Microsampling in gerichte massaspectrometrie-gebaseerde eiwitanalyse van eiwitten met een lage abundantie

Samenvatting

Er wordt een protocol gepresenteerd voor de bepaling van biomarkers met een lage abundantie uit gedroogde serummonsters, geïllustreerd met de biomarker progastrine-releasing peptide (ProGRP). Antilichaam-gecoate magnetische kralen worden gebruikt voor de selectieve reiniging en verrijking van een proteotypisch ProGRP-peptide. Het gevangen peptide wordt vervolgens geanalyseerd met vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie.

Samenvatting

Dit artikel presenteert een protocol met gedetailleerde beschrijvingen voor een efficiënte monsteropruiming van eiwitten met een lage abundantie uit gedroogde monsters. Dit wordt uitgevoerd met behulp van op kralen gebaseerde proteolyse voorafgaand aan proteotypische peptide-affiniteitsvangst en vloeistofchromatografie tandem massaspectrometrie (LC-MS / MS) bepaling. De procedure kan worden toegepast op zowel conventionele gedroogde monsters met behulp van papieren kaarten (bijv. Gedroogde bloedvlekken [DBS'en] en gedroogde serumvlekken [DSS'en]), als monsters die zijn verzameld met nieuwere bemonsteringsmethoden zoals volumetrische absorberende microsampling (VAMS). Naast het beschrijven van deze procedure, wordt de bereiding van zowel trypsinekralen als met antilichamen gecoate kralen in dit werk stap voor stap gepresenteerd. De voordelen van de gepresenteerde procedure zijn tijdefficiënte proteolyse met behulp van kralen en selectieve robuuste reiniging met behulp van peptide affinity-capture. De huidige procedure beschrijft de bepaling van de low-abundance small-cell lung cancer (SCLC) biomarker, progastrine-releasing peptide (ProGRP), in gedroogd serum (zowel DSSs als VAMS). Gedetailleerde procedures voor kralenbereiding maken het eenvoudiger om de workflow in nieuwe toepassingen of andere laboratoria te implementeren. Er is aangetoond dat de resultaten afhankelijk kunnen zijn van het bemonsteringsmateriaal; voor het huidige project werden hogere signaalintensiteiten waargenomen voor monsters die met VAMS werden verzameld in vergelijking met DSS'en.

Inleiding

Microsampling bestaat al meer dan 100 jaar sinds Ivar Bang in 1913 glucosemonitoring van DBSs beschreef¹. Nadat Guthrie en Susi in 1963 DBS'en introduceerden voor de bepaling van fenylalanine bij pasgeborenen², is de techniek steeds wijdverspreider geworden. De eerste rapporten van DBSs voor de bemonstering en opslag van eiwitten werden gemaakt in de vroege jaren 1970^3,4, en een decennium later, in de jaren 1980^, vonden we het eerste rapport van massaspectrometrie (MS) voor de bepaling van eiwitten uit DBSs⁵. Ondanks deze vroege introductie was het pas na de eeuwwisseling dat MS-bepaling van eiwitten uit DBS'en en andere microsamplingtechnieken wijdverspreider werd.

In een klinische context is het van belang om eiwitten te bepalen bij de diagnose en follow-up van ziekten, evenals voor behandelingsmonitoring en dopingdoeleinden. Deze gerichte bepaling van eiwitanalyten door MS uit kleine hoeveelheden gedroogde monsters is nog steeds een uitdaging en vereist vaak een uitgebreide monstervoorbereiding voorafgaand aan de analyse.

Gerichte kwantitatieve bepaling van eiwitten door MS wordt gewoonlijk uitgevoerd door de bottom-up benadering toe te passen, waarbij de eiwitten voorafgaand aan de analyse worden verteerd tot peptiden. Deze procedure produceert een groot aantal peptiden, wat directe analyse van het verteerde biologische monster uitdagend maakt. Een manier om dit te omzeilen is door voorafgaand aan de MS-analyse een selectieve affiniteitsopruimingsstap toe te passen^voor of na de vertering ^6,7,8. Op deze manier wordt het eiwit van belang (of zijn proteotypische peptide, als de affiniteitsopnamestap wordt uitgevoerd na de vertering) selectief geïsoleerd uit de monstermatrix voorafgaand aan de analyse, wat lagere detectielimieten^{oplevert 9}.

Microsampling met behulp van DBS-kaarten heeft bepaalde voordelen in vergelijking met conventionele bloedmonsters, waaronder een laag monstervolume, minder invasieve bemonstering en verhoogde opslagstabiliteit. De monstermatrix is echter anders en kan andere uitdagingen in de analyse introduceren (bijv. gedroogde versus vloeibare monstermatrix en capillair bloed versus serum of plasma)^10,11. Een andere uitdaging die wordt waargenomen met DBSs is het zogenaamde hematocrieteffect, waarbij de bloedhematocriet het monstervolume beïnvloedt dat verder wordt verwerkt voor analyse, en dus interindividuele variabiliteit in de analyse introduceert¹². Nieuwere microsampling-eenheden, zoals VAMS geïntroduceerd in 2014¹³, pakken dit probleem aan door een vast volume bloed te verzamelen in plaats van een bloeddruppel.

Dit protocol beschrijft een opstelling voor de analyse van biomarkers met een lage abundantie uit gedroogde microsamples. Na elutie wordt het gedroogde monster verteerd en vervolgens wordt het proteotypische peptide geïsoleerd door peptideaffiniteitsvangst. De modelanalyt is de SCLC-biomarker ProGRP. Omdat ProGRP niet betrouwbaar kan worden bepaald uit volbloed, werd serum gebruikt als monstermatrix. Representatieve resultaten van zowel DSS'en als serummonsters verzameld met VAMS worden getoond.

Protocol

Serum van gezonde bloeddonoren werd gebruikt voor de bereiding van standaardoplossingen. Het gebruik van serum van gezonde bloeddonoren werd uitgevoerd in strikte overeenstemming met de Noorse wet. Geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle proefpersonen. Serummonsters werden geanalyseerd met behulp van methoden in overeenstemming met relevante richtlijnen en voorschriften. Het beschreven protocol is een aangepaste versie van de methode beschreven in eerder werk¹⁴. Een overzicht van de samenstelling van buffers en oplossingen en hoe deze te bereiden is te vinden in aanvullende tabel S1, terwijl de tabel met materialen materialen , apparatuur en reagentia bevat die in dit protocol worden gebruikt.

1. Bereiding van met antilichamen gecoate magnetische kralen

1. Bereken de hoeveelheid antilichaam die nodig is om het gewenste aantal kralen te bereiden. Gebruik 1 mg antilichaam per 50 mg magnetische kralen.
   OPMERKING: Doorgaans wordt 20 μL van een kraalsuspensie van 20 mg/ml per monster gebruikt in volgende experimenten (zie stap 5.1).
2. Bereken het antilichaamvolume dat nodig is om het gewenste aantal kralen te bereiden.
   OPMERKING: Het antilichaamvolume is afhankelijk van de antilichaamconcentratie en moet voor elk antilichaam worden berekend.
3. Breng het gewenste volume antilichaamoplossing over in een 5 ml eiwitarme microcentrifugebuis. Als de antilichaamoplossing bijvoorbeeld 1 mg / ml antilichaam bevat, gebruikt u 0, 4 ml om 1, 0 ml kralensuspensie te bereiden (20 mg kralen / ml met 1 mg antilichaam / 50 mg kralen).
   OPMERKING: De antilichamen moeten zich in een aminevrije buffer bevinden. Gebruik eiwitarme microcentrifugebuizen voor alle oplossingen die eiwitten bevatten om analytverlies als gevolg van adsorptie te voorkomen.
4. Voeg een kleine magnetische roerstaaf toe aan de antilichaamoplossing en breng de pH onder continu roeren op 2,5. Gebruik een pH-meter met een micro-elektrode om de pH te meten en pas de pH aan door stapsgewijs gedefinieerde volumes van 1,0 M HCl toe te voegen (begin met het toevoegen van 10 μL-porties van 1,0 M HCl en verminder het volume naarmate de pH 2,5 nadert). Noteer het totale volume van 1,0 M HCl dat nodig is om de pH op 2,5 te zetten.
5. Verwijder de micro-elektrode en incubeer het aangezuurde antilichaam op ijs op een magnetische roerder gedurende 1 uur.
   OPMERKING: Zuurbehandeling van het antilichaam wordt uitgevoerd om de juiste oriëntatie van de antilichamen op de kraal te bevorderen. De concentratie HCl kan worden verlaagd tot 0,5 M of 0,2 M HCl, afhankelijk van de bufferconcentratie in de antilichaamoplossing.
6. Neutraliseer de antilichaamoplossing. Gebruik een pH-meter met een micro-elektrode om de pH te meten en de pH op 7 te zetten door stapsgewijs gedefinieerde volumes van 1,0 M NaOH toe te voegen (begin met een portie van 10 μL en verlaag het volume naarmate de pH 7 nadert). Noteer het totale volume van 1,0 M NaOH toegevoegd.
   OPMERKING: De concentratie NaOH moet gelijk zijn aan de HCl-concentratie die in stap 1.4 wordt gebruikt. NaOH is zeer corrosief; gebruik beschermende uitrusting, waaronder handschoenen en passende oogbescherming.
7. Bereken het gewenste volume van tosyl geactiveerde magnetische kralen die moeten worden gebruikt.
   OPMERKING: Meestal wordt aanbevolen om 20 mg kralen / ml te gebruiken bij het uitvoeren van kleinschalige koppeling. Er moet minimaal 5 mg kralen worden gebruikt.
8. Meng de magnetische kraalsuspensie grondig op een vortexmixer en trek een volume op met de gewenste hoeveelheid kraalsuspensie. Om bijvoorbeeld 1 ml kraalsuspensie te bereiden, zuigt u een volume op dat 20 mg kralen bevat (667 μl als de concentratie van de kralen 30 mg / ml is).
9. Plaats de kralenophanging gedurende 1 minuut op een magnetisch rek en verwijder het supernatant. Was de kralen 2x met een gelijk volume type 1 H₂O (667 μl als een kralenoplossing van 30 mg/ml wordt gebruikt om 1 ml met antilichaamcoating bedekte kralen van 20 mg/ml te bereiden). Meng met behulp van een vortexmixer na elke toevoeging van de wasoplossing en plaats gedurende 1 minuut op het magnetische rek voordat u het supernatant verwijdert.
10. Voeg het volgende toe aan de magnetische kralen: zuurbehandeld antilichaam, 0,5 M boraatbuffer (pH 9,5) (1/5 van het totale volume aangezien de eindconcentratie 0,1 M moet zijn; dit is gelijk aan 0,2 ml om 1 ml kraalsuspensie te bereiden) en koppelingsbuffer voor antilichaamkoppeling (om 1 ml met antilichamen gecoate magnetische kralen te bereiden, moet het volume van de koppelingsbuffer gelijk zijn aan 1 ml - volume van het met zuur behandelde antilichaam - 0,2 ml boraatbuffer). Meng met behulp van een vortexmixer.
    OPMERKING: Het volume van het met zuur behandelde antilichaam is gelijk aan het volume van de antilichaamoplossing (0,4 ml ter bereiding van 1 ml kraalsuspensie met behulp van een antilichaamoplossing van 1 mg / ml) + het volume van 1,0 M HCl dat wordt gebruikt om de pH aan te passen op 2,5 + het volume van 1,0 M NaOH dat wordt gebruikt om de pH op 7 aan te passen).
    OPMERKING: De samenstelling van 0,5 M boraatbuffer (pH 9,5) en koppelingsbuffer voor antilichaamkoppeling is te vinden in aanvullende tabel S1.
11. Roteer 's nachts bij omgevingstemperatuur met behulp van een end-over-end monstermenger, bij voorkeur met wederzijdse rotatie en trillingen.
12. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 239 × g. Plaats de buis gedurende 2 minuten op de magneet en verwijder het supernatant.
13. Was de kralen 2 x 2 uur en eenmaal een nacht door in de opslagbuffer voor antilichaamparels bij omgevingstemperatuur te draaien met behulp van een end-over-end monstermenger. Gebruik hetzelfde volume als het totale volume in stap 1.10. Plaats de buis gedurende 1 minuut op de magneet en verwijder het supernatant tussen elke wasbeurt.
    OPMERKING: De samenstelling van de opslagbuffer voor antilichaamparels is te vinden in aanvullende tabel S1.
14. Bewaar in de gewenste buffer (bijvoorbeeld dezelfde buffer als in stap 1.13) met behulp van de gewenste voorraadconcentratie van kralen (meestal 20 mg / ml). Bewaar in de koelkast.

2. Bereiding van 2 ml trypsine geïmmobiliseerde kralen (20 mg/ml kralen)

1. Voeg 20 ml 1 mM HCl toe aan 2 ml NHS-geactiveerde agarosekralen om de kralen te wassen.
2. Meng en centrifugeer gedurende 5 minuten op 2.655 × g . Verwijder het supernatant.
3. Voeg 20 ml fosfaatbuffer van 0,1 M (pH 7,8) toe. Meng met behulp van een vortexmenger en centrifugeer gedurende 5 minuten op 2.655 × g . Verwijder het supernatant.
   OPMERKING: De samenstelling van 0,1 M fosfaatbuffer (pH 7,8) is te vinden in aanvullende tabel S1.
4. Voeg 2 ml 20 mg/ml trypsine toe (opgelost in koude koppelingsbuffer voor trypsinekoppeling).
   OPMERKING: De samenstelling van de koppelingsbuffer voor trypsinekoppeling is te vinden in aanvullende tabel S1. Bewaar de buffer in de koelkast.
5. Incubeer gedurende 25 minuten bij 22 °C en 1.100 tpm met behulp van een temperatuurgeregelde mixer. Centrifugeer bij 2.655 × g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant.
6. Voeg 2 ml modificatiebuffer toe voor de bereiding van trypsineparels en incubeer gedurende 20 minuten bij 22 °C en 1.100 tpm met behulp van een temperatuurgeregelde mixer. Centrifugeer op 2.655 × g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant.
   OPMERKING: De samenstelling van de modificatiebuffer voor de bereiding van trypsinekralen is te vinden in aanvullende tabel S1. Bewaar de buffer in de koelkast.
7. Voeg 10 ml blokkeringsbuffer toe voor de bereiding van trypsineparels en incubeer gedurende 10 minuten bij 22 °C en 1.100 tpm met behulp van een temperatuurgeregelde mixer. Centrifugeer bij 2.655 × g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant.
   OPMERKING: De samenstelling van de blokkeringsbuffer voor de bereiding van trypsinekralen is te vinden in aanvullende tabel S1. Bewaar de buffer in de koelkast.
8. Voeg 2 ml opslagbuffer toe, meng met een vortexmixer en bewaar in de koelkast tot gebruik.
   OPMERKING: De samenstelling van de opslagbuffer voor trypsinekralen is te vinden in aanvullende tabel S1. Bewaar de buffer in de koelkast.

3. DSS/VAMS-bemonstering en daaropvolgende extractie van gedroogd serum

1. Bereid standaarden voor door het serum met ProGRP (of het eiwit van belang) op het juiste niveau te spuiten. Houd het piekvolume ≤ 1% van het totale volume.
   OPMERKING: Hier werd een stamoplossing van 295 μg/ml ProGRP in water gebruikt voor de bereiding van spiked serumstandaarden.
2. Meng de standaarden op een vortexmixer.
3. Breng 10 μL serum (spiked standards) aan op DBS-kaarten of laat 10 μL serum verzamelen door VAMS (10 μL) volgens de richtlijnen van de fabrikant. Voor DSS moet u ervoor zorgen dat de plek zich binnen de stippelcirkel bevindt.
4. Laat minstens 2 uur aan de lucht drogen bij omgevingstemperatuur.
5. Knip de hele plek uit en breng deze over in een 2 ml eiwitarme microcentrifugebuis of verwijder de VAMS uit de houder en plaats deze in een 2 ml eiwitarme microcentrifugebuis.
6. Voeg 1.000 μL 100 mM ammoniumbicarbonaat (ABC) oplossing toe. Haal het gedroogde serum gedurende 1 uur bij 22 °C uit de spot/VAMS met behulp van een temperatuurgestuurde mixer bij 1.000 tpm.
7. Breng het extract over in een nieuwe 1,5 ml eiwitarme microcentrifugebuis voor tryptische proteolyse.

4. Vertering van DSS/VAMS-extracten

1. Gebruik 30 μL trypsineparels (zoals bereid in rubriek 2) per monster. Breng een volume met trypsineparels voor alle monsters over naar een nieuwe 1,5 ml eiwitarme microcentrifugebuis, centrifugeer gedurende 5 minuten bij 2.655 × g en verwijder het supernatant.
2. Was de trypsinekralen 2x met 1 ml koud 50 mM ABC, voordat u ze opnieuw suspensiëren in hetzelfde volume dat werd uitgemest. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 2.655 × g en verwijder het supernatant tussen de stappen.
3. Voeg 30 μL gewassen trypsinekralen toe aan elk DSS/VAMS-extract om de spijsvertering op gang te brengen.
4. Incubeer gedurende 2 uur bij 37 °C en 1.000 tpm met behulp van een temperatuurgeregelde mixer of iets dergelijks. Centrifugeer gedurende 5 minuten op 2.655 × g en breng het supernatant (geen kralen) over in een nieuwe 2,0 ml eiwitarme microcentrifugebuis.
5. Voeg 25 μL 14 ng/ml interne standaardoplossing (IS) toe die het stabiele isotoop-gelabelde (SIL) peptide ALGNQQPSWDSEDSSNF[K_¹³C₆_¹⁵N₂] in 100 mM ABC-oplossing bevat.

5. Vangst van proteotypisch ProGRP-peptide met behulp van antilichaam-gecoate magnetische kralen

1. Gebruik 20 μL antilichaam gecoate kralen (20 mg/ml zoals bereid in rubriek 1) per extractie. Breng alle antilichaam-gecoate kralen over naar een nieuwe 1,5 ml eiwitarme microcentrifugebuis, plaats deze gedurende 1 minuut op de magneet en verwijder de opslagbuffer.
2. Was de magnetische antilichaam-gecoate kralen met 1 ml fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7,4, met 0,05% polysorbaat 20, en 2 x 1 ml PBS voordat u resuspendeert in hetzelfde volume dat werd uitgestoten. Meng op een vortexmixer en plaats 1 minuut op de magneet tussen de bufferwissels.
   OPMERKING: PBS bevat 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na 2 HPO 4 en 1,8 mM KH₂PO₄. Het wordt aanbevolen om de oplossing in een concentratie van 10x te bereiden voor verhoogde stabiliteit. Voor de samenstelling van 100 ml 10x PBS, zie aanvullende tabel S1. Verdunning van de 10x PBS 10x bereikt een pH van ~7,4.
3. Voeg 20 μL gewassen magnetische kraalsuspensie toe aan elke eiwitarme microcentrifugebuis met een verteerd DSS/VAMS-extract en IS. Voer immunoextractie uit gedurende 1 uur met behulp van een end-over-end monstermenger bij omgevingstemperatuur.
4. Was de magnetische kralen met behulp van de volgende oplossingen: 500 μL PBS met 0,05% (v/v) polysorbaat 20, 400 μL PBS, 300 μL 10 mM Tris HCl (pH 7,4) en 300 μL 100 mM ABC.
   1. Verwijder na de toevoeging van elke wasoplossing de eiwitarme microcentrifugebuis met kralen en wasoplossing uit het magneetrek en keer voorzichtig om tot homogeen. Plaats vervolgens de eiwitarme microcentrifugebuis gedurende 30 s op de magneet, keer gedurende 30 s om en plaats deze gedurende 1 minuut op de magneet. Verwijder de wasoplossing.
   2. Draai de resterende suspensie af met behulp van een microcentrifuge. Plaats gedurende 1 minuut op de magneet en verwijder de resterende wasoplossing.
5. Voeg 15 μL 2% (v/v) mierenzuur van type 1 H₂O toe aan elk monster en incubeer gedurende 5 minuten bij 22 °C en 1.000 tpm met behulp van een temperatuurgecontroleerde mixer of iets dergelijks om de gevangen peptiden te elueren. Plaats de magneet gedurende 1 minuut en breng het eluaat over naar een nieuwe 1,5 ml eiwitarme microcentrifugebuis. Herhaal dit eenmaal en breng het tweede eluaat over naar dezelfde eiwitarme microcentrifugebuis als het eerste eluaat.
6. Voeg 20 μL 100 mM ABC toe aan elk eluaat (totaal volume van 50 μL).
7. Centrifugeer (microcentrifuge) en breng 40 μL van het eluaat over naar micro-inzetstukken voor high-performance vloeistofchromatografie (HPLC) injectieflacs.

6. Analyse door LC-MS/MS

1. Gebruik een micro LC triple quadrupole MS met elektrospray ionisatie voor hoge robuustheid.
2. Bereid het LC-MS/MS-systeem voor op de analyse door de pompen met mobiele fase A (20 mM FA in H 2 O en MeCN,95:5 v/v) en B (20 mM FA in H₂O en MeCN, 5:95 v/v) te reinigen.
3. Plaats de analytische kolom (C18, 50 mm x 1 mm binnendiameter [ID], deeltjes van 3 μm).
4. Het instrument blijven voorbereiden voor analyse door de opstartprocedures voor het specifieke instrument te volgen.
5. Stel in de instrumentsoftware de temperatuur van de kolomoven in op 25 °C en het debiet op 50 μL/min (100% mobiele fase A).
6. Breng de kolom gedurende ten minste 15 minuten in evenwicht met mobiele fase A.
7. Plaats de monsters in de autosampler.
8. Bereid de instrumentmethode voor voor analyse van het ProGRP-specifieke, tryptische peptide ALGNQQPSWDSEDSSNFK en zijn IS.
   OPMERKING: Verschillende methodeparameters zijn instrumentspecifiek en moeten worden geoptimaliseerd op het specifieke gebruikte instrument. Details van de methodeparameters die hier worden gebruikt, worden beschreven in stappen 6.9 tot en met 6.11.
9. Gebruik voor het gradiëntprogramma in LC de volgende instellingen: debiet: 50 μL/min; van tijd 0,0 tot 3,0 min: 100% mobiele fase A; van tijd 3,0 tot 18,0 min: voer een lineair verloop uit van 0% naar 50% mobiele fase B; van tijd 18,0 tot 18,1 min: verhoging mobiele fase B van 50% naar 100%; van tijd 18,1 tot 20,0 min: 100% mobiele fase B; van tijd 20,0 tot 20,1 min: verlaag mobiele fase B van 100% naar 0%; van tijd 20,1 tot 30 min: 100% mobiele fase A om de kolom opnieuw in evenwicht te brengen (gebruik ten minste 10 kolomvolumes).
10. Voor MS/MS-instellingen voert u MS/MS uit in de positieve modus met behulp van instrumentinstellingen die zorgen voor een efficiënte ionisatie. Gebruik voor het volgen van dit protocol een sproeispanning van +4.000 V, een verwarmde capillaire temperatuur van 270 °C, stikstof als plaatgas (5 willekeurige eenheden) en argon (2 mTorr) voor botsingsgeïnduceerde dissociatie (CID) fragmentatie. Als het instrument het toelaat, richt u de LC-stroom om de eerste 2 minuten (0-2 minuten) en de laatste 1 minuut (29-30 minuten) van de run te verspillen, in plaats van in de MS.
11. Gebruik geselecteerde reactiemonitoring (SRM)-overgangen voor (A) het kenmerkende peptide (ALGNQQPSWDSEDSSNFK): 1.005.45→913.3, 1.005.45→1.028,3 en 1.005,45→1.398,5, en (B) het IS SIL-peptide (ALGNQQPSWDSEDSSNF[K_¹³C₆_¹⁵N₂]): 1.009.45→921.3, 1.009.45→1.036,3 en 1.009.45→1.406,5. Gebruik geoptimaliseerde botsingsenergie (35 V in dit protocol) voor alle bewaakte overgangen.
12. Bereid een reeks voor met de monsters die moeten worden uitgevoerd met behulp van de software die beschikbaar is voor uw LC-MS/MS-systeem. Stel het injectievolume in op 10 μL.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat u indien nodig lege monsters en kwaliteitscontrolemonsters toevoegt.
13. Druk op "Run sequence" in de instrumentsoftware om de sequentie te starten.
14. Bewaak het piekgebied van het affiniteits-vastgelegde, ProGRP-specifieke, tryptische peptide ALGNQQPSWDSEDSSNFK en zijn IS SIL-peptide.
    OPMERKING: Selectie en bevestiging van het kenmerkende peptide, ALGNQQPSWDSEDSSNFK, wordt elders beschreven¹⁴.

Resultaten

Een overzicht van de analytische workflow met behulp van zowel DSS-bemonstering als VAMS wordt weergegeven in figuur 1. Afgezien van de verschillen in bemonsteringsmethode zijn de procedures identiek. Beelden van het serum dat met behulp van de twee bemonsteringsmethoden is bemonsterd, zijn te zien in figuur 2.

Beide bemonsteringsvormen (VAMS en DSS) zijn geschikt voor de bemonstering van ProGRP-bevattend serum. Dit is te zien in figuur 3 waar MS-chromatogrammen van het proteotypische peptide en het IS SIL-peptide van DSS- en VAMS-bemonstering worden getoond. Bovendien wordt het MS-chromatogram na de analyse van een controlemonster bestaande uit 10 μL geprikt vloeibaar serummonster dat op dezelfde wijze is verwerkt als de gedroogde monsters, opgenomen. Deze laatste werd verdund in hetzelfde volume als het volume van de DSS/VAMS-extractieoplossing, onderworpen aan vertering met trypsineparels en opgeruimd met behulp van peptide-affiniteitsvangst.

Bij vergelijking van VAMS- en DSS-bemonstering (figuur 4) levert VAMS een hogere proteotypische peptide/IS-gebiedsverhouding op dan DSS. Dit geeft aan dat er mogelijk een verlies van het doeleiwit ProGRP is ten opzichte van het papier dat wordt gebruikt voor DSS (pure cellulose). Bij vergelijking met een controlemonster, waarbij het serum niet wordt gedroogd voordat het verder wordt verwerkt en geanalyseerd (figuur 4), wordt aangetoond dat VAMS vergelijkbare oppervlakteverhoudingen biedt als het controlemonster (tweezijdige t-test, p≤ 0,65), wat aangeeft dat er geen verlies aan het bemonsteringsmateriaal is, terwijl DSS een significant lagere oppervlakteverhouding biedt (tweezijdige t-test, p≤ 0,005), wat wijst op verlies van het bemonsteringsmateriaal.

Een korte evaluatie werd uitgevoerd met behulp van VAMS. Lineariteit werd aangetoond van 10 tot 1.000 ng / ml (R² = 0,9996), met een detectiegrens (LOD, S / N = 3) van 6, 7 ng / ml. De LOD wordt als bevredigend beschouwd omdat de analyse werd uitgevoerd op een vrij oude drievoudige quadrupool (2008) met een ID-kolom van 1 mm. De herhaalbaarheid van alle niveaus met een S/N > 10 werd ook als bevredigend beschouwd met een RSD tussen 7% en 17% (n = 3), met behulp van IS-correctie.

Affiniteitsvastlegging kan zowel voor als na de verteringsstap worden uitgevoerd door het eiwit van belang of het proteotypische peptide vast te leggen. De huidige procedure beschrijft het vastleggen van peptide-affiniteit. Een voordeel van deze aanpak ten opzichte van eiwitvangst is dat alleen het peptide van belang wordt vastgelegd en een nog efficiëntere monsteropruiming wordt bereikt. Dit wordt geïllustreerd in figuur 5, die een complexer full scan chromatogram laat zien met meer ruis na eiwitvangst in vergelijking na peptidevangst. De in figuur 5 geanalyseerde monsters worden niet bemonsterd met behulp van DSS-bemonstering of VAMS; Serum is echter ook de monstermatrix en affiniteitsvangst wordt uitgevoerd met hetzelfde antilichaam dat wordt gebruikt voor het vangen van peptiden in de beschreven procedure.

Figuur 1: Overzicht van de analytische workflow met behulp van zowel DSS- als VAMS-steekproeven. Afkortingen: DSS = gedroogde serumvlek; VAMS = volumetrische absorberende microsampling; LC-MS/MS = vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Afbeeldingen van serum bemonsterd met behulp van verschillende methoden . (A) DBS-cellulosekaart en (B) VAMS. Afkortingen: DBS = gedroogde bloedvlek; VAMS = volumetrische absorberende microsampling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Representatieve MS-chromatogrammen van het proteotypische peptide en het IS SIL-peptide na DSS- en VAMS-bemonstering, evenals voor een spiked serummonster dat rechtstreeks aan de extractieoplossing wordt toegevoegd. De MS-chromatogrammen tonen 10 μL-serummonsters met 1,5 μg/ml ProGRP en aangebracht op (A) VAMS, (B) de cellulosebemonsteringskaart (voor DSS) of (C) rechtstreeks op de extractiebuffer (controlemonster). Vijfentwintig microliter van 14 ng / ml is SIL-peptide toegevoegd aan alle monsters voorafgaand aan het vangen van peptide-affiniteit. Afkortingen: DSS = gedroogde serumvlek; VAMS = volumetrische absorberende microsampling; MS = massaspectrometrie; ProGRP = progastrine-releasing peptide; IS = interne standaard; SIL = stabiel isotoop-gelabeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Representatieve resultaten van de ALGNQQPSWDSEDSSNFK/IS-oppervlakteverhouding voor serummonsters met ProGRP en aangebracht (10 μL) op VAMS, DSS of rechtstreeks op de extractieoplossing (controlemonster). De concentratie van ProGRP is 1,5 μg/ml, n = 4 voor elke aandoening; 25 μL van 14 ng/ml is SIL-peptide wordt toegevoegd aan alle monsters voorafgaand aan de vangst van peptideaffiniteit. *geeft aan dat de oppervlakteverhouding significant verschilt van monsters die zijn toegepast op VAMS ( tweezijdige t-test, p≤ 0,005). Foutbalken zijn ± standaarddeviatie. Afkortingen: DSS = gedroogde serumvlek; VAMS = volumetrische absorberende microsampling; ProGRP = progastrine-releasing peptide; IS = interne standaard; SIL = stabiel isotoop-gelabeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Vergelijking van base peak chromatogrammen (full scan Orbitrap analyse) na intacte eiwitextractie (blauw) en proteotypische epitoop peptide extractie (rood). Geëxtraheerde ionchromatogrammen van het proteotypische epitooppeptide (ALGNQQPSWDSEDSSNFK, m/z 1005.45) zijn rechts weergegeven. Serum met 150 ng ml⁻¹ ProGRP werd als monster gebruikt. Deze figuur is herdrukt uit Levernæs et ^al.14. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende tabel S1: Een overzicht van de samenstelling van buffers en oplossingen en hoe deze te bereiden. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Het beschreven protocol bevat informatie over het uitvoeren van verschillende belangrijke stappen in de analyse van biomarkers met een lage abundantie uit gedroogde microsamples (DSS en VAMS), waaronder de bereiding van trypsineparels en met antilichamen gecoate magnetische kralen. Op basis van eerdere ervaringen behandelen we het antilichaam altijd met zuur voorafgaand aan de immobilisatie van de kraal om de oriëntatie van de antilichamen te verbeteren¹⁵.

Een van de kritieke stappen in deze procedure is de selectie van het meest geschikte microsamplingformaat. Ten eerste moet worden nagegaan of de analyt in kwestie kan worden bepaald uit volbloed, of dat de concentratie wordt beïnvloed door de bloedcellen en moet worden bepaald in serum of plasma (zoals voor de modelanalyt, ProGRP).

Zowel op papier als op polymeren gebaseerde benaderingen hebben voordelen en beperkingen; voor ProGRP biedt VAMS een duidelijk voordeel met betrekking tot de terugwinning van analyten na extractie uit de sampler. Dit kan echter waarschijnlijk worden geoptimaliseerd met behulp van een andere extractieoplossing voor de DSS-monsters. Niettemin is het belangrijk om rekening te houden met deze potentiële interactie tussen de analyt en het bemonsteringsmateriaal, aangezien dit kan leiden tot een grotere analytische variatie en hogere detectiegrenzen. Omdat de gebruikte IS een SIL-peptide is en voor het eerst wordt toegevoegd na de vertering, corrigeert IS voor de stappen na de spijsvertering (bijv. Affiniteitsextractie en LC-MS / MS-analyse). IS-correctie is niet mogelijk voor extractie uit DSS/VAMS en de verteringsstap.

Twee soorten kralen worden gebruikt in de procedure: trypsinekralen voor de spijsvertering na extractie van het serummonster uit de sampler en met antilichamen gecoate magnetische kralen voor het vangen van het proteotypische peptide na de spijsvertering. Een belangrijke reden voor het gebruik van trypsinekralen, naast het versnellen van de spijsvertering, is het minimaliseren van resterende trypsine-activiteit in het monster tijdens affiniteitsvangst. Dit is belangrijk om tryptische proteolyse van de mAb tijdens affiniteitsopname te voorkomen.

Agarose-kralen werden gebruikt voor de bereiding van de trypsinekralen, terwijl magnetische kralen werden gebruikt voor de bereiding van de met antilichamen gecoate kralen. Agarose-kralen zijn minder duur dan magnetische kralen, maar hebben een beperking dat scheiding van de kralen van de oplossing centrifugatie vereist. Dit maakt de scheiding van kralen en supernatant minder efficiënt dan bij het gebruik van magnetische kralen. Bovendien is automatisering van de workflow moeilijk met behulp van agarose-kralen. Magnetische NHS-geactiveerde kralen zijn echter beschikbaar en kunnen worden gebruikt voor een meer gestroomlijnde en automatiseerbare monstervoorbereidingsworkflow.

Microsampling is een belangrijke trend in de bioanalyse van zowel geneesmiddelen als biomarkers. Een uitdaging bij de huidige aanpak is de beperkte hoeveelheid monstervolume (10 μL), die van bijzonder belang kan zijn bij de bepaling van analyten met een zeer lage abundantie, zoals ProGRP (pg/ml-laag ng/ml-niveau). Deze uitdaging kan echter worden omzeild met behulp van de modernste analytische apparatuur. Voor deze analyten met een lage abundantie is de keuze van de monstervoorbereiding cruciaal en selectieve monsteropruiming door middel van op antilichamen gebaseerde affiniteitsvangst is meestal nodig. Aangezien is aangetoond dat peptidevangst schonere extracten en lagere detectielimieten oplevert dan eiwitvangst (met hetzelfde antilichaam)¹⁴, richt de huidige methode zich op deze aanpak in combinatie met microsampling. Een ander voordeel van de peptide capture benadering is dat het IS SIL peptide ook corrigeert voor de affiniteitsopnamestap.

In dit werk werd een antilichaam gericht op een eiwit gebruikt voor het vangen van peptiden. Dit is een voordeel omdat de beschikbaarheid van kant-en-klare antilichamen gericht op eiwitten hoger is dan kant-en-klare antilichamen gericht op proteotypische peptiden. Om een anti-eiwitantilichaam echter efficiënt een proteotypisch peptide te laten vangen, moet het epitoop intact zijn na eiwitvertering. Bovendien is voor veel antilichamen het exacte epitoop niet bekend, waardoor de zoektocht naar een anti-eiwitantilichaam vervelend is. Dit beperkt het aantal beschikbare anti-eiwitantistoffen dat van toepassing is op het vangen van peptiden. De beschreven procedure wordt gedemonstreerd met serum als matrix en ProGRP als doelanalyt. Het is de bedoeling dat de procedure van toepassing is op andere matrixen en andere doelanalyten. In plaats van een in de handel verkrijgbaar anti-eiwit antilichaam te gebruiken voor de affiniteitsvangst van het proteotypische peptide, is het mogelijk om ook op maat gemaakte, anti-peptide-antilichamen te gebruiken. De opruimefficiëntie van peptidevangst in vergelijking met eiwitvangst wordt geïllustreerd in figuur 5. Door de agarosekralen die worden gebruikt voor de bereiding van trypsinekralen te vervangen door magnetische kralen, moet de procedure ook compatibel zijn met gerobotiseerde monstervoorbereidingswerkstations die op de markt zijn.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Acetic acid N-hydroxysuccinimide ester	Carbosynt (Staad, Zwitserland)	FA33719	Bewaar in de vriezer onder -20 °C
ALGNQQPSWDSEDSSNF[K_13C6 _15N2] (≥ 95%)	Innovagen (Lund, Zweden)	Niet van toepassing	Bewaar in de vriezer onder -20 °C
Ammonium bicarbonate BioUltra (≥ 99.5% )	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)	09830-500G
Aquasil C18 column, 3 µm, 50 mm x 1 mm	Thermo scientific (Waltham, MA, USA)	77503-051030	Analytische kolom compatibel met 100% waterige mobiele fase
Benzamidine (≥ 95.0% )	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)	12072	Bewaar in de koelkast bij 2-6 °C
Calcium chloride dihydrate  (≥ 99% )	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)	223506-500G
Centrifuge 5804	Eppendorf (Hamburg, Duitsland)	5804000010
Gekloond ProGRP isovormen 1	Radium hospital, Oslo University Hospital (Oslo, Noorwegen)	Niet van toepassing	Bewaar in de vriezer onder -20 °C
Dinatriumwaterstoffosfaat dihydraat (pro analysis)	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)	30435-500G
Dinatriumwaterstoffosfaat dodecahydraat (pro analysis)	Merck (Darmstadt, Duitsland)	1.06579.0500
Dynabeads M-280 tosylgeactiveerd 10 mL	Invitrogen (Carlsbad, USA)	14204	Bewaar in de koelkast bij 2-6 °C
DynaMag-2	Invitrogen (Carlsbad, USA)	123-21D
Ethanolamine (pro analysis, ≥ 99%)	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)	#02400
Mierenzuur (≥ 99% ) voor LC-MS	VWR International (Radnor, PA, USA)	84865.260
FTA DMPK-C cellulosekaart	Whatman (Kent, UK)	WB129243	DBS kaart
HPLC-vialen, helder glas, 1.5 mL, 32 x 11.6 mm, Clean Pack	Nerliens Meszansky (Oslo, Noorwegen)	LPP 11 09 0519
Hulamixer monstermixer	Invitrogen (Carlsbad, USA)	101561503016	Monstermixer met einde-over-eind-menging en reciproke rotatie en vibratie
Humaan serum van gezonde bloeddonoren	Bloodbank, Ullevål, Oslo University Hospital (Oslo, Noorwegen)	Niet van toepassing	Bewaar in de vriezer onder -20 °C
Zoutenzuur rokerig 37% (Emsure voor analyse)	Merck (Darmstadt, Duitsland)	1.00317.1000
LC-MS/MS systeem: Ultimate 3000 systeem (Autosampler, WPS-3000TRS; Micropump, LPG-3400M; Flow manager, FLM-3300, MIC, 1X2P-10P) en TSQ Quantum access. Gecontroleerd door Xcalibur 2.2 SP1.48	Thermo scientific (Waltham, MA, USA)	Niet van toepassing
LiChrosolv Acetonitrile hypergrade voor LC-MS	Merck (Darmstadt, Duitsland)	1.00029.2500
LL Biotrode, gecombineerde glaselektrode	Metrohm (Herisau, Zwitserland)	6.0224.100
Magnetische roerder, Type M10	Franz Morat KG (Eisenbach, Duitsland)	10236
Micro-inserts, glas (31 x 6 mm, 0.1 mL)	VWR International (Radnor, PA, USA)	548-0006
MilliQ integral 3 met Q-POD	Merck Millipore (Molsheim, Frankrijk)	ZRXQ003T0	Voor productie van Type 1 water
Monoklonaal antilichaam M18	Radium hospital, Oslo University Hospital (Oslo, Noorwegen)	Niet van toepassing	Bewaar in de koelkast bij 2-6 °C
NHS-geactiveerde sepharose-kralen 4 snelle flow	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)	GE17-0906-01	Agaroseraatjes, bewaar in de koelkast bij 2-6 °C
Optifit, navulbare pipettentips, 10 mL	Sartorius Biohit (Helsinki, Finland)	613-2911
Optifit, navulbare pipettentips, 10 μL	Sartorius Biohit (Helsinki, Finland)	790012
Optifit, navulbare pipettentips, 1.000 μL	Sartorius Biohit (Helsinki, Finland)	791002
Optifit, navulbare pipettentips, 200 μL	Sartorius Biohit (Helsinki, Finland)	790202
pH glaselektrode	Metrohm (Herisau, Zwitserland)	6.0233.100
pH meter 744	Metrohm (Herisau, Zwitserland)	8.744.1003
Pipet 10 mL	Sartorius Biohit (Helsinki, Finland)	725090
Pipet m10 µL	Sartorius Biohit (Helsinki, Finland)	725020
Pipet m100 µL	Sartorius Biohit (Helsinki, Finland)	725050
Pipet m1,000 µL	Sartorius Biohit (Helsinki, Finland)	725070
Pipet m20 µL	Sartorius Biohit (Helsinki, Finland)	725030
Kaliumchloride (KCl ≥ 99.9%)	Sigma Aldrich (St.