Method Article

Isolatiemethode voor hematopoëtische stamcellen op lange en korte termijn

DOI:

10.3791/64488

⸱

May 19th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Hematopoietic Stem Cell Biology and Medical Innovation (HSCBMI), Department of Pediatrics, Kobe University Graduate School of Medicine, 2RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We presenteren een stapsgewijs protocol voor de isolatie van lange termijn hematopoëtische stamcellen (LT-HSCs) en korte termijn HSC's (ST-HSCs) met behulp van het Hoxb5 reporter systeem.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zelfvernieuwingscapaciteit en multi-lineage differentiatiepotentiaal worden over het algemeen beschouwd als de bepalende kenmerken van hematopoietische stamcellen (HSC's). Talrijke studies hebben echter gesuggereerd dat functionele heterogeniteit bestaat in het HSC-compartiment. Recente eencellige analyses hebben HSC-klonen gemeld met verschillende celloten binnen het HSC-compartiment, die bevooroordeelde HSC-klonen worden genoemd. De mechanismen die ten grondslag liggen aan heterogene of slecht reproduceerbare resultaten zijn weinig begrepen, vooral met betrekking tot de lengte van zelfvernieuwing wanneer gezuiverde HSC-fracties worden getransplanteerd door conventionele immunostaining. Daarom is het van cruciaal belang om dit probleem op te lossen door een reproduceerbare isolatiemethode vast te stellen voor HSC's op lange termijn (LT-HSC's) en HSC's op korte termijn (ST-HSC's), gedefinieerd door de lengte van hun zelfvernieuwing. Met behulp van onbevooroordeelde meerstapsscreening identificeerden we een transcriptiefactor, Hoxb5, die een exclusieve marker van LT-HSC's in het hematopoietische systeem van de muis kan zijn. Op basis van deze bevinding hebben we een Hoxb5-reportermuislijn opgezet en met succes LT-HSC's en ST-HSC's geïsoleerd. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de isolatie van LT-HSC's en ST-HSC's met behulp van het Hoxb5-reportersysteem . Deze isolatiemethode zal onderzoekers helpen de mechanismen van zelfvernieuwing en de biologische basis voor dergelijke heterogeniteit in het HSC-compartiment beter te begrijpen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hematopoietische stamcellen (HSC's), die zelfvernieuwingsvermogen en multipotentie bezitten, bevinden zich aan de top van de hematopoietische hiërarchie 1,2. In 1988 toonden Weissman en collega's voor het eerst aan dat de isolatie van HSC's van muizen kon worden bereikt met behulp van flowcytometrie3. Vervolgens werd gemeld dat een fractie gedefinieerd door een combinatie van celoppervlakmarkers, Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−, alle HSC's in muizen 4,5,6,7,8 bevatte.<....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle beschreven dierproeven zijn goedgekeurd door het RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research.

1. Voorconditionering van de ontvangende muizen

  1. Bereid mannelijke C57BL / 6 congene muizen van 8-10 weken oud voor als ontvangende muizen. Het aantal ontvangende muizen is afhankelijk van het experimentele protocol. We bereiden meestal 10-20 muizen voor elke aandoening.
    1. Voed de muizen met gesteriliseerd water aangevuld met enrofloxacine (170 mg / L). Aangezien bestraalde ontvangende muizen zeer vatbaar zijn voor infecties, moet u de kooien zo schoon mogelijk houden.
      OPMERKING: Suppletie met antibiotica be....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eerder werd de zelfvernieuwingscapaciteit gemeten met behulp van competitieve transplantatietests, waarbij wordt aangenomen dat donor-HSC's hun zelfvernieuwingscapaciteit alleen behouden als multi-lineage donorcellen in het perifere bloed van de ontvanger worden waargenomen17. Bovendien definiëren verschillende rapporten LT-HSC's als cellen die enkele maanden na de tweede beenmergtransplantatie perifere bloedcellen blijven produceren10,18........

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Traditioneel zijn celoppervlakmarker-gedefinieerde HSC's voorbereid om de functies van HSC's te bestuderen, zoals zelfvernieuwingscapaciteit en multi-potentie 19,20,21. De immunofenotypisch gedefinieerde (Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−) HSC-fractie bevat echter twee discrete HSC-populaties: LT-HSCs en ST-HSCs 9,10

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflicten in verband met deze studie.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We zijn Hiroshi Kiyonari dankbaar voor de dierenverzorging en voor het leveren van ontvangende muizen bij RIKEN BDR, evenals Hitomi Oga, Kayoko Nagasaka en Masaki Miyahashi voor laboratoriumbeheer aan de Universiteit van Kobe. De auteurs waarderen ook de voortdurende steun voor dit werk enorm. Masanori Miyanishi werd ondersteund door de Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant Numbers JP17K07407 en JP20H03268, The Mochida Memorial Foundation for Medical and Pharmaceutical Research, The Life Science Foundation of Japan, The Takeda Science Foundation, The Astellas Foundation for Research on Metabolic Disorders en AMED-PRIME, AMED onder Grant Numbe....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 mL Strip of 8 Tubes, Dome CapSSIbio3230-00
0.5M EDTA pH 8.0IinvtrogenAM9260G
100 µm Cell StrainerFalcon352360
30G insulin syringeBD326668
40 µm Cell StrainerFalcon352340
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap CapFALCON352235
7-AAD Viability Staining SolutionBioLegend420404
96 well U-BottomFALCON351177
Anti-APC-MicroBeadsMilteny biotec130-090-855
Aspirator with trap flaskBiosanFTA-1
B220-Alexa Fluor 700 (RA3-6B2)BioLegend103232
B220-Biotin (RA3-6B2)BioLegend103204
B220-BV786 (RA3-6B2)BD Biosciences563894
B6.CD45.1 congenic mice Sankyo Labo ServiceN/A
Baytril 10%BAYER341106546
BD FACS Aria II special order system BDN/A
Brilliant stain bufferBD566349
CD11b-Alexa Fluor 700 (M1/70)BioLegend101222
CD11b-Biotin (M1/70)BioLegend101204
CD11b-BUV395 (M1/70)BD Biosciences563553
CD11b-BV711 (M1/70)BD Biosciences563168
CD127-Alexa Fluor 700 (A7R34)Invitrogen56-1271-82
CD150-BV421 (TC15-12F12.2)BioLegend115943
CD16/CD32-Alexa Fluor 700 (93)Invitrogen56-0161-82
CD34-Alexa Fluor 647 (RAM34)BD Biosciences560230
CD34-FITC (RAM34)Invitrogen11034185
CD3-Alexa Fluor 700 (17A2)BioLegend100216
CD3ε -Biotin (145-2C11)BioLegend100304
CD3ε -BV421 (145-2C11)BioLegend100341
CD45.1/CD45.2 congenic miceN/AN/ABred in our Laboratory
CD45.1-FITC (A20)BD Biosciences553775
CD45.2-PE (104)BD Biosciences560695
CD4-Alexa Fluor 700 (GK1.5)BioLegend100430
CD4-Biotin (GK1.5)BioLegend100404
CD8a-Alexa Fluor 700 (53-6.7)BioLegend100730
CD8a-Biotin (53-6.7)BioLegend100704
Centrifuge Tube 15mlNICHIRYO00-ETS-CT-15
Centrifuge Tube 50mlNICHIRYO00-ETS-CT-50
c-Kit-APC-eFluor780 (2B8)Invitrogen47117182
D-PBS (-) without Ca and Mg, liquid Nacalai14249-24
Fetal Bovine SerumThermo Fisher10270106
Flk2-PerCP-eFluor710 (A2F10)eBioscience46135182
FlowJo version 10BD Biosciences https://www.flowjo.com/solutions/flowjo
Gmmacell 40 ExactorBest theratronicsN/A
Gr-1-Alexa Fluor 700 (RB6-8C5)BioLegend108422
Gr-1-Biotin (RB6-8C5)BioLegend108404
Hoxb5-tri-mCherry mice (C57BL/6J background) N/AN/ABred in our Laboratory
IgG from rat serum, technical grade, >=80% (SDS-PAGE), buffered aqueous solutionSigma-AldrichI8015-100MG
isofluranePfizer4987-114-13340-3 
Kimwipes S200NIPPON PAPER CRECIA 6-6689-01
LS ColumnsMilteny biotec130-042-401
Lysis buffer BD555899
MACS  MultiStandMilteny biotec130-042-303
Microplate for Tissue Culture (For Adhesion Cell) 6WellIWAKI3810-006
MidiMACS SeparatorMilteny biotec130-042-302
Mouse Pie CagesNatsume SeisakushoKN-331
Multipurpose refrigerated CentrifugeTOMYEX-125
NARCOBIT-E (II)Natsume SeisakushoKN-1071-I
NK-1.1-PerCP-Cy5.5 (PK136)BioLegend108728
Penicillin-Streptomycin Mixed Solutionnacalai26253-84
Porcelain Mortar φ120mm with PestleAsone6-549-03
Protein LoBind Tube 1.5 mL Eppendorf22431081
Sca-I-BUV395 (D7)BD Biosciences563990
Stainless steel scalpel bladeFastGeneFG-B2010
Streptavidin-BUV737BD Biosciences612775
SYTOX-redInvitrogenS34859
Tailveiner Restrainer for Mice standardBraintreeTV-150 STD
TCRb-BV421 (H57-597)BioLegend109230
Ter-119-Alexa Fluor 700 (TER-119)BioLegend116220
Ter-119-Biotin (TER-119)BioLegend116204
Terumo 5ml Concentric Luer-Slip SyringeTERUMOSS-05LZ
Terumo Hypodermic Needle 23G x 1TERUMONN-2325-R

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weissman, I. L., Shizuru, J. A. The origins of the identification and isolation of hematopoietic stem cells, and their capability to induce donor-specific transplantation tolerance and treat autoimmune diseases. Blood. 112 (9), 3543-3553 (2008).
  2. Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hematopoietic Stem CellsLong Term HSCsShort Term HSCsHoxb5 Reporter MiceFlow CytometryBone Marrow IsolationSelf Renewal MechanismsCell SortingLineage Negative CellsMulti Lineage Differentiation

Related Articles