Methodenartikel

Isolatiemethode voor hematopoëtische stamcellen op lange en korte termijn

DOI:

10.3791/64488

⸱

19 mei 2023

 ,  ,  ,  , 
1Hematopoietic Stem Cell Biology and Medical Innovation (HSCBMI), Department of Pediatrics, Kobe University Graduate School of Medicine, 2RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We presenteren een stapsgewijs protocol voor de isolatie van lange termijn hematopoëtische stamcellen (LT-HSCs) en korte termijn HSC's (ST-HSCs) met behulp van het Hoxb5 reporter systeem.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zelfvernieuwingscapaciteit en multi-lineage differentiatiepotentiaal worden over het algemeen beschouwd als de bepalende kenmerken van hematopoietische stamcellen (HSC's). Talrijke studies hebben echter gesuggereerd dat functionele heterogeniteit bestaat in het HSC-compartiment. Recente eencellige analyses hebben HSC-klonen gemeld met verschillende celloten binnen het HSC-compartiment, die bevooroordeelde HSC-klonen worden genoemd. De mechanismen die ten grondslag liggen aan heterogene of slecht reproduceerbare resultaten zijn weinig begrepen, vooral met betrekking tot de lengte van zelfvernieuwing wanneer gezuiverde HSC-fracties worden getransplanteerd door conventionele immunostaining. Daarom is het van cruciaal belang om dit probleem op te lossen door een reproduceerbare isolatiemethode vast te stellen voor HSC's op lange termijn (LT-HSC's) en HSC's op korte termijn (ST-HSC's), gedefinieerd door de lengte van hun zelfvernieuwing. Met behulp van onbevooroordeelde meerstapsscreening identificeerden we een transcriptiefactor, Hoxb5, die een exclusieve marker van LT-HSC's in het hematopoietische systeem van de muis kan zijn. Op basis van deze bevinding hebben we een Hoxb5-reportermuislijn opgezet en met succes LT-HSC's en ST-HSC's geïsoleerd. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de isolatie van LT-HSC's en ST-HSC's met behulp van het Hoxb5-reportersysteem . Deze isolatiemethode zal onderzoekers helpen de mechanismen van zelfvernieuwing en de biologische basis voor dergelijke heterogeniteit in het HSC-compartiment beter te begrijpen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hematopoietische stamcellen (HSC's), die zelfvernieuwingsvermogen en multipotentie bezitten, bevinden zich aan de top van de hematopoietische hiërarchie 1,2. In 1988 toonden Weissman en collega's voor het eerst aan dat de isolatie van HSC's van muizen kon worden bereikt met behulp van flowcytometrie3. Vervolgens werd gemeld dat een fractie gedefinieerd door een combinatie van celoppervlakmarkers, Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−, alle HSC's in muizen 4,5,6,7,8 bevatte.

Immunofenotypisch gedefinieerde (Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−) HSC's (hierna pHSC's) werden voorheen als functioneel homogeen beschouwd. Recente eencellige analyses hebben echter aangetoond dat pHSC's nog steeds heterogeniteit vertonen met betrekking tot hun zelfvernieuwingscapaciteit9,10 en multipotentie11,12. In het bijzonder lijken er twee populaties te bestaan in de pHSC-fractie met betrekking tot hun zelfvernieuwingscapaciteit: hematopoëtische stamcellen op lange termijn (LT-HSC's), die een continu zelfvernieuwingsvermogen hebben, en kortdurende hematopoëtische stamcellen (ST-HSC's), die een tijdelijk zelfvernieuwingsvermogen hebben 9,10.

Tot op heden blijven de moleculaire mechanismen van zelfvernieuwingscapaciteit die LT-HSC's en ST-HSC's onderscheiden slecht begrepen. Het is cruciaal om beide celpopulaties te isoleren op basis van hun zelfvernieuwingscapaciteiten en om onderliggende moleculaire mechanismen te ontdekken. Er zijn ook verschillende reportersystemen geïntroduceerd om LT-HSC's13,14,15 te zuiveren; de LT-HSC-zuiverheid die door elk reportersysteem wordt gedefinieerd, is echter variabel en exclusieve LT-HSC-zuivering is tot op heden niet bereikt.

Daarom zal de ontwikkeling van een isolatiesysteem voor LT-HSC's en ST-HSC's het onderzoek naar zelfvernieuwingscapaciteit in de pHSC-fractie versnellen. In de isolatie van LT-HSC's en ST-HSC's identificeerde een studie met behulp van meerstaps, onbevooroordeelde screening een enkel gen, Hoxb5, dat heterogeen tot expressie komt in de pHSC-fractie16. Bovendien bleek uit beenmerganalyse van de Hoxb5-reportermuizen dat ongeveer 20% -25% van de pHSC-fractie bestaat uit Hoxb5-pos-cellen. Een competitieve transplantatietest met Hoxb5pos pHSCs en Hoxb5 neg pHSCs toonde aan dat alleen Hoxb5pos pHSCs over zelfvernieuwingscapaciteit op lange termijn beschikken, terwijl Hoxb5neg pHSCs hun zelfvernieuwingscapaciteit binnen een korte periode verliezen, wat aangeeft dat Hoxb5 LT-HSC's identificeert in de pHSC-fractie16.

Hier demonstreren we een stapsgewijs protocol om LT-HSC's en ST-HSC's te isoleren met behulp van het Hoxb5-reportersysteem . Daarnaast presenteren we een competitieve transplantatietest om de zelfvernieuwingscapaciteit van Hoxb5pos/neg pHSCs te beoordelen (figuur 1). Dit Hoxb5 reporter systeem stelt ons in staat om LT-HSC's en ST-HSCs prospectief te isoleren en draagt bij aan het begrip van LT-HSC-specifieke kenmerken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle beschreven dierproeven zijn goedgekeurd door het RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research.

1. Voorconditionering van de ontvangende muizen

  1. Bereid mannelijke C57BL / 6 congene muizen van 8-10 weken oud voor als ontvangende muizen. Het aantal ontvangende muizen is afhankelijk van het experimentele protocol. We bereiden meestal 10-20 muizen voor elke aandoening.
    1. Voed de muizen met gesteriliseerd water aangevuld met enrofloxacine (170 mg / L). Aangezien bestraalde ontvangende muizen zeer vatbaar zijn voor infecties, moet u de kooien zo schoon mogelijk houden.
      OPMERKING: Suppletie met antibiotica begint 24 uur voorafgaand aan de bestraling en gaat door tot 3 weken na transplantatie om infecties te voorkomen.
  2. Totale lichaamsbestraling
    1. Totale lichaamsbestraling vernietigt de ontvangende beenmergcellen om de transplantatie van de donorcellen te garanderen. Breng de ontvangende muizen over in een bestralingskooi. Lethally bestralen van de ontvangende muizen met een enkele dosis van 8,7 Gy op 12-16 uur vóór transplantatie.
      OPMERKING: De stralingsdosis en -tijd kunnen variëren, afhankelijk van de apparatuur. De dodelijke stralingsdosis moet worden bevestigd met de bestralings- en muizenstam van de onderzoeker.
    2. Breng ze terug naar hun kooien na de totale lichaamsbestraling.

2. Verzameling van de beenmergcellen van de donor

  1. Bereid een mannelijke Hoxb5-tri-mCherry-muis van 12 weken oud voor en euthanaseer de muis door CO2-blootstelling gevolgd door cervicale dislocatie of met behulp van methoden die zijn goedgekeurd door de lokale ethische commissie voor dieren.
    OPMERKING: Het reagensvolume per muis wordt in de volgende stappen beschreven.
  2. Verwijder onder steriele omstandigheden de huid en stel de botten bloot (dijbeen, scheenbeen, bekken, opperarmbeen). Snijd de belangrijkste spieren en neem de botten (dijbeen, scheenbeen, bekken, opperarmbeen) van de muis. Leg ze in steriele celkweekschaaltjes met Ca 2+- en Mg2+-vrije, ijskoude PBS.
  3. Knip de spieren en vezelige weefsels van de botten met een pincet, een kleine schaar en doekjes om besmetting te voorkomen. Pas op dat u de botten tijdens deze stap niet breekt. Gooi gebroken botten weg om de steriliteit te behouden.
  4. Steriliseer een vijzel en stamper met 70% ethanol (EtOH) en laat ze volledig drogen. Evenwicht met celkleuringsbuffer (Ca 2+- en Mg2+-vrije PBS aangevuld met 2% warmte-geïnactiveerde FBS, 2 mM EDTA, 100 U/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine).
  5. Doe de botten in de mortel en voeg 3 ml celkleuringsbuffer toe. Plet de botten open met de stamper. Splits de celklonters door voorzichtig pipetteren en breng de celsuspensie door een celzeef van 100 μm over in een buis van 50 ml.
  6. Herhaal stap 2.5 totdat de oplossing duidelijk wordt. Meestal is drie keer voldoende.

3. Scheiding van de c-kit+ cellen door magnetische sortering

  1. Antilichaamkleuring voor magnetische sortering
    1. Centrifugeer de monsters gedurende 5 minuten bij 400 x g en 4 °C. Zuig het supernatant op en resuspensie de pellet in 1 ml celkleuringsbuffer. Voeg 10 μL rat-IgG (5 mg/ml) toe om de niet-specifieke antilichaambinding te verminderen en pipetteer voorzichtig op en neer met een P1.000-pipet. Incubeer op ijs gedurende 15 min.
    2. Voeg het c-Kit-antilichaam (kloon 2B8) toe in een concentratie van 4 μg/ml en meng met een P1.000-pipet. Incubeer op ijs gedurende 15 min.
    3. Voeg 5 ml celkleuringsbuffer toe en meng goed. Centrifugeer de monsters bij 400 x g, 4 °C, 5 min. Zuig het supernatant op en resuspensie de pellet in 500 μL celkleuringsbuffer.
    4. Voeg 35 μL anti-APC microbeads toe om de c-Kit+ cellen te verrijken en meng met een P1.000 pipet. Incubeer op ijs gedurende 15 min.
    5. Voeg 4-5 ml celkleuringsbuffer toe. Centrifugeer de monsters gedurende 5 minuten bij 400 x g en 4 °C. Zuig het supernatant op en resuspensie de pellet in 1 ml celkleuringsbuffer.
  2. De c-Kit+ cellen magnetisch sorteren
    1. Volg de instructies van de fabrikant om de cellen te sorteren. Kortom, prime een magnetische sorteerkolom met 3 ml celkleuringsbuffer. Filter het monster (1 ml) door een celzeef van 40 μm en laad het monster op de magnetische sorteerkolom.
    2. Was door drie keer 3 ml celkleuringsbuffer toe te voegen. Voeg de celkleuringsbuffer alleen toe als het kolomreservoir leeg is.
    3. Plaats de magnetische sorteerkolom bovenop een ijskoude buis van 15 ml en voeg 5 ml celkleuringsbuffer toe. Spoel de cellen weg door de zuiger stevig in de kolom te duwen. Houd de doorstroming op ijs.
      OPMERKING: In geval van accidenteel monsterverlies houden we de doorstroming tot het einde van het experiment.

4. Hematopoëtische stamcelkleuring

  1. Centrifugeer het in stap 3.2.3 bereide monster gedurende 5 minuten bij 400 x g en 4 °C. Zuig het supernatant op.
  2. Voeg het CD34-antilichaam (kloon RAM34) in een concentratie van 50 μg/ml toe aan de pellet en incubeer gedurende 60 minuten op ijs.
    OPMERKING: Voorbereiding van de ondersteunende cellen tijdens het eerste uur van incubatie met CD34 wordt aanbevolen om de verwerkingstijd te verkorten.
  3. Bereid de antilichaammastermix volgens tabel 1. Voeg 100 μL van het hoofdmengsel toe aan het monster en incubeer gedurende 30 minuten op ijs. Het antilichaam voor het CD34-antigeen (kloon; RAM34) heeft 90 minuten nodig voor voldoende kleuring.
  4. Voeg 4-5 ml celkleuringsbuffer toe. Centrifugeer het monster gedurende 5 minuten bij 400 x g en 4 °C. Zuig het supernatant op. Voeg streptavidin-BUV737 in een concentratie van 3 μg/ml toe aan de pellet en incubeer gedurende 30 minuten op ijs.
  5. Voeg 4-5 ml celkleuringsbuffer toe. Centrifugeer het monster gedurende 5 minuten bij 400 x g en 4 °C. Zuig het supernatant op en resuspensie de pellet in 400 μL celkleuringsbuffer. Bewaar het monster op ijs.

5. Ondersteuning van celvoorbereiding

  1. Bereid een CD45.1+ CD45.2+ congene muis van 12 weken oud; Idealiter zou dit dezelfde leeftijd moeten hebben als de donormuis. Euthanaseer de muis door CO2-blootstelling gevolgd door cervicale dislocatie of met behulp van methoden die zijn goedgekeurd door de lokale ethische commissie voor dieren.
    OPMERKING: In het gegeven voorbeeld werden CD45.1+ CD45.2+ congene muizen in eigen huis gefokt door B6 te kruisen. CD45.1 congene muizen met C57BL/6J muizen16.
  2. Neem onder steriele omstandigheden zowel dijbenen als scheenbeen en plaats ze in steriele celkweekschalen met Ca 2+- en Mg2+-vrije, ijskoude PBS. Knip de spieren en vezelige weefsels van de botten met een pincet en een kleine schaar.
  3. Knip beide uiteinden van de botten met een scherpe, steriele schaar. Gebruik een naald van 23 G en een spuit van 5 ml gevuld met ijskoude celsuspensiebuffer (Ca 2+- en Mg2+-vrije PBS aangevuld met 2% warmte-geïnactiveerde FBS, 100 U/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine) om het beenmerg uit te spoelen in een steriele celkweekschaal met celsuspensiebuffer. Splits de celklonten uit elkaar door voorzichtig pipetteren.
  4. Filter de celsuspensie door een celzeef van 40 μm met behulp van een P1.000-pipet. Tel het celnummer van de celsuspensie met behulp van een hemocytometer en bereid een beenmergcelsuspensie met 1 x 106 cellen/ml.
  5. Breng 200 μL van de beenmergcelsuspensie (2 x 105 cellen) over op een 96-well, ronde bodemplaat. Op ijs bewaren tot gebruik.
    OPMERKING: Platen met ronde bodem worden aanbevolen voor eenvoudige celverzameling.

6. Hoxb5pos of Hoxb5neg pHSC sortering

  1. Gating instellen
    1. Breng 400 μL van het in stap 4.5 bereide monster over in een polystyreenreageerbuis met ronde bodem met een 35 μm celzeefdop. Bereid dode celkleuringsreagens voor en voeg het vóór de analyse toe aan het monster volgens de instructies van de fabrikant.
    2. Schakel een flowcytometer in en start de analysesoftware volgens de instructies van de fabrikant. Druk vervolgens op Laden en haal de gegevens op.
      OPMERKING: Een flowcytometer uitgerust met vijf lasers en een mondstuk van 70 μm wordt aanbevolen om de zuiverheid van de gesorteerde cellen te verbeteren.
    3. Na het uitsluiten van doubletten, dode cellen en afstammingspositieve cellen, gaat u naar de Lineage-c-Kit+Sca-1+ fractie. Sluit vervolgens de Flk2+ fractie af. Vervolgens gate Hoxb5pos of Hoxb5neg pHSCs in de CD150+CD34−/lage fractie (Figuur 2). Voer compensatie uit voor de spectrale overlap in het eerste experiment.
      OPMERKING: Hoxb5-positieve cellen vertegenwoordigen naar verwachting 20% -25% van de Lineage-c-Kit + Sca-1 + CD150 + CD34 − / lageFlk2-fractie.
  2. Hoxb5pos of Hoxb5neg pHSC sortering
    1. Bereid een 1,5 ml eiwitarme bindingsbuis met 600 μL Ca 2+- en Mg2+ -vrije PBS aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerde FBS.
    2. Stel de 1,5 ml lage eiwitbindingsbuis in op een sorteerapparaat en sorteer de Hoxb5pos of Hoxb5neg pHSCs in de buis van 1,5 ml met behulp van de gatingstrategie die is ingesteld in stap 6.1.3. Gebruik bij de eerste sortering de opbrengst van de sorteerprecisiemodus.
    3. Plaats de 96-putplaat met de ondersteunende cellen voorbereid in stap 5.5 op de automatische celdepositie-eenheid (ACDU) -fase. Zet de in stap 6.2.2 bereide 1,5 ml lage eiwitbindingsbuis op de laadpoort van een flowcytometer.
    4. Sorteer de Hoxb5pos of Hoxb5neg pHSCs in een 96-well plaat met de ondersteunende cellen met behulp van de gating-strategie die is ingesteld in stap 6.1.3. Sorteer 10 Hoxb5pos of Hoxb5neg pHSCs om hun zelfvernieuwingscapaciteiten te testen.
      OPMERKING: Dubbelsorteren wordt aanbevolen om de zuiverheid te verbeteren. Gebruik bij de tweede sortering zuiverheid als de aanbevolen sorteernauwkeurigheidsmodus.
    5. Doorgaans worden 500-1.000 Hoxb5pos pHSC's en 1.500-4.000 Hoxb5neg pHSCs geoogst na dubbele sortering. Ga zo snel mogelijk na de HSC-sortering verder met de transplantatieprocedures om de levensvatbaarheid van de cel te verbeteren (idealiter binnen 1-2 uur).

7. Transplantatie

  1. Plaats de in stap 6.2.4 voorbereide HSC-gesorteerde plaat met 96 putten op ijs. Behandel de HSC-gesorteerde, 96-well plaat in steriele omstandigheden, idealiter in een celkap.
  2. Verdoof een ontvangende muis met 2% isofluraan in een gasanesthesie-inductiekamer. Zodra het dier volledig is verdoofd, verwijdert u het en plaatst u het op zijn zij. Om voldoende anesthesie te garanderen, bevestigt u geen beweging als reactie op een schadelijke stimulus.
  3. Na de bevestiging van de juiste anesthesie, voer zo snel mogelijk een retro-orbitale injectie uit om te voorkomen dat de muis weer bij bewustzijn komt. De retro-orbitale injectie duurt minder dan 30 s.
    OPMERKING: Omdat de injectietijd kort is, voltooien we de procedure zonder oogzalf in de ogen aan te brengen. Als de procedure echter langer duurt, raden we het gebruik van oogzalf aan.
  4. Pipetteer de cellen voorzichtig in de HSC-gesorteerde 96-well plaat om ze te mengen. Verzamel de donorcellen in de sorteerplaat met behulp van een insulinespuit van 30 G en injecteer ze in de retroorbitale veneuze plexus van de ontvangende muizen. Het aanbevolen injecteerbare volume is ≤200 μL.
  5. Observeer totdat de muizen bij bewustzijn zijn en zich verplaatsen in een schone kooi. Breng ze terug naar hun kooien nadat ze hun herstel hebben bevestigd.

8. Perifere bloedanalyse

  1. Verzamel 50 μL perifeer bloed uit de staartader en resuspensie met 100 μL Ca 2+- en Mg2+-vrije PBS met 2 mM EDTA. Breng alle monsters over op een plaat met 96 putten. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 400 x g en 4 °C en gooi het supernatant weg.
  2. Voeg 200 μL rode bloedcellysisbuffer toe en incubeer gedurende 3 minuten op ijs. Centrifugeer de monsters gedurende 5 minuten bij 400 x g en 4 °C en gooi het supernatant weg. Herhaal dit nog een keer.
  3. Voeg 200 μL celkleuringsbuffer toe. Centrifugeer de monsters gedurende 5 minuten bij 400 x g en 4 °C en gooi het supernatant weg.
  4. Bereid antilichaammastermix volgens tabel 2. Voeg 50 μL antilichaammastermix toe en incubeer gedurende 30 minuten op ijs.
  5. Voeg 150 μL celkleuringsbuffer toe. Centrifugeer de monsters gedurende 5 minuten bij 400 x g en 4 °C en gooi het supernatant weg.
  6. Voeg 200 μL celkleuringsbuffer toe. Centrifugeer de monsters gedurende 5 minuten bij 400 x g en 4 °C en gooi het supernatant weg. Resuspendeer in 200 μL celkleuringsbuffer en voeg dode celkleuringsreagens toe vóór de analyse volgens de instructies van de fabrikant.
  7. Analyseer perifeer bloed chimerisme met behulp van een flowcytometer zoals eerder beschreven16. Verzamel bloed na 4 weken, 8 weken, 12 weken en 16 weken na transplantatie om multi-lineage reconstitutie te volgen. Representatieve flowcytometrieplots zijn weergegeven in figuur 3.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eerder werd de zelfvernieuwingscapaciteit gemeten met behulp van competitieve transplantatietests, waarbij wordt aangenomen dat donor-HSC's hun zelfvernieuwingscapaciteit alleen behouden als multi-lineage donorcellen in het perifere bloed van de ontvanger worden waargenomen17. Bovendien definiëren verschillende rapporten LT-HSC's als cellen die enkele maanden na de tweede beenmergtransplantatie perifere bloedcellen blijven produceren10,18....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Traditioneel zijn celoppervlakmarker-gedefinieerde HSC's voorbereid om de functies van HSC's te bestuderen, zoals zelfvernieuwingscapaciteit en multi-potentie 19,20,21. De immunofenotypisch gedefinieerde (Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−) HSC-fractie bevat echter twee discrete HSC-populaties: LT-HSCs en ST-HSCs 9,10

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflicten in verband met deze studie.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We zijn Hiroshi Kiyonari dankbaar voor de dierenverzorging en voor het leveren van ontvangende muizen bij RIKEN BDR, evenals Hitomi Oga, Kayoko Nagasaka en Masaki Miyahashi voor laboratoriumbeheer aan de Universiteit van Kobe. De auteurs waarderen ook de voortdurende steun voor dit werk enorm. Masanori Miyanishi werd ondersteund door de Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant Numbers JP17K07407 en JP20H03268, The Mochida Memorial Foundation for Medical and Pharmaceutical Research, The Life Science Foundation of Japan, The Takeda Science Foundation, The Astellas Foundation for Research on Metabolic Disorders en AMED-PRIME, AMED onder Grant Number JP18gm6110020. Taro Sakamaki wordt ondersteund door JSPS KAKENHI Grant Numbers JP21K20669 en JP22K16334 en werd ondersteund door het JSPS Core-to-Core Program en RIKEN Junior Research Associate Program. Katsuyuki Nishi werd ondersteund door JSPS Grant Number KAKENHI JP18J13408.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.2 mL Strip of 8 Tubes, Dome CapSSIbio3230-00
0.5M EDTA pH 8.0IinvtrogenAM9260G
100 µm Cell StrainerFalcon352360
30G insulin syringeBD326668
40 µm Cell StrainerFalcon352340
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap CapFALCON352235
7-AAD Viability Staining SolutionBioLegend420404
96 well U-BottomFALCON351177
Anti-APC-MicroBeadsMilteny biotec130-090-855
Aspirator with trap flaskBiosanFTA-1
B220-Alexa Fluor 700 (RA3-6B2)BioLegend103232
B220-Biotin (RA3-6B2)BioLegend103204
B220-BV786 (RA3-6B2)BD Biosciences563894
B6.CD45.1 congenic mice Sankyo Labo ServiceN/A
Baytril 10%BAYER341106546
BD FACS Aria II special order system BDN/A
Brilliant stain bufferBD566349
CD11b-Alexa Fluor 700 (M1/70)BioLegend101222
CD11b-Biotin (M1/70)BioLegend101204
CD11b-BUV395 (M1/70)BD Biosciences563553
CD11b-BV711 (M1/70)BD Biosciences563168
CD127-Alexa Fluor 700 (A7R34)Invitrogen56-1271-82
CD150-BV421 (TC15-12F12.2)BioLegend115943
CD16/CD32-Alexa Fluor 700 (93)Invitrogen56-0161-82
CD34-Alexa Fluor 647 (RAM34)BD Biosciences560230
CD34-FITC (RAM34)Invitrogen11034185
CD3-Alexa Fluor 700 (17A2)BioLegend100216
CD3ε -Biotin (145-2C11)BioLegend100304
CD3ε -BV421 (145-2C11)BioLegend100341
CD45.1/CD45.2 congenic miceN/AN/AGekweekt in ons laboratorium
CD45.1-FITC (A20)BD Biosciences553775
CD45.2-PE (104)BD Biosciences560695
CD4-Alexa Fluor 700 (GK1.5)BioLegend100430
CD4-Biotin (GK1.5)BioLegend100404
CD8a-Alexa Fluor 700 (53-6.7)BioLegend100730
CD8a-Biotin (53-6.7)BioLegend100704
Centrifuge Tube 15mlNICHIRYO00-ETS-CT-15
Centrifuge Tube 50mlNICHIRYO00-ETS-CT-50
c-Kit-APC-eFluor780 (2B8)Invitrogen47117182
D-PBS (-) without Ca and Mg, liquid Nacalai14249-24
Fetal Bovine SerumThermo Fisher10270106
Flk2-PerCP-eFluor710 (A2F10)eBioscience46135182
FlowJo version 10BD Biosciences https://www.flowjo.com/solutions/flowjo
Gmmacell 40 ExactorBest theratronicsN/A
Gr-1-Alexa Fluor 700 (RB6-8C5)BioLegend108422
Gr-1-Biotin (RB6-8C5)BioLegend108404
Hoxb5-tri-mCherry mice (C57BL/6J background) N/AN/AGekweekt in ons laboratorium
IgG from rat serum, technical grade, >=80% (SDS-PAGE), buffered aqueous solutionSigma-AldrichI8015-100MG
isofluranePfizer4987-114-13340-3 
Kimwipes S200NIPPON PAPER CRECIA 6-6689-01
LS ColumnsMilteny biotec130-042-401
Lysis buffer BD555899
MACS  MultiStandMilteny biotec130-042-303
Microplate for Tissue Culture (For Adhesion Cell) 6WellIWAKI3810-006
MidiMACS SeparatorMilteny biotec130-042-302
Mouse Pie CagesNatsume SeisakushoKN-331
Multipurpose refrigerated CentrifugeTOMYEX-125
NARCOBIT-E (II)Natsume SeisakushoKN-1071-I
NK-1.1-PerCP-Cy5.5 (PK136)BioLegend108728
Penicillin-Streptomycin Mixed Solutionnacalai26253-84
Porcelain Mortar φ120mm with PestleAsone6-549-03
Protein LoBind Tube 1.5 mL&

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weissman, I. L., Shizuru, J. A. The origins of the identification and isolation of hematopoietic stem cells, and their capability to induce donor-specific transplantation tolerance and treat autoimmune diseases. Blood. 112 (9), 3543-3553 (2008).
  2. Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood. Cell Stem Cell. 1 (6), 635-645 (2007).
  3. Spangrude, G. J., Heimfeld, S., Weissman, I. L. Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells. Science. 241 (4861), 58-62 (1988).
  4. Ogawa, M., et al. Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells. Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).
  5. Ikuta, K., Weissman, I. L. Evidence that hematopoietic stem cells express mouse c-kit but do not depend on steel factor for their generation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (4), 1502-1506 (1992).
  6. Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
  7. Christensen, J. L., Weissman, I. L. Flk-2 is a marker in hematopoietic stem cell differentiation: A simple method to isolate long-term stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (25), 14541-14546 (2001).
  8. Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
  9. Morrison, S. J., Weissman, I. L. The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype. Immunity. 1 (8), 661-673 (1994).
  10. Spangrude, G. J., Brooks, D. M., Tumas, D. B. Long-term repopulation of irradiated mice with limiting numbers of purified hematopoietic stem cells: In vivo expansion of stem cell phenotype but not function. Blood. 85 (4), 1006-1016 (1995).
  11. Dykstra, B., Olthof, S., Schreuder, J., Ritsema, M., de Haan, G. Clonal analysis reveals multiple functional defects of aged murine hematopoietic stem cells. Journal of Experimental Medicine. 208 (13), 2691-2703 (2011).
  12. Grover, A., et al. Single-cell RNA sequencing reveals molecular and functional platelet bias of aged haematopoietic stem cells. Nature Communications. 7, 11075(2016).
  13. Kataoka, K., et al. Evi1 is essential for hematopoietic stem cell self-renewal, and its expression marks hematopoietic cells with long-term multilineage repopulating activity. Journal of Experimental Medicine. 208 (12), 2403-2416 (2011).
  14. Gazit, R., et al. Fgd5 identifies hematopoietic stem cells in the murine bone marrow. Journal of Experimental Medicine. 211 (7), 1315-1331 (2014).
  15. Acar, M., et al. Deep imaging of bone marrow shows non-dividing stem cells are mainly perisinusoidal. Nature. 526 (7571), 126-130 (2015).
  16. Chen, J. Y., et al. Hoxb5 marks long-term haematopoietic stem cells and reveals a homogenous perivascular niche. Nature. 530 (7589), 223-227 (2016).
  17. Ema, H., et al. Quantification of self-renewal capacity in single hematopoietic stem cells from normal and Lnk-deficient mice. Developmental Cell. 8 (6), 907-914 (2005).
  18. Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment. Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1182 (2010).
  19. Yamamoto, R., et al. Clonal analysis unveils self-renewing lineage-restricted progenitors generated directly from hematopoietic stem cells. Cell. 154 (5), 1112-1126 (2013).
  20. Fathman, J. W., et al. Upregulation of CD11A on hematopoietic stem cells denotes the loss of long-term reconstitution potential. Stem Cell Reports. 3 (5), 707-715 (2014).
  21. Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
  22. Haas, S., Trumpp, A., Milsom, M. D. Causes and consequences of hematopoietic stem cell heterogeneity. Cell Stem Cell. 22 (5), 627-638 (2018).
  23. Schroeder, T. Hematopoietic stem cell heterogeneity: Subtypes, not unpredictable behavior. Cell Stem Cell. 6 (3), 203-207 (2010).
  24. Muller-Sieburg, C. E., Sieburg, H. B., Bernitz, J. M., Cattarossi, G. Stem cell heterogeneity: Implications for aging and regenerative medicine. Blood. 119 (17), 3900-3907 (2012).
  25. Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): Providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48 (1), 11-22 (2009).
  26. Nishi, K., et al. Identification of the minimum requirements for successful haematopoietic stem cell transplantation. British Journal of Haematology. 196 (3), 711-723 (2022).
  27. Sakamaki, T., et al. Hoxb5 defines the heterogeneity of self-renewal capacity in the hematopoietic stem cell compartment. Biochemical and Biophysical Research Communications. 539, 34-41 (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

lange termijn HSC skorte termijn HSC sHoxb5 reportermuizenflowcytometrieisolatie van beenmergzelfvernieuwingsmechanismencellsorteringlineage negatieve cellenmulti lineage differentiatie

Gerelateerde artikelen