Deze studie beschrijft een techniek om een silicose-rattenmodel op te stellen met de inademing van silica door het hele lichaam in een inhalatiekamer. De ratten met silicose konden het pathologische proces van menselijke silicose op een gemakkelijke, kosteneffectieve manier met een goede herhaalbaarheid nauwkeurig nabootsen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Het opzetten van een silicose-rattenmodel via blootstelling van het hele lichaam aan respirabel silica
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De belangrijkste oorzaak van silicose is het inademen van silica in de werkomgeving. Ondanks enkele anatomische en fysiologische verschillen blijven knaagdiermodellen een essentieel hulpmiddel voor het bestuderen van menselijke silicose. Voor silicose moet het klassieke pathologische proces induceerbaar zijn via het inademen van vers gegenereerde kwartsdeeltjes, wat betekent dat het specifiek induceren van beroepsziekten bij de mens betekent. Deze studie beschreef een techniek om het pathologische dynamische evolutieproces van silicose vast te stellen en effectief na te bootsen. Verder had de techniek een goede herhaalbaarheid zonder dat er een operatie aan te pas kwam. Het inhalatieblootstellingssysteem werd gefabriceerd, gevalideerd en gebruikt voor toxicologisch onderzoek naar inademing van inadembare deeltjes. De kritische componenten waren als volgt: (1) bulkgenerator voor droog SiO2-poeder , afgesteld met een luchtstroomregelaar; (2) 0,3m3 blootstellingskamer voor inademing van het hele lichaam, geschikt voor maximaal 3 volwassen ratten; (3) een monitoring- en controlesysteem voor het in realtime regelen van zuurstofconcentratie, temperatuur, vochtigheid en druk; en (4) een barrière- en afvalverwijderingssysteem ter bescherming van laboranten en het milieu. Samenvattend rapporteert het huidige protocol de inademing via het hele lichaam, en de inhalatiekamer creëerde een betrouwbaar, redelijk en herhaalbaar silicotisch model voor ratten met een lage mortaliteit, minder letsel en meer bescherming.
Inleiding
Silicose, die wordt veroorzaakt door het inademen van silica, is de ernstigste beroepsziekte in China, goed voor meer dan 80% van het totale aantal meldingen van beroepsziekten perjaar1. De etiologie van silicose is duidelijk en kan worden voorkomen en gecontroleerd, maar er is geen effectieve behandelingsmethode beschikbaar2. Van veel geneesmiddelen is bewezen dat ze effectief zijn in basisstudies, maar ze hebben onnauwkeurige klinische effecten 3,4. Daarom moeten de pathologische en fysiologische mechanismen van silicose nog worden onderzocht.
Veel studies hebben een eenmalige infusie van silica in de luchtpijp van ratten of muizen gebruikt om de pathogenese van silicose 5,6 te onderzoeken. Hoewel deze silicotische modellen voor knaagdieren in korte tijd konden worden verkregen7, hadden deze methoden nog steeds uitdagingen, zoals diertrauma's en hoge sterfte. Sommige onderzoeken hebben betrekking op het indruppelen van opgeslagen silica in de longen om een niet-specifieke longreactie op te wekken, maar maakten geen melding van silicotische knobbeltjes bij muizen8. Bovendien, afgezien van acute silicose, veroorzaakte chronische blootstelling aan silica in werkomgevingen een aanzienlijk lagere longontsteking en verhoogde het de niveaus van anti-apoptotische markers, in plaats van pro-apoptotische markers, in de longen9. Daarom is een betrouwbaar, redelijk en herhaalbaar diermodel nodig om de pathogenese van silicose verder te onderzoeken.
De huidige studie beschrijft een methode om het ziekteproces van patiënten met silicose na te bootsen door silica-inhalatie via het hele lichaam, door lucht geleverde deeltjes in een inhalatiekamer, die bestond uit een door lucht geleverde silicagenerator, een kamer voor het hele lichaam en een afvalverwijderingssysteem. Deze methode is eenvoudig, gemakkelijk te bedienen en bootst effectief het pathologische dynamische evolutieproces van silicose na. Ook worden veel mogelijke mechanismen en de pathogenese van silicose geïdentificeerd met behulp van deze methode 10,11,12. Het voorgestelde protocol zal naar verwachting helpen bij verder onderzoek op het verwante gebied van silicose-onderzoek.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierproeven zijn uitgevoerd volgens de National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals van de Verenigde Staten en goedgekeurd door het Committee on the Ethics van de North China University of Science and Technology (protocolcode LX2019033 en 2019-3-3 van goedkeuring). Voor het huidige onderzoek werden mannelijke Wistar-ratten van 3 weken oud gebruikt. Alle ratten werden gehouden in statische kooien met houtkrullen. De dieren werden gehouden in een licht/donkercyclus van 12 uur en 12 uur en werden ad libitum voorzien van voedsel en water. Vervolgexperimenten werden uitgevoerd na 1 week adaptief voeren.
1. Voorbereiding van dieren
- Huisvest bij aankomst alle ratten in een specifieke pathogeenvrije (SPF) kamer.
- Verdeel de gezonde ratten willekeurig in twee groepen (n = 10): controleratten die zuivere lucht inademen en ratten met silicose die silica inademen.
2. Silica bereiding
LET OP: Silicastof dat door het menselijk lichaam wordt ingeademd, kan de longen beschadigen. Daarom moeten individuen tijdens operaties overalls, medische handschoenen en beschermende maskers (N95) dragen.
- Maal de silicadeeltjes (zie Materiaaltabel) gedurende 1,5 uur voor elke blootstelling met een agaatmortel. Dit komt omdat vers gebroken kwarts grotere hoeveelheden actieve zuurstofsoorten produceert dan verouderd kwarts13, en silica met een diameter van 1-5 μm is het meest pathogeen .
- Weeg het silica (30 g) na het malen af met behulp van een elektronische balans, plaats het in een glazen bak en bak het gedurende 6 uur op 180 °C in een elektrische verwarmingsdroger (zie Materiaaltabel) om ziekteverwekkers van het oppervlak van de silicadeeltjes te verwijderen.
3. Blootstelling aan silica bij de ratten
- Sluit de injectie en de in de handel verkrijgbare generatorsystemen aan (zie Materiaaltabel) en plaats het silica (30 g) in de generator. Controleer of de verbindingsleiding normaal is, het netsnoer is aangesloten en de stroomvoorziening normaal is.
- Controleer het waterpeil van de sproeitoren en de luchtbevochtiger van het rookgasbehandelingsapparaat (zie Materiaaltabel) handmatig en voeg water toe als het onvoldoende is (niet tot aan de standaardlijn).
- Voeg leidingwater toe aan de sproeitoren van het rookgasbehandelingsapparaat en gedestilleerd water aan de luchtbevochtiger (Figuur 1).
- Schakel de uitlaatgasafvoerinrichting (zie Materiaaltabel) en de luchtbronschakelaar in om te controleren of de binnenkant van de afschermingskast zich in een onderdruktoestand bevindt.
- Controleer of de vloeistofmenging, poedermenging, regelkleppen voor de zuivere gasstroom en de afvoerklep voor afvalwater onder de inhalatiekamer gesloten zijn.
- Plaats in totaal 10 ratten in de inhalatiekamer (zie Materiaaltabel) en sluit het inhalatiecompartiment en de afgeschermde kastdeuren.
- Stel de volgende experimentele parameters in op het instrumentenpaneel of in de computer: kastdruk: -50 tot -30 Pa; zuurstofconcentratie: 21%; kasttemperatuur: 26-30 °C; vochtigheid: 30%-70%; stofopname: 2,0-2,5 ml/min; en stofconcentratie in de kast: 60 ± 5 mg/m3.
NOTITIE: Observeer de experimentele gegevens en de status van de apparatuur continu tijdens het experiment. Het alarm voor uitval van apparatuur leidde tot tijdige verwerking.- Stel elk dier continu bloot aan silica gedurende 3 uur per dag, 5 dagen per week, en laat de dieren in de controlegroep zuivere lucht inademen.
- Sluit na voltooiing van het experiment de regelklep voor de gemengde gasstroom en open de stroomklep voor zuiver gas. Injecteer het zuivere gas continu in de inhalatiekamer.
OPMERKING: In de huidige studie werd de zuivere gasstroom (7,0-7,5 m3/h) gedurende ten minste 20 minuten geïnjecteerd totdat het giftige gas in de inhalatiekamer volledig was vervangen.- Sluit de pure luchtstroomklep, open de deur, haal de ratten eruit en stuur ze terug naar de pathogeenvrije kamer.
- Verwijder het rattenrek en de onderdelen van de aftakleiding achtereenvolgens en plaats ze in de gootsteen om ze schoon te maken. Sluit na het spoelen de automatische reinigingsklep en open het luik.
- Veeg de binnenwand schoon met een schone doek of zet het zuivere gas aan om de tank te drogen. Voer ten slotte de desinfectie uit. Sluit na het reinigen en desinfecteren met 75% ethanol de uitlaatklep en zet zo snel mogelijk de deur van de inhalatiecabine op een kier om het vocht te verdampen, zodat de binnenkant van de inhalatiecabine droog blijft.
- Controleer de silicaconcentratie in de kast met een uitgebreide atmosferische monsternemer volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel) twee keer per week om de stabiliteit van de silicaconcentratie tijdens het experiment te garanderen. Kalibreer de atmosferische sampler voordat u de bemonstering uitvoert.
- Gebruik een digitale analytische balans met één pan voor gravimetrische bepaling. De berekende silicaconcentratie bedroeg 65 mg/m3 (figuur 1 en tabel 1).
NOTITIE: Weeg het filtreerpapier voor en na de absorptie van silica. De concentratie silica werd berekend met behulp van de volgende formule12:
waarbij W2 = gewicht van het filtreerpapier na bemonstering, W1 = gewicht van het filtreerpapier vóór bemonstering en V = volume van de lucht.
- Gebruik een digitale analytische balans met één pan voor gravimetrische bepaling. De berekende silicaconcentratie bedroeg 65 mg/m3 (figuur 1 en tabel 1).
4. Verwerving en fixatie van longweefsel
- Euthanaseer de ratten door intraperitoneale injectie van pentobarbital (100 mg/kg lichaamsgewicht) en lidocaïne (4 mg/kg lichaamsgewicht). Beoordeel de dood door het verlies van hartslag14.
- Fixeer aan het einde van het experiment de rechter onderste long, nier, lever, milt en bot gedurende ten minste 24 uur met 4% paraformaldehyde, ingebed in paraffine en snijd in sectiesvan 5 μm 7,15.
5. Hematoxyline en eosine (H&E) kleuring
- Deparaffiniseer de paraffinesecties in xylol (zie materiaaltabel) tweemaal gedurende 10 minuten elke16 minuten en rehydrateer in 100% ethanol, 95% ethanol, 90% ethanol, 80% ethanol, 70% ethanol en gedestilleerd water gedurende elk 3 minuten.
- Kleur de secties gedurende 5 minuten met hematoxyline (zie Materiaaltabel) en was de secties vervolgens met water10.
- Plaats de secties in 2% zoutzuur en vervolgens in gedestilleerd water tot de kleur blauw wordt.
- Kleur de secties gedurende 1 minuut met eosine, dehydrateer ze met 95% ethanol, maak ze transparant met xyleen, sluit ze af met neutrale gom en observeer ze onder een lichtmicroscoop12.
6. Immunohistochemische kleuring
- Was de paraffinesecties regelmatig met water.
- Stel de antigenen bloot aan hoge druk (60 kPa) en hoge temperatuur (100 °C) gedurende 80 s en blokkeer vervolgens gedurende 15 minuten met een endogene peroxidaseblokker (3%) om de endogene peroxidasen te elimineren7.
- Incubeer de monsters met antilichamen gericht tegen CD68 (1:200 verdunning - voeg 4 μL CD68 toe aan 396 μL antilichaamverdunningsmiddel; zie Materiaaltabel) bij 4 °C gedurende een nacht.
- Incubeer de monsters met een secundair antilichaam (HRP-geconjugeerd geiten anti-muis IgG-polymeer; zie Tabel met materialen) bij 37 °C gedurende 30 minuten en was de monsters vervolgens met 1x PBS.
- Visualiseer de immunoreactiviteit met 3,3-diaminobenzidine (DAB; zie Materiaaltabel). Nadat u DAB op het weefsel hebt aangebracht, observeert u de kleuring van het weefsel onder een lichtmicroscoop10.
OPMERKING: De kleuringstijd varieerde van enkele seconden tot enkele minuten, afhankelijk van de kleuringstijd van het weefsel. De kleuringsprocedure werd afgebroken door de secties in water te plaatsen. In deze studie vertegenwoordigde de bruine kleuring van het weefsel de positieve expressie van CD68. Alle antilichamen werden verdund in 1x PBS.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Met behulp van de voorgestelde methode werden enkele mogelijke mechanismen en de pathogenese van silicose bij ratten onderzocht. Het schema van de inhalatiekamer is weergegeven in figuur 1. De kamer bestond uit een door lucht geleverde silicagenerator, een kamer voor het hele lichaam en een afvalverwijderingssysteem, zoals eerder beschreven17. De longfuncties, niveaus van ontstekingsfactoren in het serum en de longen, collageenafzetting en myofibroblastdifferentiatie ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Als belangrijkste oorzaak van silicose speelt silica een doorslaggevende rol bij het vormen. De silicadeeltjes die door patiënten met pneumoconiose worden ingeademd, zijn verse, vrije silicadeeltjes die worden geproduceerd door mechanisch snijden. Silica kan reactieve zuurstofsoorten genereren, hetzij direct op vers gespleten deeltjesoppervlakken of indirect door zijn effect op de macrofagen25. Daarom is het malen van silicadeeltjes van groot belang. In het voorgestelde protocol werd silica gedure...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gefinancierd door de National Natural Science Foundation of China (82003406), de Natural Science Foundation van de provincie Hebei (H2022209073) en het Science and Technology Project van het Hebei Education Department (ZD2022127).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Luchtdetector (compressieve atmosferische sampler) | Qingdao Xuyu Environmental Protection Technology Co. LTD | ||
| Anatomische tafel | Geen specifiek merk wordt aanbevolen. | ||
| Antilichaam van CD68 | Abcam | ab201340 | |
| DAB | ZSGB-BIO | ZLI-9018 | |
| Elektrisch verwarmde luchtblazende droger | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD | ||
| Elektronische balans | OHRUS | ||
| Inbeddingsmachine | leica | ||
| Uitlaatgasafvoerapparaat | HOPE Industry and Trade Co. Ltd. | ||
| Generatorsystemen | HOPE Industry and Trade Co. Ltd. | ||
| Handschoenen (dunne laboratoriumhandschoenen) | The secco medical | ||
| Hematoxyline en eosina | BaSO Diagnostics Inc. | BA4025 | |
| HOPE MED 8050 blootstellingscontroleapparaat | HOPE Industry and Trade Co. Ltd. | ||
| Inhalatiekamer | HOPE Industry and Trade Co. Ltd. | ||
| Injectiespuit | Geen specifiek merk wordt aanbevolen. | ||
| Lichtmicroscoop | olympus | ||
| Objectglaasje | shitai | ||
| PV-6000 (HRP-geconjugeerd geitenanti-muis IgG-polymeer) | Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co. Ltd | s5631 | |
| Siliciumdioxide | Sigma-Aldrich | ||
| Snijmolen | leica | RM2255 | |
| Afvalgasbehandelingsapparaat | HOPE Industry and Trade Co. Ltd. | ||
| Natte doos | Cooperative plastic Products Factory | ||
| Xylol | Tianjin Yongda Chemical Reagent Co., LTD |
Referenties
- Li, J., et al. The burden of pneumoconiosis in China: an analysis from the Global Burden of Disease Study. BMC Public Health. 22 (1), 1114(2019).
- The Lancet Respiratory Medicine. The world is failing on silicosis. The Lancet. Respiratory Medicine. 7 (4), 283(2019).
- Li, T., Yang, X., Xu, H., Liu, H. Early identification, accurate diagnosis, and treatment of silicosis. Canadian Respiratory Journal. 3769134, (2022).
- Adamcakova, J., Mokra, D. New insights into pathomechanisms and treatment possibilities for lung silicosis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), 4162(2021).
- Li, Y., et al. Thalidomide alleviates pulmonary fibrosis induced by silica in mice by inhibiting ER stress and the TLR4-NF-κB pathway. International Journal of Molecular Sciences. 23 (10), 5656(2022).
- Zhang, E., et al. Exosomes derived from bone marrow mesenchymal stem cells reverse epithelial-mesenchymal transition potentially via attenuating Wnt/β-catenin signaling to alleviate silica-induced pulmonary fibrosis. Toxicology Mechanisms and Methods. 31 (9), 655-666 (2021).
- Li, S., et al. N-Acetyl-Seryl-Asparyl-Lysyl-Proline regulates lung renin angiotensin system to inhibit epithelial-mesenchymal transition in silicotic mice. Toxicology and Applied Pharmacology. 408, 408(2020).
- Walters, E. H., Shukla, S. D. Silicosis: Pathogenesis and utility of animal models of disease. Allergy. 76 (10), 3241-3242 (2021).
- Langley, R. J., Mishra, N. C., Peña-Philippides, J. C., Hutt, J. A., Sopori, M. L. Granuloma formation induced by low-dose chronic silica inhalation is associated with an anti-apoptotic response in Lewis rats. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A. 73 (10), 669-683 (2010).
- Jin, F., et al. Ac-SDKP Attenuates activation of lung macrophages and bone osteoclasts in rats exposed to silica by inhibition of TLR4 and RANKL signaling pathways. Journal of Inflammation Research. 14, 1647-1660 (2021).
- Xu, H., et al. A new anti-fibrotic target of Ac-SDKP: inhibition of myofibroblast differentiation in rat lung with silicosis. PloS One. 7 (7), e40301(2012).
- Li, S., et al. Ac-SDKP increases α-TAT 1 and promotes the apoptosis in lung fibroblasts and epithelial cells double-stimulated with TGF-β1 and silica. Toxicology and Applied Pharmacology. 369, 17-29 (2019).
- Vallyathan, V., Shi, X. L., Dalal, N. S., Irr, W. Generation of free radicals from freshly fractured silica dust. Potential role in acute silica-induced lung injury. The American Review of Respiratory Disease. 138 (5), 1213-1219 (1988).
- Khoo, S. Y., Lay, B. P. P., Joya, J., et al. Local anesthetic refinement of pentobarbital euthanasia reduces abdominal writhing without affecting immunohistochemical endpoints in rats. Lab Anim. 2018 (52), 152-162 (2018).
- Chooi, K. F., Rajendran, D. B. K., Phang, S. S. G., Toh, H. H. A. The dimethylnitrosamine induced liver fibrosis model in the rat. Journal of Visualized Experiments. 112 (112), (2016).
- Valentin, J., Frobert, A., Ajalbert, G., Cook, S., Giraud, M. -N. Histological quantification of chronic myocardial infarct in rats. Journal of Visualized Experiments. 118 (118), (2016).
- Zhang, H., et al. silicosis decreases bone mineral density in rats. Toxicology and Applied Pharmacology. 348, 117-122 (2018).
- Zhang, B., et al. Targeting the RAS axis alleviates silicotic fibrosis and Ang II-induced myofibroblast differentiation via inhibition of the hedgehog signaling pathway. Toxicology Letters. 313, 30-41 (2019).
- Li, S., et al. Silica perturbs primary cilia and causes myofibroblast differentiation during silicosis by reduction of the KIF3A-repressor GLI3 complex. Theranostics. 10 (4), 1719-1732 (2020).
- Gao, X., et al. Pulmonary silicosis alters microRNA expression in rat lung and miR-411-3p exerts anti-fibrotic effects by inhibiting MRTF-A/SRF signaling. Molecular therapy. Nucleic Acids. 20, 851-865 (2020).
- Cai, W., et al. Differential expression of lncRNAs during silicosis and the role of LOC103691771 in myofibroblast differentiation induced by TGF-β1. Biomedicine & Pharmacotherapy. 125, (2020).
- Cai, W., et al. Transcriptomic analysis identifies upregulation of secreted phosphoprotein 1 in silicotic rats. Experimental and Therapeutic. 21 (6), (2021).
- Li, Y., et al. Minute cellular nodules as early lesions in rats with silica exposure via inhalation. Veterinary Sciences. 9 (6), 251(2022).
- Mao, N., et al. Glycolytic reprogramming in silica-induced lung macrophages and silicosis reversed by Ac-SDKP treatment. International Journal of Molecular Sciences. 22 (18), 10063(2021).
- Hamilton, R. F., Thakur, S. A., Holian, A. Silica binding and toxicity in alveolar macrophages. Free Radical Biology and Medicine. 44 (7), 1246-1258 (2008).
- Park, R., et al. Exposure to crystalline silica, silicosis, and lung disease other than cancer in diatomaceous earth industry workers: a quantitative risk assessment. Occupational and Environmental. 59 (1), 36-43 (2002).
- Honnons, S., Porcher, J. M. In vivo experimental model for silicosis. Journal of Environmental Pathology, Toxicology and. 19 (4), 391-400 (2000).
- Lakatos, H. F., et al. Oropharyngeal aspiration of a silica suspension produces a superior model of silicosis in the mouse when compared to intratracheal instillation. Experimental Lung Research. 32 (5), 181-199 (2006).
- Li, B., et al. A suitable silicosis mouse model was constructed by repeated inhalation of silica dust via nose. Toxicology Letters. 353, 1-12 (2021).
- Hoy, R. F., Chambers, D. C. Silica-related diseases in the modern world. Allergy. 75 (11), 2805-2817 (2020).
- Davis, G. S. Pathogenesis of silicosis: current concepts and hypotheses. Lung. 164 (3), 139-154 (1986).
- Moss, O. R., James, R. A., Asgharian, B. Influence of exhaled air on inhalation exposure delivered through a directed-flow nose-only exposure system. Inhalation Toxicology. 18 (1), 45-51 (2006).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
