Het huidige protocol beschrijft de extractie van lumican uit het vruchtwatermembraan (AM) en hun opslagcondities als AM-extract (AME) bij -20 °C, 4 °C en kamertemperatuur (RT) gedurende 6, 12, 20 en 32 dagen om de eiwitten en lumicanconcentratie te kwantificeren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Lumican Extractie uit vruchtwatermembraan en bepaling van de opslagtemperatuur
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Lumican is een klein leucine-rijk proteoglycaan in het menselijk vruchtwatermembraan (AM) dat cornea-epithelisatie en de organisatie van collageenvezels bevordert, waardoor de transparantie van het hoornvlies behouden blijft. In het huidige werk wordt een methode voor eiwitextractie uit AM voorgesteld om lumican te verkrijgen. Daarnaast wordt de stabiliteit van lumican in het AM-extract (AME) opgeslagen bij verschillende temperaturen en tijdsperioden geëvalueerd. 100 mg AM werd ontdooid en mechanisch gedepitheliseerd. De gedepitheliseerde AM werd ingevroren en geplet totdat een fijn poeder werd verkregen, dat werd opgelost met 2,5 ml zoutoplossingsbuffer met proteaseremmers en gecentrifugeerd voor eiwitextractie. Het supernatant werd verzameld en bewaard bij -20 °C, 4 °C en kamertemperatuur (RT) gedurende 6, 12, 20 en 32 dagen. Daarna werd lumican in elke AME gekwantificeerd. Deze techniek maakt een toegankelijk en acquireerbaar protocol mogelijk voor lumican extractie uit AM. De Lumican-concentratie werd beïnvloed door de opslagtijd en temperatuuromstandigheden. Lumican in de AME van 12 dagen bewaard bij -20 °C en 4 °C was significant hoger dan andere AME. Deze lumican-extractie kan nuttig zijn voor het ontwikkelen van behandelingen en farmaceutische oplossingen. Verdere studies zijn nodig om het gebruik van AME lumican in re-epithelisatie en wondgenezingsproces te bepalen.
Inleiding
Een van de meest gebruikte behandelingen voor cornea-aandoeningen is vruchtwatermembraantransplantatie; in de afgelopen jaren zijn er echter nieuwe voorstellen ontstaan voor het gebruik van verschillende componenten van vruchtwater als alternatieve en adjuvante behandelingen. Een van de meest bestudeerde componenten van AM zijn die verkregen uit het AM-extract (AME)1,2,3,4,5,6,7. AM bevat meerdere oplosbare factoren zoals antiangiogene ei....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door de Institutional Review Board (Project No. CEI-2020/06/04). De AM werd verkregen van het Instituto de Oftalmologia Conde de Valenciana amnion bank (van gedeïdentificeerde menselijke proefpersonen), die wordt bereid zoals beschreven door Chávez-García et al.17.
1. Bereiding van het vruchtwatermembraanextract
- Verkrijg 100 mg AM van de amnionbank.
OPMERKING: Volgens een eerder rapport scheidt 50 mg AM in totaal 10 ng / ml lumican14 uit. Om een hogere concentratie lumican te verkrijgen, gebruikt u 100 mg AM, wat ov....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De resultaten worden gerapporteerd als de gemiddelde waarde ± standaarddeviatie (SD). De t-tests van de student en de variantieanalyse (ANOVA) werden uitgevoerd. P-waarden < 0,05 werden als statistisch significant beschouwd. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van statistische software (zie Tabel van materialen).
De totale eiwithoeveelheid in de AME werd beïnvloed door tijd en opslagomstandigheden. De basale eiwitconcentratie was vergelijkbaar bij.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In deze studie werd de aanwezigheid van lumican in de AME geanalyseerd en de directe correlatie met de stabiliteit onder verschillende opslagomstandigheden. Interessant is dat wanneer de totale eiwitconcentratie in AME werd gekwantificeerd, de eiwitconcentratie na opslag toenam. Er zijn aanwijzingen voor drie mechanismen die de eiwitconcentratie in bevroren opslag kunnen veranderen: koude denaturatie, de bevroren concentratie van opgeloste stoffen en door ijs geïnduceerde gedeeltelijke ontplooiing van eiwitstructuur
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De studie werd gefinancierd door het ondersteuningsprogramma voor onderzoeks- en technologische innovatieprojecten van de Universidad Nacional Autonoma de Mexico (grant no. PAPIIT IN203821) en het ministerie van Onderwijs, Wetenschap, Technologie en Innovatie (grant nr. SECTEI 250/2019).
Dankbetuigingen
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1 N H2SO4 stop solution | R&D Systems | DY994 | |
| 100 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 1000 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 15 mm Petri dish | Symlaboratorios | ||
| 18 G Needle (1.2 mm x 40 mm) | BD Becton Dickinson | 305211 | |
| 2 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | Z606340 | |
| 20 mL plastic syringe | BD Becton Dickinson | 302562 | |
| 20 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 20-200 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 5 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | 30119401 | |
| 96-well microplate | SARSTEDT | 821581 | |
| Aluminum foil | N/A | N/A | |
| Amniotic membrane | Instituto de Oftalmologia Conde de Valenciana Amnion Bank | 100 mg | |
| Balanced salt solution | Bausch + Lomb | BSS-403802 | |
| Beaker | N/A | N/A | |
| BioRender | BioRender | figures design | |
| Compact Rocker | BioRad | 970822DD | Mod. 5202SD-BIO |
| complete, EDTA-free, Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11 873 580 001 | Protease Inhibitor |
| Daiggner vortex Genie 2 | A.Daigger & Co., INC | 22220A | |
| Dispase II | Gibco | 17105-041 | |
| ELISA plate spectrometer | Thermo Labsystems | 35401106 | Multiscan |
| Freezer | |||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc | version 9 | statistical analysis and graphic program |
| Human lumican DuoSet ELISA kit | R&D Systems | DY2846-05 | includes human Lumican capture antibody |
| Incubator | Forma Scientific | 3326 S/N 36481-7002 | |
| Inverted light Microscope | Olympus | 6A13921 | to confirm de-epithelialization Mod.CK2 |
| Laminar flow hood | Forma Scientific | 14753-567 | Mod.1184 |
| Liquid nitrogen | N/A | N/A | |
| Mortar | N/A | N/A | |
| Multi-channel pipettor | Eppendorf | ||
| Nitrogen Tank | Thermo Scientific | Mod. Biocan 20 | |
| Paper towels | N/A | N/A | |
| Phosphate-buffered saline | R&D Systems | DY006 | |
| Pierce Modified Lowry Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23240 | |
| Plate sealers | R&D Systems | DY992 | |
| Reagent diluent | R&D Systems | DY995 | 1% BSA in PBS, pH 7.2-7.4, 0.2 μm filtered |
| Refrigerated centrifuge | centurion scientific Ltd | 15877 | Mod. K2015R |
| Rubber policeman cell scraper | NEST | 710001 | for mechanical de-epithelialization |
| Scalpel knife | Braun | BB521 | No. 10 or 21 |
| Streptavidin-HRP 40-fold concentrated | R&D Systems | part 893975 | |
| Substrate tetramethylbenzidine (TMB) solution | R&D Systems | DY999 | |
| Toothed tweezers | Invent Germany | 6b | inox |
| Ultrapure water | PISA | ||
| Wash buffer | R&D Systems | WA126 | 0.05% Tween 20 in PBS, pH 7.2-7.4 |
Referenties
- Jirsova, K., Jones, G. Amniotic membrane in ophthalmology: properties, preparation, storage and indications for grafting-a review. Cell and Tissue Banking. 18 (2), 193-204 (2017).
- Witherel, C., Yu, T., Concannon, M., Dampier, W., Spiller, K.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
