, zie materiaaltabel) in de incisie om de ribbenkast bloot te leggen.
- Om de linker thoracotomie te starten, voert u een kleine incisie (~ 1-2 mm) uit in de intercostale spieren tussen de tweede en derde rib met behulp van een microveerschaar. Open de thoracale holte en verdeel de incisie met een schuine tang van 45°.
- Plaats drie borstterugtrekkingen (1,0-2,5 mm lang) in de incisie voor het openen van de thoracale holte om de visualisatie te verbeteren.
- Om de aortaboog bloot te leggen, probeer de thymus en het vetweefsel op te tillen en voorzichtig van de boog te scheiden met een fijne punt 45 ° schuine tang.
6. Ligatie van de transversale aorta met de o-ring
- Leg de aortaboog bloot met een 45° schuine tang in één hand. Plaats met de andere hand de o-ring verbonden met de ligatiehulp via de draden van één zijde (stap 2).
- Passeer de draden met behulp van het ligatiehulpmiddel onder de aortaboog van de caudale kant naar de schedelzijde van de transversale aorta tussen de brachiocephalische en linker gemeenschappelijke halsslagaders (figuur 3A).
- Neem beide draden tussen het ligatiehulpmiddel en de aortaboog voorzichtig met de tang. Trek de ligatiehulp in en verwijder deze en plaats de o-ring voorzichtig rond de boog door aan de draden aan elke kant te trekken (figuur 3B).
- Na succesvolle positionering bevestigt u de o-ring met de draden en een chirurgische knoop. Maak een extra om te voorkomen dat de knoop aan elke kant wordt geopend (figuur 3C).

Figuur 3: Uitvoeren van de o-ringimplantatie. (A) De aortaboog wordt blootgesteld door drie retractoren van 1,0-2,5 mm. Beide lange draden van één ringzijde worden onder de aorta doorgegeven. (B) De o-ring wordt geplaatst door zachtjes op de ring te duwen en aan de draden te trekken. (C) De is o-ring bevindt zich in de juiste positie en één schedeldraad is aan elke kant geknoopt met caudale draad. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
7. Hechting en postoperatief herstel
- Verwijder de drie borstoprolmechanismen (2,5 mm lang) van de incisie.
- Verwijder indien nodig de resterende lucht uit de thorax door deze te vullen met een warme 0,9% isotone zoutoplossing.
- Om de thoraxincisie bloot te leggen voor hechting, neemt u opnieuw twee retractors (5 mm lang) om de huid aan de zijkant te houden.
- Sluit de thorax met twee of drie 6-0 niet-absorbeerbare hechtingen (zie Materiaaltabel) en knijp de uitstroom van de ventilator gedurende 2 s af om de longen opnieuw op te blazen.
- Verwijder de twee retractors en sluit de huid met drie tot vijf 4-0- absorbeerbare hechtingen.
- Schakel de isofluraan en monitor uit. Wanneer het dier zichzelf begint te ademen, bewegen de snorharen en kunnen de teenknijpreflexen worden geactiveerd, de muis uitbannen. Leg de muis aan de linkerkant onder de warmtelamp in zijn verzorgingseenheid en observeer hem totdat hij helemaal wakker is.
- Laat een dier niet onbeheerd achter totdat het weer voldoende bij bewustzijn is.
OPMERKING: Een dier dat een operatie heeft ondergaan, moet zijn eigen zorgeenheid (kooi) krijgen voor een beter herstel.
- Voer pijnbestrijding uit met tramadol (1 mg / ml) in drinkwater gedurende 7 dagen en buprenorfine (0,1 mg / kg, 3x daags) door intraperitoneale injectie gedurende 3 dagen na de operatie indien nodig.
OPMERKING: Volg de aanbevelingen van de lokale commissie voor dierethiek voor postoperatieve analgesie.
- Controleer medicatie door de waterflessen dagelijks te wegen en het gedrag van het dier in de gaten te houden.
8. Bevestiging van succesvolle vernauwing en juiste positie van de ring
- Controleer een dag na de operatie de stenose met behulp van echografie door de maximale stroomsnelheid over de stenose te meten.
- Gebruik voor metingen echocardiografie met een echografiesysteem en een transducersonde met een frequentie van 30 MHz (zie Materiaaltabel).
- Zoals hierboven beschreven, onderhoud anesthesie met behulp van een masker op 1,5% -2% isofluraan met 0,5-1,0 l / min van 100% O2.
- Plaats het verdoofde dier in rugligging op het verwarmingskussen. Sluit het verwarmingskussen aan op een rectale sonde om de lichaamstemperatuur op 37 °C ± 1 °C te houden en controleer de hartslag met een ECG met behulp van vier muispootsensoren (zie Materiaaltabel).
- Gebruik voor een betere visualisatie ontharingscrème.
- Een succesvol uitgevoerde ORAB resulteert in een verhoogde stroomsnelheid over de stenose zoals gemeten door echografie (~ 2.400 mm / s) (figuur 4C). Plaats voor deze meting de transducerkop parasternaal aan de rechterkant van de thorax om de aortaboog te lokaliseren door middel van tweedimensionale (2D) beeldvorming ("B-modus").
- Gebruik de kleur Doppler om de bloedstroom in de aorta te visualiseren en meet met de gepulste golf Doppler bloedstroomsnelheid over de stenose.
OPMERKING: Schijngeoperatiede muizen (controlechirurgie zonder vernauwing) vertonen een bloedstroomsnelheid van ~ 600-900 mm / s. Daarnaast resulteert een succesvolle ORAB ook in een verhoogde snelheidsstroomverhouding tussen de rechter halsslagader (~150 mm/s) (RC, Figuur 4A) en de linker halsslagader (~300 mm/s) LC, Figuur 4B) in de muis.
- Visualiseer de rechter en linker arteria carotis interna door middel van tweedimensionale (2D) beeldvorming (B-modus). Plaats de transducerkop horizontaal aan de linker- en rechterkant van de nek in een hoek van 45° en gebruik de gepulseerde golf Doppler om de bloedstroomsnelheid te bepalen.
OPMERKING: Bij schijnmuizen is de snelheidsstroom in beide slagaders vergelijkbaar.

Figuur 4: Bevestiging van transversale aortaligatie met behulp van pulsgolf Dopplersnelheidsmeting in de halsslagaders. (A) Representatieve gepulseerde golf Dopplersnelheidssignalen van de rechter halsslagader. (B) De stenose resulteert in een hogere stroomsnelheid in de rechter halsslagader dan in de linker. (C) De door vernauwing geïnduceerde stenose resulteert in een stroomsnelheid in de dalende aorta van meer dan 2.400 mm/s. Schijnmuizen vertonen een stroomsnelheid van 600-900 mm/s. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.