Method Article

High-Content screening assay voor de identificatie van antilichaam-afhankelijke cellulaire cytotoxiciteit modificerende verbindingen

DOI:

10.3791/64485

⸱

August 18th, 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Chemistry, Faculty of Medicine, University of Debrecen, 2Doctoral School of Molecular Medicine, University of Debrecen, 3National Academy of Scientist Education, University of Debrecen, 4ELKH-DE Cell Biology and Signaling Research Group

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol presenteert een geautomatiseerde, op afbeeldingen gebaseerde high-throughput-techniek om verbindingen te identificeren die natural killer cel-gemedieerde borstkankerceldoding moduleren in de aanwezigheid van een therapeutisch anti-HER-2-antilichaam.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunotherapie met antigeenspecifieke antilichamen of immuuncheckpointremmers heeft een revolutie teweeggebracht in de therapie van borstkanker. Borstkankercellen die de epidermale groeifactorreceptor HER2 tot expressie brengen, kunnen het doelwit zijn van het anti-HER-2-antilichaam trastuzumab. Antilichaamafhankelijke cellulaire cytotoxiciteit (ADCC) is een belangrijk mechanisme dat betrokken is bij de antitumorwerking van HER-2. Trastuzumab gebonden aan kankercellen kan worden herkend door de Fc-receptoren van ADCC-effectorcellen (bijv. Natural killer (NK) cellen, macrofagen en granulocyten), waardoor de cytotoxische activiteit van deze immuuncellen wordt geactiveerd die leidt tot kankerceldood. We wilden een op afbeeldingen gebaseerde test ontwikkelen voor de kwantificering van ADCC om nieuwe ADCC-modulatorverbindingen te identificeren door middel van screening met een hoog gehalte. In de test worden HER2-overexpressie van JIMT-1-borstkankercellen samen gekweekt met NK-92-cellen in aanwezigheid van trastuzumab en wordt de dood van doelcellen gekwantificeerd door geautomatiseerde microscopie en kwantitatieve beeldanalyse. Doelcellen worden onderscheiden van effectorcellen op basis van hun EGFP-fluorescentie. We laten zien hoe samengestelde bibliotheken kunnen worden getest in de test om ADCC-modulatorgeneesmiddelen te identificeren. Voor dit doel werd een samengestelde bibliotheektestplaat opgezet met behulp van willekeurig geselecteerde fijne chemicaliën van de laboratoriumplank. Drie microtubuli destabiliserende verbindingen (colchicine, vincristine, podofyllotoxine) waarvan verwacht wordt dat ze de NK-celmigratie en degranulatie verstoren, werden ook opgenomen in de testbibliotheek. Het testscherm identificeerde alle drie de positieve controleverbindingen als treffers die de geschiktheid van de methode bewijzen om ADCC-modificerende geneesmiddelen in een chemische bibliotheek te identificeren. Met deze test kunnen samengestelde bibliotheekschermen worden uitgevoerd om ADCC-verbeterende verbindingen te identificeren die kunnen worden gebruikt als adjuvante therapeutische middelen voor de behandeling van patiënten die immunotherapieën tegen kanker krijgen. Bovendien kan de methode ook worden gebruikt om ongewenste ADCC-remmende bijwerkingen van therapeutische geneesmiddelen die door kankerpatiënten voor verschillende indicaties worden ingenomen, te identificeren.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunotherapie met antikankerantistoffen, immuuncheckpointremmers of chimere antigeenreceptor-expressie T (CAR-T) cellen vertegenwoordigt een krachtige benadering van kankerbehandeling 1,2,3. Trastuzumab is een gehumaniseerd monoklonaal anti-HER-2 (humane epidermale groeifactorreceptor 2) antilichaam dat wordt gebruikt voor de behandeling van HER-2-positieve vroege stadium of gemetastaseerde borstkanker, evenals HER-2-positieve gemetastaseerde maagkanker 4,5,6. Het werkt voornamelijk....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: De belangrijkste stappen van de testworkflow worden weergegeven in figuur 2.

figure-protocol-1
Figuur 2: Workflow van het ADCC-scherm. JIMT-1-EGFP-doelcellen gezaaid in 96 put HCS-platen worden behandeld met geneesmiddelen van de samengestelde bibliotheek. Op hun beurt worden ongekleurde NK (effector) cellen en trastuzumab toegevoegd en wordt de plaat afgebeeld op 0 tijdstip en na 3 uur incubatie. ADCC-evaluatie....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om te laten zien hoe de test in het echte leven werkt, hebben we een testbibliotheek gemaakt van 16 willekeurig geselecteerde verbindingen uit de laboratoriumschappen (figuur 3). Daarnaast werd DMSO ook opgenomen als een negatieve controle, en drie microtubule polymerisatieremmers (colchicine, vincristine en podofyllotoxine) als positieve controles. Van deze laatste werd verwacht dat ze ADCC zouden remmen door te interfereren met NK-celmigratie naar de kankercellen en NK-celdegranulatie. All.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ADCC-reactie is relatief lang geleden beschreven. Belangrijke moleculaire gebeurtenissen van het proces zijn ook beschreven19. Methoden voor het meten van ADCC variëren van de gouden standaard radioactieve chroom release assay, cytoplasmatische enzym release assays tot verschillende fluorescentie-gebaseerde flowcytometrie of microplate assays20. Een veel voorkomende beperking van deze testen is echter dat ze niet vatbaar zijn voor toepassingen met een hoge doorvoer. Eerd.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Auteurs melden geen belangenverstrengeling.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LV ontving financiering van de subsidies van het National Research, Development and Innovation Office GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS", GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVE en OTKA K132193, K147482. CD16.176V.NK-92 cellen werden verkregen van Dr. Kerry S. Campbell (Fox Chase Center, Philapedlphia, PA, namens Brink Biologics, lnc. San Diego, CA), worden wereldwijd beschermd door patenten en werden in licentie gegeven door Nantkwest, lnc. De auteurs zijn György Vereb en Árpád Szöőr dankbaar voor hun hulp bij het gebruik van de NK-92 cellijn en voor technisch advies.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
5-fluorouracilApplichemA7686in compound library
96-well Cell Carrier Ultra platePerkinElmerLLC 6055302
BetulinSigmaB9757in compound library
CD16.176V.NK92 cellsNankwest Inc. 
CeruleninChemCruzsc-396822in compound library
CisplatinSanta Cruz Biotechnologysc-200896in compound library
ColchicineSigmaC9754in compound library
Concanavalin-ACalbiochem234567in compound library
DexamethasoneSigmaD4902in compound library
DMEM/F-12 mediumSigmaD8437in JIMT-1 EGFP medium
DMSOSigmaD2650in compound library
EtoposideSigmaE1383E1383
Fetal bovine serum (FBS)BioseraFB-1090/500JIMT-1 EGFP and NK medium
FisetinSigmaF4043in compound library
Freedom EVO liquid handling robotTECAN
GallotanninFluka Chemical Corp.16201in compound library
GlutamineGibco35,050–061in NK medium
Harmony software PerkinElmer
Humanized anti-HER2 monoclonal antibody (Herzuma)EGIS Pharmaceuticals, Budapest HungaryN/A
Humulin R (insulin)Eli LillyHI0219JIMT-1 EGFP medium
IL-2Novartis Hungária Kft.PHC0026in NK medium
IsatinSigma114618in compound library
MEM Non-essential Amino Acids (MEM-NEAA)Gibco11,140–050in NK medium
Na-pyruvateLonzaBE13-115Ein NK medium
NaringeninSigmaN5893in compound library
NQDI-1SigmaSML0185in compound library
Opera Phenix High-Content Analysis equipmentPerkinElmer
Penicillin–streptomycinBioseraLM-A4118JIMT-1 EGFP and NK medium
PentoxyfillineSigmaP1784in compound library
Phosphate buffered saline (PBS)LonzaBE17-517Qto wash the cells
PodophyllotoxinSigmaP4405in compound library
QuercetinSigmaQ4951in compound library
Tannic acidSigmaT8406in compound library
TemozolomideSigmaT2577in compound library
Trypan blue 0.4% solutionSigmaT8154for cell counting
Vincristine sulfateSigmaV0400000in compound library
α-MEMSigmaM8042in NK medium

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gupta, S. L., Basu, S., Soni, V., Jaiswal, R. K. Immunotherapy: an alternative promising therapeutic approach against cancers. Molecular Biology Reports. 49 (10), 9903-9913 (2022).
  2. Moretti, A., et al. The past, present, and future of non-viral CAR ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Antibody Dependent Cellular CytotoxicityHigh Content ScreeningNK Cell CytotoxicityTrastuzumab AssayBreast Cancer ImmunotherapyHER2 Positive CellsAutomated MicroscopyImage AnalysisCompound Library ScreeningADCC Modulators

Related Articles