Methodenartikel

Lumican Extractie uit vruchtwatermembraan en bepaling van de opslagtemperatuur

DOI:

10.3791/64460

⸱

14 oktober 2022

 ,  ,  , 
1Instituto de Oftalmologia Fundacion Conde de Valenciana IAP, 2Biochemistry Department, Medicine Faculty, Universidad Nacional Autónoma de Mexico

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het huidige protocol beschrijft de extractie van lumican uit het vruchtwatermembraan (AM) en hun opslagcondities als AM-extract (AME) bij -20 °C, 4 °C en kamertemperatuur (RT) gedurende 6, 12, 20 en 32 dagen om de eiwitten en lumicanconcentratie te kwantificeren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lumican is een klein leucine-rijk proteoglycaan in het menselijk vruchtwatermembraan (AM) dat cornea-epithelisatie en de organisatie van collageenvezels bevordert, waardoor de transparantie van het hoornvlies behouden blijft. In het huidige werk wordt een methode voor eiwitextractie uit AM voorgesteld om lumican te verkrijgen. Daarnaast wordt de stabiliteit van lumican in het AM-extract (AME) opgeslagen bij verschillende temperaturen en tijdsperioden geëvalueerd. 100 mg AM werd ontdooid en mechanisch gedepitheliseerd. De gedepitheliseerde AM werd ingevroren en geplet totdat een fijn poeder werd verkregen, dat werd opgelost met 2,5 ml zoutoplossingsbuffer met proteaseremmers en gecentrifugeerd voor eiwitextractie. Het supernatant werd verzameld en bewaard bij -20 °C, 4 °C en kamertemperatuur (RT) gedurende 6, 12, 20 en 32 dagen. Daarna werd lumican in elke AME gekwantificeerd. Deze techniek maakt een toegankelijk en acquireerbaar protocol mogelijk voor lumican extractie uit AM. De Lumican-concentratie werd beïnvloed door de opslagtijd en temperatuuromstandigheden. Lumican in de AME van 12 dagen bewaard bij -20 °C en 4 °C was significant hoger dan andere AME. Deze lumican-extractie kan nuttig zijn voor het ontwikkelen van behandelingen en farmaceutische oplossingen. Verdere studies zijn nodig om het gebruik van AME lumican in re-epithelisatie en wondgenezingsproces te bepalen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een van de meest gebruikte behandelingen voor cornea-aandoeningen is vruchtwatermembraantransplantatie; in de afgelopen jaren zijn er echter nieuwe voorstellen ontstaan voor het gebruik van verschillende componenten van vruchtwater als alternatieve en adjuvante behandelingen. Een van de meest bestudeerde componenten van AM zijn die verkregen uit het AM-extract (AME)1,2,3,4,5,6,7. AM bevat meerdere oplosbare factoren zoals antiangiogene eiwitten, interleukines (IL), weefselremmers van metalloproteinasen (TIMPs), ontstekingsremmende eiwitten gemedieerd door TSG-6 die neutrofiele extracellulaire vallen remmen, groeifactoren: epidermale groeifactor (EGF), transformerende groeifactor (TGF) (alfa en bèta), keratinocytengroeifactor (KGF), hepatocytengroeifactor (HGF) en lumican, die de transparantie van het hoornvlies handhaaft door collageenfibrillogenesete reguleren 1, 2,3,4,5,6,7,8,9.

Lumican is een kleine leucinerijke proteoglycaan (SLRP), een van de belangrijkste extracellulaire componenten van interstitieel collagenase in de corneastromamamatrix, verantwoordelijk voor het organiseren van collageenvezels en het handhaven van corneatransparantie 4,10,11. Proteoglycanen zijn moleculen in de extracellulaire matrix (ECM), die de belangrijkste zijn bij het uitvoeren van celsignalering en het handhaven van intracellulaire homeostase12. Van ECM-eiwitten is gemeld dat ze de cellulaire processen van proliferatie, differentiatie en migratie tijdens wondgenezing stimuleren11.

Er zijn aanwijzingen voor de mogelijke deelname van lumican aan het proces van cornea-re-epithelisatie. Saika et al., in een studie, toonden aan dat na een hoornvliesletsel, lumican kon worden gedetecteerd in corneale keratocyten tussen de eerste 8 uur en tot 3 dagen na het letsel. Met de hoogste concentratie lumican op de tweede en derde dag, is dit proteoglycaan vervolgens niet detecteerbaar op de zevende dag13. Deze gegevens suggereren de deelname van lumican aan de activering van het cornea-epithelisatieproces. Aan de andere kant werd in een andere studie gemeld dat de afwezigheid van lumican de re-epithelisatie vertraagt; interessant is dat het toevoegen van lumican het re-epithelisatieproces zou kunnen versnellen 4,11,13. Evenzo heeft een recente studie gemeld dat lumican de ontstekingsfuncties van corneale limbus fibroblasten14 kan moduleren, wat een rol suggereert voor lumican als modulator van de inflammatoire, antifibrotische en re-epithelialiserende respons. Op dezelfde manier kan lumican de cornearespons moduleren door interactie met signaalmoleculen zoals Fas-FasL. Ook toonde de afwezigheid van lumican in een knock-out Lum-/- muismodel aan dat het ontbreken van lumican-signalering een adequate hoornvliesreparatie verhindert15.

In de eerste plaats is deze methode bedoeld om een haalbare en toegankelijke manier te demonstreren om lumican uit AM te extraheren. Met deze voordelige methode van lumican-extractie is het mogelijk om vergelijkbare concentraties eiwitten te verkrijgen, waardoor de verwerkingstijd wordt verkort en het voor onderzoekers gemakkelijker wordt in vergelijking met de vorige studies16. Bovendien kan deze AME-lumican worden gebruikt als adjuvans voor corneaherstel en re-epithelisatieprocessen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door de Institutional Review Board (Project No. CEI-2020/06/04). De AM werd verkregen van het Instituto de Oftalmologia Conde de Valenciana amnion bank (van gedeïdentificeerde menselijke proefpersonen), die wordt bereid zoals beschreven door Chávez-García et al.17.

1. Bereiding van het vruchtwatermembraanextract

  1. Verkrijg 100 mg AM van de amnionbank.
    OPMERKING: Volgens een eerder rapport scheidt 50 mg AM in totaal 10 ng / ml lumican14 uit. Om een hogere concentratie lumican te verkrijgen, gebruikt u 100 mg AM, wat overeenkomt met een totale oppervlakte van 32 cm2.
  2. Als de AM bevroren is, ontdooi deze dan bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Voer de volgende procedures uit onder een laminaire stromingskap klasse II B.
  3. Was de AM in een petrischaaltje met 10 ml steriele gebalanceerde zoutoplossing (BSS, zie Materiaaltabel) gedurende 2 min.
    1. Giet de BSS in een bekerglas.
    2. Herhaal stap 3 en bevestig visueel dat glycerolmedium niet aanwezig is in petrischaal BSS.
      OPMERKING: Herhaal stap 3. indien nodig totdat glycerolmedium niet aanwezig is in petrischaal BSS.
  4. Incubeer de AM met 10 ml dispase II (1,7 IE/ml, zie materiaaltabel) bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 30 minuten.
    OPMERKING: Dispase II is een neutraal protease met zachte activiteit boven epitheelcellen. Dit enzym scheidt effectief de intacte epidermis van de dermis en isoleert intacte epithelial sheets18.
  5. Voer na dispase incubatie een mechanische de-epithelisatie14 uit met een rubberen politieagent (zie Materiaaltabel). Bevestig de-epithelisatie door microscopievisualisatie.
    OPMERKING: Het proces van de-epithelisatie wordt bevestigd in een omgekeerde microscoop met behulp van 4x en 20x objectieven. Visualiseer het weefsel om de aanwezigheid van een cellulaire laag uit te sluiten.
  6. Was de AM in een petrischaaltje met 10 ml BSS gedurende 2 min. Giet de BSS in een bekerglas.
  7. Plaats de gedepitheliseerde AM (dAM) in een microcentrifugebuis van 2 ml. Dompel de dAM gedurende 40 minuten onder in vloeibare stikstof.
  8. Maal de bevroren dAM gedurende 2-3 minuten handmatig in een voorgekoelde mortel bij -85 °C totdat een fijn poeder is verkregen.
  9. In de mortel, solubiliteer het dAM-poeder met 2,5 ml proteaseremmeroplossing (BSS met proteaseremmers).
    OPMERKING: Elke tablet proteaseremmer bestaat uit het volgende mengsel van enzymen: pancreasextract (0,02 mg / ml), thermolysine (metalloprotease) (0,0005 mg / ml), chymotrypsine (0,002 mg / ml), trypsine (0,02 mg / ml) en papaïne (0, 33 mg / ml) (zie materiaaltabel).
  10. Verzamel het mengsel met een micropipette en reinig de mortelwanden met behulp van een scalpelmes. Doe het mengsel in een tube van 5 ml.
  11. Meng goed met de vortex gedurende 30 s.
  12. Homogeniseer het weefselmengsel door gedurende 20 minuten bij 4 °C te centrifugeren bij 34 x g en centrifugeer onmiddellijk bij 3360 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C.
  13. Het verzamelde supernatant is de AME (figuur 1). Bewaar 0,7 ml van elke AME in verschillende microcentrifugebuizen van 2 ml gedurende 6, 12, 20 en 33 dagen bij de verschillende temperatuuromstandigheden van -20 °C, 4 °C en kamertemperatuur (RT).

figure-protocol-1
Figuur 1: Proces van AME-bereiding en lumicanconcentratiemeting. 100 mg AM werd geïncubeerd met dispase II bij 37 °C gedurende 30 minuten en mechanisch gedepitheliseerd. De gedepitheliseerde AM werd gewassen en ondergedompeld in vloeibare stikstof gedurende 40 minuten en vervolgens geplet totdat een fijn poeder werd verkregen, dat werd opgelost met 2,5 ml zoutoplossingsbuffer met proteaseremmers en gecentrifugeerd. Het supernatant werd verzameld en bewaard bij -20 °C, 4 °C en RT gedurende 6, 12, 20 en 32 dagen tot de totale eiwit- en lumicankwantificering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. AME-eiwitkwantificering

OPMERKING: De kwantificering van het totale eiwit in de AME moet onmiddellijk na obtentie worden uitgevoerd. Kwantificeer eiwitten met behulp van Lowry-eiwittest en volg de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel). Het wordt aanbevolen om alle normen en monsters in drievoud te testen.

  1. Pipetteer 40 μL van elk monster AME in een 96-well microplaat.
    1. Bereid een standaardcurve in dezelfde microplaat met behulp van runderserumalbumine (BSA) standaard voor een uiteindelijke BSA-concentratie van 0-1.500 μg / ml (0, 1, 5, 25, 125, 250, 500, 750, 1.000 en 1.500 μg / ml).
  2. Pipetteer 200 μL van het gemodificeerde Lowry-reagens naar elke put. Meng het onmiddellijk op een plaatmixer gedurende 30 s.
  3. Bedek de microplaat met aluminiumfolie en incubeer deze gedurende 10 minuten op RT.
  4. Pipetteer 20 μL 1x Folin-Ciocalteu reagens naar elk putje. Meng het onmiddellijk op een plaatmixer gedurende 30 s.
    OPMERKING: Om 1x Folin-Ciocalteu reagens te bereiden, verdun 2x (2N) reagens 1:1 met ultrapuur water. Bereid 1x Folin-Ciocalteu-reagens op dezelfde dag van gebruik omdat het verdunde reagens onstabiel is.
  5. Bedek de microplaat van licht met aluminiumfolie en incubeer deze gedurende 30 minuten op RT.
  6. Meet de absorptie van monsters bij 660 nm in een ELISA-platenspectrometer (zie Materiaaltabel).
    OPMERKING: Kleur kan worden gemeten bij golflengten tussen 650 nm en 750 nm.
  7. Gemiddelde de absorptiewaarde van 660 nm van de standaard blanco monsters en trek deze af van andere 660 nm-waarden van standaard en onbekende monsters.
    1. Meet de absorptie met een ELISA-platenspectrometer in een eindpuntmodus met weinig schudden gedurende 10 s.
  8. Gebruik de standaardcurve om de eiwitconcentratie van elk onbekend monster te bepalen.
  9. Bepaal voor de berekening van eiwitten de concentratie uit een lineale regressiegrafiek met behulp van de absorptiewaarden op de Y-as tegen de concentraties in mg / ml op de X-as van elke standaard BSA-curve.
    1. Verkrijg de vergelijking van lineaire regressie en r-waarde om de eiwitconcentratie te berekenen.
      OPMERKING: De resultaten worden uitgedrukt als genormaliseerde relatieve concentratiewaarden van het totale eiwit ten opzichte van mg AM (μg/ml eiwit/mg AM-weefsel).

3. Kwantificering van Lumican in AME

OPMERKING: De concentratie lumican moet worden gemeten in de AME die is opgeslagen onder verschillende opslagomstandigheden en tijdsperioden. Kwantificeer lumican met behulp van sandwich ELISA en volg de instructies van de fabrikant. Het wordt aanbevolen om alle normen en monsters in tweevoud te testen.

  1. Verdun het humaan lumicanvangstantilichaam (zie Materiaaltabel) tot de gebruikte concentratie in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
    OPMERKING: De injectieflacon met het opvangantilichaam bevat 120 μg antilichaam. Verdun na reconstitutie met 0,5 ml PBS het opvangantilichaam met een werkoplossing van 2 μg/ml.
    1. Pipetteer onmiddellijk 100 μL per putje van het verdunde opvangantilichaam naar een 96-well microplaat. Sluit het bord om en incubeer het een nacht bij RT.
  2. Adem elke put op en was deze door te pipetteren met 300 μL wasbuffer: 0,05% polyoxyethyleensorbitaanmonolauraat 20 in PBS, pH 7,2-7,4 (zie Materiaaltabel) met behulp van een meerkanaals pipettor. Herhaal dit drie keer.
    OPMERKING: Verwijder na de laatste wasbeurt de resterende wasbuffer door het bord te ringen en tik het voorzichtig tegen papieren handdoeken.
  3. Blok platen door toevoeging van 300 μL reagensverdunningsmiddel: 1% BSA in PBS, pH 7,2-7,4, 0,2 μm gefilterd (zie Materiaaltabel) aan elk putje. Incubeer bij RT gedurende 1 uur.
  4. Herhaal stap 2.
  5. Bereid een standaardcurve voor in een 96-well microplaat met behulp van tweevoudige seriële verdunningen van 0-8.000 pg / ml voor eindconcentraties van 125, 250, 500, 1.000, 2.000, 4.000 en 8.000 pg / ml. De ELISA lumican kit bevat een recombinante lumican standaard van 75 ng (zie Materiaaltabel).
  6. Voeg 100 μL monsters toe en de standaardcurve in de met vangstantilichaam gecoate 96-well microplaat.
  7. Bedek de microplaat en incubeer gedurende 2 uur op RT met lage roering in een compacte rocker die de snelheid tussen 2-3 tpm handhaaft.
  8. Herhaal stap 2.
  9. Voeg 100 μL van het antilichaam met biotinyleringsdetectie (zie materiaaltabel) toe aan elk putje. Bedek van licht en incubeer 2 uur bij RT met lage agitatie in een compacte rocker die de snelheid tussen 2-3 tpm handhaaft.
    OPMERKING: De injectieflacon met biotinyleerd detectieantilichaam bevat 24 μg antilichaam. Verdun na reconstitutie met 1,0 ml reagensverdunningsmiddel het antilichaam met biotinyldetectie met een werkoplossing van 400 ng/ml.
  10. Herhaal stap 2.
  11. Voeg 100 μL van de werkverdunning van streptavidin-mierikswortelperoxidase (HRP, zie Materiaaltabel) toe aan elk putje. Bedek de microplaat van licht en incubeer gedurende 20 minuten op RT.
    OPMERKING: De reactieve streptavidin-HRP was 40-voudig geconcentreerd. De werkoplossing 1x streptavidin- HRP is gemaakt met reagensverdunningsmiddel.
    OPMERKING: Plaats de plaat niet in direct licht.
  12. Herhaal stap 2.
  13. Voeg ten slotte 100 μL substraat tetramethylbenzidine (TMB, zie Materiaaltabel) oplossing toe aan elke put.
    OPMERKING: Bereid de TMB-oplossing met een gelijk volume gestabiliseerde waterstofperoxide 30% -oplossing in de kit.
    OPMERKING: Bereid de oplossing onmiddellijk voor gebruik en houd deze op kamertemperatuur.
  14. Incubeer gedurende 30 minuten bij RT op een donkere plaats.
    OPMERKING: Plaats de plaat niet in direct licht. Giet de TMB-oplossing niet aan, omdat er geen verdere wasbeurt nodig is.
  15. Voeg 50 μL 1N H2SO4 stop oplossing toe om de colorimetrische reactie te stoppen. Tik zachtjes op de plaat om een grondige menging te garanderen.
  16. Bepaal onmiddellijk de absorptie van elke put met behulp van een microplaatlezer ingesteld op 450 nm in een ELISA-platenspectrometer.
  17. Meet de absorptie met een ELISA-platenspectrometer in een eindpuntmodus met weinig schudden gedurende 10 s.
  18. Gemiddelde de absorptiewaarde van 450 nm van de standaard blanco monsters en trek deze af van andere 450 nm-waarden van standaard en onbekende monsters.
  19. Gebruik de standaardcurve om de lumicanconcentratie van elk onbekend monster te bepalen.
  20. Maak voor de berekening van de lumicanconcentratie een lineale regressiegrafiek met behulp van de absorptiewaarden op de Y-as tegen de concentraties in pg/ml op de X-as van elke standaard lumicancurve.
    1. Verkrijg de vergelijking van lineaire regressie en r-waarde om de lumicanconcentratie te berekenen.
      OPMERKING: De concentratie lumican werd genormaliseerd met betrekking tot de mg geëxtraheerd weefsel. De resultaten worden uitgedrukt als genormaliseerde relatieve concentratiewaarden van lumican tot mg AM (ng/ml lumican/mg AM-weefsel).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De resultaten worden gerapporteerd als de gemiddelde waarde ± standaarddeviatie (SD). De t-tests van de student en de variantieanalyse (ANOVA) werden uitgevoerd. P-waarden < 0,05 werden als statistisch significant beschouwd. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van statistische software (zie Tabel van materialen).

De totale eiwithoeveelheid in de AME werd beïnvloed door tijd en opslagomstandigheden. De basale eiwitconcentratie was vergelijkbaar bij...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In deze studie werd de aanwezigheid van lumican in de AME geanalyseerd en de directe correlatie met de stabiliteit onder verschillende opslagomstandigheden. Interessant is dat wanneer de totale eiwitconcentratie in AME werd gekwantificeerd, de eiwitconcentratie na opslag toenam. Er zijn aanwijzingen voor drie mechanismen die de eiwitconcentratie in bevroren opslag kunnen veranderen: koude denaturatie, de bevroren concentratie van opgeloste stoffen en door ijs geïnduceerde gedeeltelijke ontplooiing van eiwitstructuur

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De studie werd gefinancierd door het ondersteuningsprogramma voor onderzoeks- en technologische innovatieprojecten van de Universidad Nacional Autonoma de Mexico (grant no. PAPIIT IN203821) en het ministerie van Onderwijs, Wetenschap, Technologie en Innovatie (grant nr. SECTEI 250/2019).

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 N H2SO4 stop solutionR&D SystemsDY994
100 μL micropipetteEppendorf
1000 μL micropipetteEppendorf
15 mm Petri dishSymlaboratorios
18 G Needle (1.2 mm x 40 mm)BD Becton Dickinson 305211
2 mL microcentrifuge tubeEppendorfZ606340
20 mL plastic syringe BD Becton Dickinson 302562
20 μL micropipetteEppendorf
20-200 μL micropipetteEppendorf
5 mL microcentrifuge tubeEppendorf30119401
96-well microplateSARSTEDT821581
Aluminum foilN/AN/A
Amniotic membraneInstituto de Oftalmologia Conde de Valenciana Amnion Bank100 mg
Balanced salt solutionBausch + LombBSS-403802
BeakerN/AN/A
BioRender BioRenderfigures design 
Compact RockerBioRad970822DDMod. 5202SD-BIO
complete, EDTA-free, Protease inhibitor
cocktail tablets		Roche11 873 580 001Protease Inhibitor
Daiggner vortex Genie 2A.Daigger & Co., INC22220A
Dispase IIGibco17105-041
ELISA plate spectrometerThermo Labsystems 35401106Multiscan
Freezer
GraphPad Prism GraphPad Software, Incversion 9statistical analysis and graphic program 
Human lumican DuoSet ELISA kitR&D SystemsDY2846-05includes human Lumican capture antibody
Incubator Forma Scientific 3326 S/N 36481-7002
Inverted light MicroscopeOlympus 6A13921to confirm de-epithelialization  Mod.CK2
Laminar flow hoodForma Scientific 14753-567Mod.1184
Liquid nitrogenN/AN/A
MortarN/AN/A
Multi-channel pipettorEppendorf
Nitrogen TankThermo ScientificMod. Biocan 20
Paper towelsN/AN/A
Phosphate-buffered salineR&D SystemsDY006
Pierce Modified Lowry Protein Assay KitThermo Scientific23240
Plate sealersR&D SystemsDY992
Reagent diluentR&D SystemsDY9951% BSA in PBS, pH 7.2-7.4, 0.2 μm filtered
Refrigerated centrifugecenturion scientific Ltd 15877Mod. K2015R
Rubber policeman cell scraperNEST710001for mechanical de-epithelialization
Scalpel knifeBraunBB521No. 10 or 21
Streptavidin-HRP 40-fold concentrated R&D Systemspart 893975
Substrate tetramethylbenzidine (TMB) solutionR&D SystemsDY999
Toothed tweezersInvent Germany6binox 
Ultrapure waterPISA
Wash bufferR&D SystemsWA1260.05% Tween 20 in PBS, pH 7.2-7.4

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jirsova, K., Jones, G. Amniotic membrane in ophthalmology: properties, preparation, storage and indications for grafting-a review. Cell and Tissue Banking. 18 (2), 193-204 (2017).
  2. Witherel, C., Yu, T., Concannon, M., Dampier, W., Spiller, K. Immunomodulatory effects of human cryopreserved viable amniotic membrane in a pro-inflammatory environment in vitro. Cellular and Molecular Bioengineering. 10 (5), 451-462 (2017).
  3. Ruiz-Cañada, C., et al. Amniotic membrane stimulates cell migration by modulating transforming growth factor-β signalling. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 808-820 (2017).
  4. Yeh, L., et al. Soluble lumican glycoprotein purified from human amniotic membrane promotes corneal epithelial wound healing. Investigative Opthalmology & Visual Science. 46 (2), 479(2005).
  5. Navas, A., et al. Anti-Inflammatory and anti-fibrotic effects of human amniotic membrane mesenchymal stem cells and their potential in corneal repair. Stem Cells Translational Medicine. 7 (12), 906-917 (2018).
  6. Magaña-Guerrero, F., Domínguez-López, A., Martínez-Aboytes, P., Buentello-Volante, B., Garfias, Y. Human amniotic membrane mesenchymal stem cells inhibit neutrophil extracellular traps through TSG-6. Scientific Reports. 7, 12426(2017).
  7. Garfias, Y., Zaga-Clavellina, V., Vadillo-Ortega, F., Osorio, M., Jimenez-Martinez, M. Amniotic membrane is an immunosuppressor of peripheral blood mononuclear cells. Immunological Investigations. 40 (2), 183-196 (2010).
  8. Koob, T., et al. Biological properties of dehydrated human amnion/chorion composite graft: implications for chronic wound healing. International Wound Journal. 10 (5), 493-500 (2013).
  9. Miyagi, H., Thomasy, S., Russell, P., Murphy, C. The role of hepatocyte growth factor in corneal wound healing. Experimental Eye Research. 166, 49-55 (2018).
  10. Chen, S., Mienaltowski, M., Birk, D. Regulation of corneal stroma extracellular matrix assembly. Experimental Eye Research. 133, 69-80 (2015).
  11. Karamanou, K., Perrot, G., Maquart, F., Brézillon, S. Lumican as a multivalent effector in wound healing. Advanced Drug Delivery Reviews. 129, 344-351 (2018).
  12. Theocharis, A., et al. Cell-matrix interactions: focus on proteoglycan-proteinase interplay and pharmacological targeting in cancer. FEBS Journal. 281 (22), 5023-5042 (2014).
  13. Saika, S., et al. Role of lumican in the corneal epithelium during wound healing. Journal of Biological Chemistry. 275 (4), 2607-2612 (2000).
  14. Domínguez-López, A., et al. Amniotic membrane conditioned medium (AMCM) reduces inflammatory response on human limbal myofibroblast, and the potential role of lumican. Molecular Vision. 27, 370-383 (2021).
  15. Vij, N., Roberts, L., Joyce, S., Chakravarti, S. Lumican regulates corneal inflammatory responses by modulating Fas-Fas Ligand signaling. Investigative Opthalmology & Visual Science. 46 (1), 88(2005).
  16. Mahbod, M., et al. Amniotic membrane extract preparation: What is the best method. Journal of Ophthalmic and Vision Research. 9 (3), 314-319 (2014).
  17. Chávez-García, C., et al. Ophthalmic indications of amniotic membrane transplantation in Mexico: an eight years Amniotic Membrane Bank experience. Cell and Tissue Banking. 17 (2), 261-268 (2015).
  18. Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. Dispase, a neutral protease from Bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase. Journal of Investigative Dermatology. 93 (2), 287-290 (1989).
  19. Bhatnagar, B. S., Bogner, R. H., Pikal, M. J. Protein stability during freezing: separation of stresses and mechanisms of protein stabilization. Pharmaceutical Development and Technology. 12 (5), 505-523 (2007).
  20. McClain, A. K., McCarrel, T. M. The effect of four different freezing conditions and time in frozen storage on the concentration of commonly measured growth factors and enzymes in equine platelet-rich plasma over six months. BMC Veterinary Research. 15 (1), 292(2019).
  21. Tamhane, A., et al. Evaluation of amniotic membrane transplantation as an adjunct to medical therapy as compared with medical therapy alone in acute ocular burns. Ophthalmology. 112 (11), 1963-1969 (2005).
  22. Shtein, R., et al. Autologous serum-based eye drops for treatment of ocular surface disease. Ophthalmology. 127 (1), 128-133 (2020).
  23. Shahriari, H., Tokhmehchi, F., Reza, M., Hashemi, N. Comparison of the effect of amniotic membrane suspension and autologous serum on alkaline corneal epithelial wound healing in the rabbit model. Cornea. 27 (10), 1148-1150 (2008).
  24. Schuerch, K., Baeriswyl, A., Frueh, B., Tappeiner, C. Efficacy of amniotic membrane transplantation for the treatment of corneal ulcers. Cornea. 39 (4), 479-483 (2019).
  25. Chen, H., et al. Amniotic membrane transplantation for persistent corneal ulcers and perforations in acute fungal keratitis. Cornea. 25 (5), 564-572 (2006).
  26. Guo, Q., et al. A comparison of the effectiveness between amniotic membrane homogenate and transplanted amniotic membrane in healing corneal damage in a rabbit model. Acta Ophthalmologica. 89 (4), 315-319 (2011).
  27. Sabater, A., Perez, V. Amniotic membrane use for management of corneal limbal stem cell deficiency. Current Opinion in Ophthalmology. 28 (4), 363-369 (2017).
  28. Ahmad, T., et al. Autolysis of bovine skin, its endogenous proteases, protease inhibitors and their effects on quality characteristics of extracted gelatin. Food Chemistry. 265, 1-8 (2018).
  29. Mullegama, S. V., et al. Nucleic acid extraction from human biological samples. Methods in Molecular Biology. 1897, 359-383 (2019).
  30. Skog, M., et al. The effect of enzymatic digestion on cultured epithelial autografts. Cell Transplantation. 28 (5), 638-644 (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Prote ne extractiecorneale epithelialisatiemechanische de epithelialisatieprotease remmersinvriezen met vloeibare stikstofcentrifugatietechniekamnioonmembraanextract

Gerelateerde artikelen