High-Content screening assay voor de identificatie van antilichaam-afhankelijke cellulaire cytotoxiciteit modificerende verbindingen

Samenvatting

Dit protocol presenteert een geautomatiseerde, op afbeeldingen gebaseerde high-throughput-techniek om verbindingen te identificeren die natural killer cel-gemedieerde borstkankerceldoding moduleren in de aanwezigheid van een therapeutisch anti-HER-2-antilichaam.

Samenvatting

Immunotherapie met antigeenspecifieke antilichamen of immuuncheckpointremmers heeft een revolutie teweeggebracht in de therapie van borstkanker. Borstkankercellen die de epidermale groeifactorreceptor HER2 tot expressie brengen, kunnen het doelwit zijn van het anti-HER-2-antilichaam trastuzumab. Antilichaamafhankelijke cellulaire cytotoxiciteit (ADCC) is een belangrijk mechanisme dat betrokken is bij de antitumorwerking van HER-2. Trastuzumab gebonden aan kankercellen kan worden herkend door de Fc-receptoren van ADCC-effectorcellen (bijv. Natural killer (NK) cellen, macrofagen en granulocyten), waardoor de cytotoxische activiteit van deze immuuncellen wordt geactiveerd die leidt tot kankerceldood. We wilden een op afbeeldingen gebaseerde test ontwikkelen voor de kwantificering van ADCC om nieuwe ADCC-modulatorverbindingen te identificeren door middel van screening met een hoog gehalte. In de test worden HER2-overexpressie van JIMT-1-borstkankercellen samen gekweekt met NK-92-cellen in aanwezigheid van trastuzumab en wordt de dood van doelcellen gekwantificeerd door geautomatiseerde microscopie en kwantitatieve beeldanalyse. Doelcellen worden onderscheiden van effectorcellen op basis van hun EGFP-fluorescentie. We laten zien hoe samengestelde bibliotheken kunnen worden getest in de test om ADCC-modulatorgeneesmiddelen te identificeren. Voor dit doel werd een samengestelde bibliotheektestplaat opgezet met behulp van willekeurig geselecteerde fijne chemicaliën van de laboratoriumplank. Drie microtubuli destabiliserende verbindingen (colchicine, vincristine, podofyllotoxine) waarvan verwacht wordt dat ze de NK-celmigratie en degranulatie verstoren, werden ook opgenomen in de testbibliotheek. Het testscherm identificeerde alle drie de positieve controleverbindingen als treffers die de geschiktheid van de methode bewijzen om ADCC-modificerende geneesmiddelen in een chemische bibliotheek te identificeren. Met deze test kunnen samengestelde bibliotheekschermen worden uitgevoerd om ADCC-verbeterende verbindingen te identificeren die kunnen worden gebruikt als adjuvante therapeutische middelen voor de behandeling van patiënten die immunotherapieën tegen kanker krijgen. Bovendien kan de methode ook worden gebruikt om ongewenste ADCC-remmende bijwerkingen van therapeutische geneesmiddelen die door kankerpatiënten voor verschillende indicaties worden ingenomen, te identificeren.

Inleiding

Immunotherapie met antikankerantistoffen, immuuncheckpointremmers of chimere antigeenreceptor-expressie T (CAR-T) cellen vertegenwoordigt een krachtige benadering van kankerbehandeling ^1,2,3. Trastuzumab is een gehumaniseerd monoklonaal anti-HER-2 (humane epidermale groeifactorreceptor 2) antilichaam dat wordt gebruikt voor de behandeling van HER-2-positieve vroege stadium of gemetastaseerde borstkanker, evenals HER-2-positieve gemetastaseerde maagkanker ^4,5,6. Het werkt voornamelijk door het proliferatiestimulerende effect van de epidermale groeifactor⁴ te remmen. Er is echter gemeld dat trastuzumab efficiënt kankerceldood veroorzaakt, zelfs als de kankercellen hun reactievermogen op HER-2-stimulatie hebben verloren⁷. Dit paradoxale effect van het antilichaam is te wijten aan antilichaamafhankelijke celgemedieerde cytotoxiciteit (ADCC)⁷. ADCC kan worden gemedieerd door natural killer (NK) cellen, granulocyten en macrofagen gezamenlijk bekend als de effectorcellen van ADCC ^8,9. Als een antilichaam, zoals trastuzumab, zich bindt aan tumorcellen, dan gebruiken deze effectorcellen hun Fc-receptoren om het constante (Fc) gebied van het antilichaam te binden. Het antilichaam overbrugt de tumorcellen en de Fc-receptordragende effectorcellen, waardoor de afgifte van hun cytotoxische mediatoren^{wordt geactiveerd 10}. Natural killer-cellen geven de cytotoxische lading van hun korrels die perforine bevatten vrij om poriën in het doelcelmembraan en granzyme te genereren (waardoor celdoodsignaleringsroutes worden geactiveerd) in de immuunsynaps die leiden tot apoptose van de kankercellen (zie figuur 1).

Figuur 1: Effector- en doelcelinteracties in ADCC. De Fcγ-receptor van het celoppervlak van de effector NK-cel herkent het Fc-gebied van het anti-HER2-trastuzumab-antilichaam dat specifiek is voor het HER2-molecuul dat tot expressie komt op het oppervlak van de tumorcel. Zo wordt de zogenaamde immunologische synaps tussen de twee cellen vastgesteld, waardoor de gerichte exocytose van cytotoxische korrels van de effectorcel wordt geïnduceerd. De vrijgekomen perforine- en granzymemoleculen resulteren uiteindelijk in apoptose van de doelcel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Er zijn eerder verschillende testen ontwikkeld om cytotoxiciteit te kwantificeren, waaronder ADCC. De gouden standaard is de radioactieve chroomafgiftemethode, waarbij de doelcellen worden gelabeld met radioactief ⁵¹Cr-isotoop en ADCC wordt gekwantificeerd door radioactiviteit te meten van het supernatant van gelyseerde doelcellen¹¹. Vanwege de voor de hand liggende problemen als gevolg van de strikt gereguleerde behandeling, opslag en verwijdering van radioactieve farmacons en afvalstoffen, is deze methode steeds minder populair geworden onder levenswetenschappers. Bovendien is het ook niet vatbaar voor toepassingen met een hoge doorvoer. Het meten van de activiteit van enzymen (bijv. lactaat-dehydrogenase) die vrijkomen uit de gedode doelcellen kan een niet-radioactief alternatief bieden voor de ⁵¹Cr-test¹². Deze testen maken echter geen onderscheid tussen doel- en effectorceldood. Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) bleek geschikt voor de kwantificering van ADCC¹³, maar de ECIS-apparatuur is niet beschikbaar in de meeste laboratoria en de techniek is niet compatibel met toepassingen met hoge doorvoer / screening. Fluorescerend gelabelde cellen vormen een populair alternatief in veel celbiologische assays en worden vaak gebruikt in flowcytometrie of op plaatlezers gebaseerde toepassingen^14,15,16. Deze testen bevatten echter vaak wasstappen of zijn anderszins niet compatibel met toepassingen met een hoge doorvoer (bijv. Op flowcytometrie gebaseerde technieken). Sommige populaire cytotoxiciteitstests, die in theorie geschikt zouden moeten zijn voor ADCC-kwantificering, slagen er niet in om de ADCC-efficiëntie betrouwbaar te bepalen¹³. Onlangs, met de verspreiding van fluorescerende confocale microscopie, worden beeldgebaseerde, hoog-inhoudige assays steeds populairder in verschillende gebieden van de levenswetenschappen¹⁷. Aan de ene kant is celbeeldvormingsapparatuur nu vrij alomtegenwoordig, terwijl aan de andere kant vrijwel eindeloze morfologische parameters kunnen worden verzameld uit de verkregen beelden. Daarom zijn we begonnen met het ontwikkelen van een high-content screening compatibele ADCC-test en om de geschiktheid ervan voor samengestelde bibliotheekscreening aan te tonen.

Hier presenteren we een op afbeeldingen gebaseerde ADCC-test en laten we zien hoe deze test kan worden gebruikt voor High-Content Screening (HCS) om ADCC-modulerende verbindingen te identificeren. Het model is gebaseerd op JIMT-1 borstcarcinoom doelcellen, CD16.176V.NK-92 effectorcellen en het gehumaniseerde monoklonale anti-HER2 antilichaam trastuzumab. Met deze methode is het mogelijk om geneesmiddelen te identificeren die de tumordodende werking van NK-cellen kunnen verbeteren of om inzicht te krijgen in het mechanisme van NK-celgemedieerde ADCC door kleine moleculen te identificeren die interfereren met ADCC. We suggereren dat levenswetenschappers die celgemedieerde cytotoxiciteit willen kwantificeren met speciale aandacht voor ADCC, baat kunnen hebben bij het gebruik van deze test, hetzij voor de ontdekkingswetenschap of de ontwikkeling van geneesmiddelen. Deze test kan een alternatief zijn als een laboratorium toegang heeft tot en enige ervaring heeft met fluorescerende beeldvorming en kwantitatieve beeldanalyse.

Protocol

OPMERKING: De belangrijkste stappen van de testworkflow worden weergegeven in figuur 2.

Figuur 2: Workflow van het ADCC-scherm. JIMT-1-EGFP-doelcellen gezaaid in 96 put HCS-platen worden behandeld met geneesmiddelen van de samengestelde bibliotheek. Op hun beurt worden ongekleurde NK (effector) cellen en trastuzumab toegevoegd en wordt de plaat afgebeeld op 0 tijdstip en na 3 uur incubatie. ADCC-evaluatie is gebaseerd op de verandering in het aantal levensvatbare (oppervlakte-adherente) doelcellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Coating van de HCS-plaat

1. Bedek de 96 well high-content screening (HSC) platen met 50 μL/well JIMT-1 medium (DMEM/F-12 medium aangevuld met 20% foetaal runderserum (FBS), 0,3 U/ml insuline (100 IE/ml, Humulin R en 1% penicilline-streptomycine).
2. Plaats de plaat gedurende 1 uur in een CO 2-incubator.
   OPMERKING: Coating is cruciaal voor het bevestigen van JIMT-1-cellen aan het glazen oppervlak van de plaat.

2. Zaaien van JIMT-1 Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) cellen

OPMERKING: EGFP-tot expressie brengende JIMT-1-cellen werden gegenereerd in ons vorige werk¹⁸ en de cellen werden gekweekt in T25-weefselkweekkolven in JIMT-1-media (zie samenstelling in stap 1.1).

1. Was de cellen met 2 ml steriele PBS.
2. Voeg 1 ml trypsine-EDTA toe aan de kolf en plaats de kolf gedurende 10 minuten terug in een CO 2-incubator.
3. Tik na de incubatie op de kolf om te controleren of JIMT-1-cellen zijn losgemaakt.
4. Stop de spijsvertering met 2 ml JIMT-1 media en verzamel de celsuspensie in een buis van 15 ml.
5. Tel de cellen met 0,4% trypanblauw (80 μL van de kleurstof + 20 μL van de celsuspensie) in een Bürker-kamer en pas het celnummer aan op 133.000 cellen/ml.
6. Zuig het coatingmedium op van de 96-putplaat (stap 1.2).
7. Pipetteer 75 μL van de celsuspensie aan elk putje van de HCS-platen (zie materiaaltabel).
8. Laat cellen zich hechten tijdens een nachtelijke incubatie bij 37 °C in een CO 2-incubator.

3. Voorbehandeling van JIMT-1 EGFP-cellen met de samengestelde bibliotheek

1. Zuig het medium uit de JIMT-1 cellen en voeg 50 μL/goed vers JIMT-1 medium toe aan de putjes. Breng de plaat over naar het screeningslaboratorium met hoge doorvoer.
   OPMERKING: Het gebruik van een vloeistofbehandelingsrobot maakt de toevoeging van samengestelde bibliotheken efficiënter en reproduceerbaarder.
2. Breng de teststoffen over van de samengestelde bibliotheekplaat naar de testplaat met een pingereedschap dat is gekalibreerd op een volume van 25 nL. Voer dit vier keer uit. Vier overdrachtsrondes geven een eindvolume van 100 nL (en een eindconcentratie van 20 μM).
3. Was tussen elke stap het pingereedschap, eerst met 50% DMSO en vervolgens met 70% ethanol.
4. Incubeer de platen gedurende 1 uur in een CO 2-incubator bij 37 °C.

4. De ADCC-test starten door de effectorcellen toe te voegen

OPMERKING: CD16.176V.NK92-cellen (hierna NK92-cellen genoemd) werden gekweekt in α-MEM aangevuld met 20% FBS, 1% MEM-NEAA, 1% Na-pyruvaat, 1% glutamine, 1% penicilline-streptomycine en 100 IE/ml IL-2.

1. Tel NK92-cellen met trypanblauw (80 μL van de kleurstof + 20 μL van de celsuspensie). Pas het celnummer aan op 400.000 cellen/ml.
2. Centrifugeer 4 ml van de celsuspensie bij 150 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
3. Bereid het ADCC-medium door 20 μg/ml anti-HER2-antilichaam (trastuzumab) toe te voegen aan het JIMT-1-medium.
4. Resuspensie van de NK-celpellet in 5 ml ADCC-medium.
5. Pipetteer 20.000 NK-cellen in 50 μL ADCC-medium naar de doel-JIMT-1-cellen. Het uiteindelijke volume is 100 μl en de uiteindelijke trastuzumabconcentratie is 10 μg / ml.
6. Plaats de testplaat in de hoogwaardige analyseapparatuur met een ingebouwde incubator die is ingesteld op 37 °C.

5. Beeldvorming

OPMERKING: De platen moeten op twee tijdstippen worden afgebeeld, ten eerste onmiddellijk na de toevoeging van de effectorcellen aan de doelcellen en ten tweede op 3 uur na de toevoeging van NK-cellen. Voor beeldvorming kunnen de high-content analyzer en zijn software of geschikte alternatieven worden gebruikt (zie materiaaltabel).

1. Selecteer Plaattype (96-well cell carrier ultra) in de lijst met platen.
2. Selecteer de autofocus met twee pieken als de test in platen wordt uitgevoerd.
3. Gebruik 10x objectief in niet-confocale modus.
4. Selecteer Binning 2 om de signaal-ruisverhouding te verdubbelen.
5. Maak brightfield-opnamen bij 650-760 nm en fluorescerende beelden van de EGFP-getransduceerde JIMT-1-cellen bij 488 nm (excitatie) en 500-550 nm (emissie) golflengten.
6. Selecteer het aantal velden en het aantal tijdspunten voor de afbeelding.

6. Beeldanalyse

OPMERKING: Om de ADCC-efficiëntie te analyseren, worden de levensvatbare JIMT-1-cellen geteld. Doelcellen die door ADCC worden gedood, maken zich los van het oppervlak en bewegen zich weg van het brandpuntsvlak van de microscoop. Daarom komt het verschil tussen het aantal levensvatbare cellen aan het begin en aan het einde van de ADCC-reactie overeen met doelcellen die door ADCC worden geëlimineerd. Om te laten zien hoe de evaluatievolgorde moet worden opgebouwd, wordt in de video een controle-ADCC-put getoond.

1. Gebruik de module Cellen zoeken om gebieden op de afbeelding te detecteren die overeenkomen met cellen.
   OPMERKING: Elke cel wordt gedetecteerd als een gebied op de afbeelding met een hogere fluorescentie-intensiteit dan de omgeving.
2. Selecteer cellen met behulp van het ingebouwde M-algoritme met een diameter van minimaal 80 μm.
3. Stel de gevoeligheid voor splitsen, waarmee een groot object wordt verpakt in kleinere objecten, in op 0,5.
4. Stel de drempel voor algemeen gebruik (het laagste pixelintensiteitsniveau) in op 0.
5. Sluit de detectie van achtergrondgebied met hoge EGFP-fluorescentie-intensiteit in twee stappen uit.
   1. Gebruik eerst de functie Intensiteitseigenschappen berekenen om de EGFP-fluorescentie-intensiteit in het eerder geselecteerde cellengebied te bepalen.
   2. Stel de minimum- en maximumintensiteitsdrempel in met de optie Populatie selecteren .

Resultaten

Om te laten zien hoe de test in het echte leven werkt, hebben we een testbibliotheek gemaakt van 16 willekeurig geselecteerde verbindingen uit de laboratoriumschappen (figuur 3). Daarnaast werd DMSO ook opgenomen als een negatieve controle, en drie microtubule polymerisatieremmers (colchicine, vincristine en podofyllotoxine) als positieve controles. Van deze laatste werd verwacht dat ze ADCC zouden remmen door te interfereren met NK-celmigratie naar de kankercellen en NK-celdegranulatie. All...

Discussie

De ADCC-reactie is relatief lang geleden beschreven. Belangrijke moleculaire gebeurtenissen van het proces zijn ook beschreven¹⁹. Methoden voor het meten van ADCC variëren van de gouden standaard radioactieve chroom release assay, cytoplasmatische enzym release assays tot verschillende fluorescentie-gebaseerde flowcytometrie of microplate assays²⁰. Een veel voorkomende beperking van deze testen is echter dat ze niet vatbaar zijn voor toepassingen met een hoge doorvoer. Eerd...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
5-fluorouracil	Applichem	A7686	in verbindingsbibliotheek
96-well Cell Carrier Ultra plate	PerkinElmer	LLC 6055302
Betulin	Sigma	B9757	in verbindingsbibliotheek
CD16.176V.NK92 cells	Nankwest Inc.
Cerulenin	ChemCruz	sc-396822	in verbindingsbibliotheek
Cisplatin	Santa Cruz Biotechnology	sc-200896	in verbindingsbibliotheek
Colchicine	Sigma	C9754	in verbindingsbibliotheek
Concanavalin-A	Calbiochem	234567	in verbindingsbibliotheek
Dexamethasone	Sigma	D4902	in verbindingsbibliotheek
DMEM/F-12 medium	Sigma	D8437	in JIMT-1 EGFP medium
DMSO	Sigma	D2650	in verbindingsbibliotheek
Etoposide	Sigma	E1383	E1383
Fetal bovine serum (FBS)	Biosera	FB-1090/500	JIMT-1 EGFP en NK medium
Fisetin	Sigma	F4043	in verbindingsbibliotheek
Freedom EVO liquid handling robot	TECAN
Gallotannin	Fluka Chemical Corp.	16201	in verbindingsbibliotheek
Glutamine	Gibco	35,050–061	in NK medium
Harmony software	PerkinElmer
Humanized anti-HER2 monoclonal antibody (Herzuma)	EGIS Pharmaceuticals, Budapest Hongarije	N/A
Humulin R (insulin)	Eli Lilly	HI0219	JIMT-1 EGFP medium
IL-2	Novartis Hungária Kft.	PHC0026	in NK medium
Isatin	Sigma	114618	in verbindingsbibliotheek
MEM Non-essential Amino Acids (MEM-NEAA)	Gibco	11,140–050	in NK medium
Na-pyruvate	Lonza	BE13-115E	in NK medium
Naringenin	Sigma	N5893	in verbindingsbibliotheek
NQDI-1	Sigma	SML0185	in verbindingsbibliotheek
Opera Phenix High-Content Analysis equipment	PerkinElmer
Penicillin–streptomycin	Biosera	LM-A4118	JIMT-1 EGFP en NK medium
Pentoxyfilline	Sigma	P1784	in verbindingsbibliotheek
Phosphate buffered saline (PBS)	Lonza	BE17-517Q	om de cellen te wassen
Podophyllotoxin	Sigma	P4405	in verbindingsbibliotheek
Quercetin	Sigma	Q4951	in verbindingsbibliotheek
Tannic acid	Sigma	T8406	in verbindingsbibliotheek
Temozolomide	Sigma	T2577	in verbindingsbibliotheek
Trypan blue 0.4% solution	Sigma	T8154	voor celtelling
Vincristine sulfate	Sigma	V0400000	in verbindingsbibliotheek
α-MEM	Sigma	M8042	in NK medium