Methodenartikel

Bepaling van de S-faseduur met behulp van 5-ethynyl-2'-deoxyuridine-opname in Saccharomyces cerevisiae

DOI:

10.3791/64490

⸱

21 oktober 2022

 ,  , 
1Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier, Université de Montpellier, CNRS

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven twee complementaire protocollen om de S-faseduur in S. cerevisiae nauwkeurig te bepalen met behulp van EdU, een thymidine-analoog, dat in vivo is opgenomen en gedetecteerd met behulp van Click-chemie door microscopie en flowcytometrie. Het zorgt voor de eenvoudige karakterisering van de duur van DNA-replicatie en over het hoofd geziene replicatiedefecten in mutanten.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eukaryote DNA-replicatie is een sterk gereguleerd proces dat ervoor zorgt dat de genetische blauwdruk van een cel correct wordt gedupliceerd voorafgaand aan chromosoomsegregatie. Aangezien DNA-synthesedefecten ten grondslag liggen aan chromosoomherschikkingen, is het monitoren van DNA-replicatie essentieel geworden om de basis van genoominstabiliteit te begrijpen. Saccharomyces cerevisiae is een klassiek model om celcyclusregulatie te bestuderen, maar belangrijke DNA-replicatieparameters, zoals de fractie van cellen in de S-fase of de S-faseduur, zijn nog steeds moeilijk te bepalen. Dit protocol maakt gebruik van korte en niet-toxische pulsen van 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU), een thymidine-analoog, in gemanipuleerde TK-hENT1-gistcellen, gevolgd door de detectie door Click-reactie om de visualisatie en kwantificering van DNA-replicatie met hoge ruimtelijke en temporele resolutie op zowel het eencellige als het populatieniveau door microscopie en flowcytometrie mogelijk te maken. Deze methode kan eerder over het hoofd geziene defecten in de S-fase en celcyclusprogressie van gistmutanten identificeren, waardoor de karakterisering van nieuwe spelers mogelijk wordt die essentieel zijn voor het waarborgen van genoomstabiliteit.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genoomstabiliteit door mitotische deling wordt verzekerd door de overdracht van een volledige en gelijke set chromosomen naar de twee geproduceerde celoudergenen. Dit is afhankelijk van de nauwkeurige voltooiing van een reeks gebeurtenissen die zich in een bepaalde tijd in elke fase van de celcyclus voordoen. In G1 wordt de replicatieoorsprong in licentie gegeven bij de werving van verschillende licentiefactoren, waaronder Cdc61. In de S-fase wordt duplicatie van het hele genoom geïnitieerd vanuit meerdere actieve replicatieoorzaken en uitgevoerd door replicatiemachines die zich verzamelen in microscopisch zichtbare foci genaamd replicatiefabrieken2. In de M-fase worden gedupliceerde zusterchromatiden bevestigd en gebioriënteerd op de mitotische spil om hun segregatie naar de tegenovergestelde polen van de mitotische celmogelijk te maken 3. De regulatie, de juiste voltooiing en de duur van elke fase zijn de sleutel tot genoomstabiliteit. Inderdaad, voortijdige exit uit een van deze fasen leidt tot genoominstabiliteit. Bijvoorbeeld, een kortere G1 geïnduceerd door deletie van de ontluikende gist CDK-remmer Sic1 of door de overexpressie van G1 cyclinen zal de daaropvolgende S-fase 4,5,6 veranderen. Bijgevolg resulteren deze deregulaties, al dan niet geassocieerd met replicatiestress, in chromosoombreuken, herschikkingen en missegregatie 4,5,6. Daarom kan het monitoren van de duur van de S-fase en, meer in het algemeen, de duur van de andere fasen van de celcyclus cruciaal zijn om de defecten te identificeren die optreden in verschillende mutanten en in verschillende stressvolle omstandigheden.

Een traditionele methode voor het meten van de duur van de celcyclusfase omvat eenvoudige DNA-inhoudsstroomcytometrie (figuur 1A) en vertrouwt op een passend algoritme (beschikbaar in de meeste cytometriesoftware) dat wordt gebruikt om de populatie te scheiden in G1-, S- en G2 + M-fasefracties van de 1C- en 2C-pieken. De fracties worden vervolgens vermenigvuldigd met de populatie verdubbelingstijd7. Deze methode geeft echter alleen geschatte waarden, vereist een homogene celgrootteverdeling binnen een bepaalde fractie en is niet van toepassing op gesynchroniseerde culturen. Om de S-faseduur in zoogdiercellen te bestuderen, zijn verschillende thymidine-analogen ontwikkeld en op grote schaal gebruikt, waaronder EdU. Hun opname uit het extracellulaire medium en fosforylering door thymidinekinase (hierna TK genoemd) maken ze beschikbaar voor DNA-polymerasen om ze op te nemen op plaatsen van DNA-synthese (replicatie, recombinatie, reparatie). Om de afwezigheid van het TK-gen in Saccharomyces cerevisiae-cellen te omzeilen, zijn giststammen ontworpen om stabiele en constitutieve expressie van het herpes simplex-virus TK8 en de humane equilibratieve nucleosidetransporter (hENT1) 9 mogelijk te maken. Eenmaal opgenomen in DNA, wordt EdU gedetecteerd via de selectieve Click-reactie, die zijn alkyngroep chemisch koppelt aan azide-gemodificeerde fluorochelen10.

Dit artikel biedt twee geoptimaliseerde uitgebreide protocollen om asynchrone en synchrone TK-hENT1-engineered cellen met EdU te pulseren om de duur en dynamiek van DNA-replicatie nauwkeurig te visualiseren en te meten, evenals de duur van de andere fasen van de celcyclus, met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie op zowel het eencellige als het populatieniveau door microscopie en flowcytometrie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. S. cerevisiae celkweek

OPMERKING: De gebruikte giststammen zijn vermeld in tabel 1

OPMERKING: De duur van de S-fase kan op verschillende manieren worden bewaakt. Afhankelijk van de te beantwoorden vraag kunnen de cellen asynchroon of synchroon worden gekweekt na G1-arrestatie .

  1. Van asynchroon groeiende S. cerevisiae cellen
    OPMERKING: Deze methode maakt het mogelijk om het percentage cellen in de S-fase in een asynchroon groeiende celpopulatie te bepalen. Door de verdubbelingstijd te bepalen, kan de duur van de S-fase (en de andere fasen) worden geëxtrapoleerd.
    1. Ent S. cerevisiae cellen in 10 ml synthetisch compleet (SC) medium bij een lage celconcentratie (5 × 104 cellen/ml) voor een nachtkweek bij 30 °C met orbitale agitatie bij 130 rpm.
      OPMERKING: De concentratie wordt gemeten met een celteller. Om de verdubbelingstijden efficiënt te berekenen, wordt aanbevolen om de cultuur te enten uit een nachtcultuur die zich nog in de exponentiële fase bevindt (d.w.z. idealiter minder dan 2 × 107 cellen / ml). Het kweken van cellen in rich medium (YPD) wordt niet aanbevolen, omdat EdU-detectie niet efficiënt is.
    2. Verdun de volgende dag de cellen in 20 ml vers SC-medium in de uiteindelijke concentratie van 5 × 105 cellen / ml.
    3. Kweek de cellen bij 30 °C in een schuddend waterbad met horizontaal schudden bij 120 rpm.
    4. Meet de celconcentratie elk uur totdat deze 1 × 107 cellen / ml bereikt.
      OPMERKING: Deze stap maakt het mogelijk om een grafische weergave te maken van de toename van de celconcentratie in de loop van de tijd. De formule die wordt gebruikt om de verdubbelingstijden te berekenen, wordt uitgelegd in de legenda van tabel 2.
    5. Ga parallel aan stap 2 voor EdU-etikettering wanneer de celconcentratie ongeveer 2 × 106-5 is × 106 cellen / ml.
  2. Van G1-gesynchroniseerde S. cerevisiae cellen
    OPMERKING: Deze methode maakt het mogelijk om te bepalen wanneer de S-fase begint en eindigt door middel van flowcytometrie en/of microscopieanalyses.
    1. Ent S. cerevisiae cellen in 10 ml SC-medium bij een lage celconcentratie (5 × 104 cellen/ml) voor een nachtkweek bij 30 °C met orbitale agitatie bij 130 rpm.
      OPMERKING: Zie de opmerkingen na stap 1.1.1.
    2. Verdun de volgende dag de cellen in 20 ml vers SC-medium in een eindconcentratie van 2 × 106-3 × 106 cellen / ml.
    3. Voeg 40 μL 1 mg/ml α-factor verdund in water toe.
    4. Kweek de cellen bij 30 °C met orbitale agitatie bij 130 rpm gedurende 1 uur.
    5. Voeg opnieuw 40 μL van 1 mg/ml α-factor verdund in water.
    6. Kweek de cellen bij 30 °C met orbitale agitatie bij 130 rpm gedurende 1 uur.
    7. Visualiseer de cellen onder een lichtmicroscoop om de G1-arrestatie te controleren. Ga verder als meer dan 90% van de cellen een shmoo weergeven en de andere afgeronde, niet-gepofte cellen zijn.
      OPMERKING: Afhankelijk van de gebruikte achtergrond, wordt het aanbevolen om de cellen te soniceren voordat shmoo-visualisatie plaatsvindt. Voor de W303-achtergrond, soniceer 2x, voor 2 s elke keer, met een amplitude van 40-50.
    8. Centrifugeer gedurende 3 minuten bij 1.500 × g. Gooi het supernatant weg met een vacuümpipet.
    9. Resuspendeer de cellen in 20 ml SC-medium.
    10. Herhaal stap 1.2.8-1.2.9 eenmaal.
      OPMERKING: De α-factor wordt weggespoeld met deze stappen en de cellen worden vrijgegeven in de celcyclus. Als alternatief kan de α-factor worden weggespoeld door de gistcellen te filteren met een nitrocellulosefilter van 1,2 μm met behulp van een trechter op een zijarmkolf die is aangesloten op een vacuümpomp.
    11. Verzamel 1 ml cellen 2x per 5 minuten en ga verder met stap 2 voor EdU-etikettering.
      OPMERKING: Pulseer de cellen van slechts één van de twee buizen met EdU. De niet-pulsgelabelde cellen worden gebruikt om EdU-positieve van EdU-negatieve cellen te onderscheiden op een bivariate propidiumjodide (PI)-EdU-grafiek.
    12. Voeg 400 μL 1 mg/ml α-factor verdund in water 30 minuten na het vrijkomen toe.
      OPMERKING: Deze hoge dosis α-factor is nodig om de cellen in de G1-fase van de volgende celcyclus te stoppen en om te voorkomen dat de cellen opnieuw de volgende S-fase binnengaan.

2. EdU-etikettering

  1. Breng 1 ml celkweek over naar een microfugebuis van 2,0 ml met 1 μL 10 mM EdU. Meng goed door inversie.
    OPMERKING: Om de EdU-positieve cellen te onderscheiden van de EdU-negatieve cellen op een PI-EdU bivariate FACS, breng je nog eens 1 ml celcultuur over naar een 2,0 ml microfugebuis met 1 μL DMSO.
  2. Incubeer gedurende 3-5 minuten bij 30 °C onder roeren in een schuddend waterbad.
    OPMERKING: Drie minuten zijn voldoende voor EdU-detectie met een microscoop; 5 minuten zijn nodig voor optimale EdU-detectie op een flowcytometer.
  3. Stop de reactie met de toevoeging van 100 μL 100% ethanol.
    1. Stop de reactie met de toevoeging van 100 μL 20% paraformaldehyde als meting van de celgrootte vereist is.
      OPMERKING: Als de nucleaire architectuur van de mitotische cellen intact moet blijven voor verdere analyses na de Click-reactie, raden we aan cellen te fixeren met 2% paraformaldehyde bij kamertemperatuur (RT) in plaats van de cellen in ijs te zetten, omdat de laatste microtubuli-depolymerisatie veroorzaakt.
    2. Laat de cellen gedurende 20 minuten op RT onder milde agitatie op een rocker met variabele snelheid op 20 tilts/min om de cellen te fixeren voordat de cellen worden toegevoegd voor de toevoeging van 100 μL 100% ethanol.

3. Celfixatie en permeabilisatie

  1. Pelleteer de cellen gedurende 2 minuten bij 10.000 × g in een microfuge. Verwijder het supernatant met een vacuümpipet.
  2. Resuspendeer de celpellet in 500 μL van 70% ethanol. Meng goed door te vortexen.
  3. Laat ≥1 uur op RT bij 20 tilts/min op een rocker met variabele snelheid om de cellen te permeabiliseren.
    OPMERKING: Cellen gekweekt in SC-medium pelleteren niet goed omdat ze de neiging hebben om aan de microfuge-wanden te kleven. De toevoeging van ethanol verbetert de pelletering en vermindert het celverlies. De cellen kunnen 's nachts bij 4 °C of voor langere perioden bij −20 °C worden bewaard.
  4. Pelleteer de cellen gedurende 2 minuten bij 10.000 × g in een microcentrifuge. Gooi het supernatant weg met een vacuümpipet.
  5. Was de cellen 2x met 500 μL 10% ethanol in PBS.
    OPMERKING: De wasbeurten zijn cruciaal om niet-geïncorporeerde EdU uit de cellen te verwijderen.

4. Klik-erop reactie

  1. Voor cytometrie analyse
    1. Pelleteer de cellen gedurende 2 minuten bij 10.000 × g in een microfuge. Gooi het supernatant weg met een vacuümpipet.
    2. Resuspendeer de pellet in 200 μL PBS met 0,1 mg/ml RNase A en 0,2 mg/ml proteïnase K.
    3. Incubeer gedurende 1-2 uur bij 50 °C met af en toe schudden (of een nacht bij 37 °C).
    4. Pelleteer de cellen gedurende 2 minuten bij 10.000 × g in een microcentrifuge. Gooi het supernatant weg met een vacuümpipet.
    5. Was de cellen met 500 μL PBS.
    6. Pelleteer de cellen gedurende 2 minuten bij 10.000 × g in een microfuge. Gooi het supernatant weg met een vacuümpipet.
    7. Resuspendeer de celpellet in 200 μL PBS + 1% runderserumalbumine (BSA). Incubeer gedurende 30 minuten bij RT.
      OPMERKING: Langere tijden zijn niet nodig en zijn zelfs schadelijk voor de efficiëntie van klikreacties.
    8. Pelleteer de cellen gedurende 2 minuten bij 10.000 × g in een microcentrifuge. Gooi het supernatant weg met een vacuümpipet.
    9. Resuspendeer de pellet in 300 μL PBS + 1% BSA.
    10. Verdeel de cellen over twee buizen: 200 μL in een microcentrifugebuis van 1,5 ml voor de Klikreactie en 100 μL in een andere microcentrifugebuis van 1,5 ml voor Sytox Green-kleuring.
    11. Pelleteer de cellen gedurende 2 minuten bij 10.000 × g in een microcentrifuge. Gooi het supernatant weg met een vacuümpipet.
    12. Voor Sytox Green kleuring
      OPMERKING: We raden ten zeerste aan om een aliquot te nemen voor Sytox Green-kleuring (zonder klik) om referentieprofielen voor DNA-inhoud van hoge kwaliteit te verkrijgen. Inderdaad, de Click-reactie dooft de intercalante fluorescentie sterk, inclusief de Sytox Green- en PI-fluorescentie. Bijgevolg kan de Click-reactie de lezing van het DNA-gehalte verstoren.
      1. Resuspendeer de celpellet in 100 μL PBS.
      2. Breng 10-30 μL (afhankelijk van de celconcentratie) over naar een flowcytometerbuis met 300 μL van 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 en 0,5 μM Sytox Green.
      3. Soniceer 2x, voor 2 s elke keer, met een amplitude van 40-50.
      4. Laat in het donker totdat u de monsters op een flowcytometer verwerkt.
        OPMERKING: De cellen kunnen in dit stadium enkele dagen bij 4 °C worden gehouden.
    13. Voor de klikreactie
      1. Bereid verse Azide Dye buffer door de reagentia in de volgende volgorde (hoeveelheid voor één buis) te mengen: 36 μL PBS, 2 μL 0,2 M CuSO4, 0,2 μL 2 mM Cy5 Azide en 2 μL 1 M ascorbinezuur.
        OPMERKING: Het is mogelijk om een hoofdmix van de Azide Dye-buffer te bereiden. De reagentia moeten in dezelfde volgorde worden gemengd als hierboven vermeld.
      2. Resuspendeer de celpellet met 40 μL vers gemaakte Azide Dye mix. Incubeer bij RT in het donker gedurende 60 min.
      3. Pelleteer de cellen gedurende 2 minuten bij 10.000 × g in een microcentrifuge. Gooi het supernatant weg met een vacuümpipet.
      4. Was de cellen 3x met 300 μL 10% ethanol in PBS.
        OPMERKING: De wasbeurten zijn cruciaal om alle oplosbare EdU-Cy5 azide te elimineren.
      5. Resuspendeer de cellen in 100 μL van 50 μg/ml PI in PBS. Laat 10 minuten in het donker staan.
      6. Breng 10-30 μL van de celsuspensie (afhankelijk van de celconcentratie) over naar een flowcytometerbuis met 300 μL van 50 mM Tris-HCl, pH 7,5.
      7. Soniceer 2x, voor 2 s elke keer, met een amplitude van 40-50.
      8. Laat in het donker totdat u de monsters op een cytometer verwerkt.
        OPMERKING: De cellen kunnen in dit stadium enkele dagen bij 4 °C worden gehouden.
    14. Lees de Sytox Green-monsters met behulp van een excitatieblauwe laser bij 488 nm en een 530/30 BP-filter. Zie figuur 1A voor typische resultaten. Lees de bivariate PI-EdU-monsters op een dot plot met behulp van een excitatieblauwe laser bij 488 nm en een 615/20 BP-filter voor de PI (x-as) en een excitatie rode laser bij 640 nm en een 660/20 BP-filter (y-as). Zie figuur 1B voor typische resultaten.
      OPMERKING: Figuur 1C vertegenwoordigt het typische PI-EdU bivariate FACS-resultaat voor EdU-negatieve cellen. Het maakt de discriminatie van de EdU-negatieve cellen van de EdU-positieve cellen mogelijk.
  2. Voor microscopie-analyse
    1. Pelleteer de cellen gedurende 2 minuten bij 10.000 × g in een microcentrifuge. Gooi het supernatant weg met een vacuümpipet.
    2. Resuspendeer de pellet in 200 μL PBS + 1% BSA. Incubeer gedurende 30 minuten bij RT.
    3. Pelleteer de cellen gedurende 2 minuten bij 10.000 × g in een microfuge. Gooi het supernatant weg met een vacuümpipet.
    4. Bereid verse Azide Dye buffer door de reagentia te mengen in de volgende volgorde (hoeveelheid voor één buis): 36 μL PBS, 2 μL 0,2 M CuSO4, 0,2 μL 2 mM Dy-530 azide, 2 μL 1 M ascorbinezuur.
      OPMERKING: Een hoofdmix van de Azide Dye-buffer kan vers worden bereid door de reagentia in de bovengenoemde volgorde te mengen.
    5. Resuspendeer de pellet met 40 μL vers gemaakte Azide Dye buffer. Incubeer bij RT in het donker gedurende 60 min.
    6. Pelleteer de cellen gedurende 2 minuten bij 10.000 × g in een microfuge. Gooi het supernatant weg met een vacuümpipet.
    7. Was de cellen 2x met 300 μL 10% ethanol in PBS.
      OPMERKING: De wasbeurten zijn cruciaal om alle oplosbare Dy-530 azide te elimineren.
    8. Pelleteer de cellen gedurende 2 minuten bij 10.000 × g in een microcentrifuge. Gooi het supernatant weg met een vacuümpipet.
    9. Resuspensie van de cellen in 100 μL van 0,5 μg/ml 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) in PBS. Laat 30 minuten in het donker op kamertemperatuur.
    10. Pelleteer de cellen gedurende 2 minuten bij 10.000 × g in een microcentrifuge. Gooi het supernatant weg met een vacuümpipet.
    11. Wassen met 300 μL PBS om overtollige DAPI te verwijderen.
    12. Pelleteer de cellen gedurende 2 minuten bij 10.000 × g in een microfuge. Gooi het supernatant weg met een vacuümpipet.
    13. Resuspendeer de pellet met 10-50 μL PBS, afhankelijk van de celconcentratie.
    14. Soniceer 2x, voor 2 s elke keer, met een amplitude van 40-50.
      OPMERKING: De cellen kunnen in dit stadium enkele dagen bij 4 °C worden gehouden.
    15. Pipetteer 1,7 μL van de cellen op een glazen microscoopglaasje en dek af met een schone coverslip.
    16. Onmiddellijk waarnemen onder een fluorescentiemicroscoop met DAPI- en TexasRed- of Cy3-filters.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om de S-faseduur en, meer in het algemeen, de duur van G1 en G2 + M (protocol stap 1.1) te bepalen, werden S. cerevisiae W303 wild-type cellen (WT, tabel 1) asynchroon gekweekt in SC-medium gedurende 7 uur. Elk uur werd de celconcentratie gemonitord om de verdubbelingstijd te bepalen (figuur 2B). In deze groeiomstandigheden was de berekende verdubbelingstijd 120 min ± 13 min bij 25 °C (tabel 2). Toen de cellen zich in de expone...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gist is een belangrijk modelorganisme voor celcyclusstudies, maar de karakterisering van de S-fase wordt al lang belemmerd door het onvermogen om exogene nucleosiden op te nemen, zoals BrdU, die worden gebruikt als tracers van DNA-replicatie. Het uitrusten van gist met een hoge expressie van herpes simplex thymidinekinase (TK) en de toevoeging van een humane nucleoside transporter (hENT) heeft dit probleem grotendeels opgelost15,16. EdU is veelzijdiger dan BrdU o...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen Agence Nationale de la Recherche (ANR) en Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC) erkennen voor de doctoraatsbeurzen aan J.d.D.B.T. en het Agence Nationale pour la Recherche (ANR) voor financiële steun (subsidie ANR-18-CE12-0018-01). Cytometrie en microscopie werden uitgevoerd in de Montpellier MRI BioCampus beeldvormingsfaciliteit.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
α-factor GenescriptRP01002
Bovine Serum Albumin (BSA)Euromedex04-100--812-E
KopersulfaatSigmaC1297
DAPISigmaD9542
Di-sulfo-Cyanine5 azide (Cy5 azide)InterchimFP-JV6320Alternatief voor Alexa647-Azide
Dy-530 azideDyomics 530-10
EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine)CarbosynthNE08701
Absoluut ethanolCarlo Erba reagentsP013A10D16of equivalent
L- ascorbinezuurSigmaA4544
Propidium jodideSigmaP4864
Proteinase KEuromedexEU0090
RnaseSIGMAR5000
Sytox GreenInvitrogenS-7020
Utrusting
CeltellerOLSCASY
Flow cytometerAgilentNovoSampler Pro
SchudkuilInfors444-4230of equivalent
SchudwaterbadJulaboSW22of equivalent
SonicatorSonicsVibra cell
BreedveldmicroscopieLeicaTHUNDER Imagerof equivalent

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bell, S. P., Labib, K. Chromosome duplication in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 203 (3), 1027-1067 (2016).
  2. Kitamura, E., Blow, J. J., Tanaka, T. U. Live-cell imaging reveals replication of individual replicons in eukaryotic replication factories. Cell. 125 (7), 1297-1308 (2006).
  3. Marston, A. L. Chromosome segregation in budding yeast: Sister chromatid cohesion and related mechanisms. Genetics. 196 (1), 31-63 (2014).
  4. Lengronne, A., Schwob, E. The yeast CDK inhibitor Sic1 prevents genomic instability by promoting replication origin licensing in late G1. Molecular Cell. 9 (5), 1067-1078 (2002).
  5. Tanaka, S., Diffley, J. F. X. Deregulated G 1-cyclin expression induces genomic instability by preventing efficient pre-RC formation. Genes & Development. 16 (20), 2639-2649 (2002).
  6. Teixeira, L. K., et al. Cyclin E deregulation promotes loss of specific genomic regions. Current Biology. 25 (10), 1327-1333 (2015).
  7. Slater, M. L., Sharrow, S. O., Gart, J. J. Cell cycle of Saccharomyces cerevisiae in populations growing at different rates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (9), 3850-3854 (1977).
  8. McNeil, J. B., Friesen, J. D. Expression of the herpes simplex virus thymidine kinase gene in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and General Genetics. 184 (3), 386-393 (1981).
  9. Vernis, L. Reconstitution of an efficient thymidine salvage pathway in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 31 (19), 120(2003).
  10. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  11. Bruschi, C. V., McMillan, J. N., Coglievina, M., Esposito, M. S. The genomic instability of yeast cdc6-1/cdc6-1 mutants involves chromosome structure and recombination. Molecular and General Genetics. 249 (1), 8-18 (1995).
  12. Feng, L., Wang, B., Wu, L., Jong, A. Loss control of Mcm5 interaction with chromatin in cdc6-1 mutated in CDC-NTP motif. DNA and Cell Biology. 19 (7), 447-457 (2000).
  13. Saner, N., et al. Stochastic association of neighboring replicons creates replication factories in budding yeast. Journal of Cell Biology. 202 (7), 1001-1012 (2013).
  14. Pasero, P., Braguglia, D., Gasser, S. M. ORC-dependent and origin-specific initiation of DNA replication at defined foci in isolated yeast nuclei. Genes & Development. 11 (12), 1504-1518 (1997).
  15. Lengronne, A. Monitoring S phase progression globally and locally using BrdU incorporation in TK+ yeast strains. Nucleic Acids Research. 29 (7), 1433-1442 (2001).
  16. Magiera, M. M., Gueydon, E., Schwob, E. DNA replication and spindle checkpoints cooperate during S phase to delay mitosis and preserve genome integrity. The Journal of Cell Biology. 204 (2), 165-175 (2014).
  17. Talarek, N., Petit, J., Gueydon, E., Schwob, E. EdU incorporation for FACS and microscopy analysis of DNA replication in budding yeast. Methods in Molecular Biology. 1300, 105-112 (2015).
  18. Ivanova, T., et al. Budding yeast complete DNA synthesis after chromosome segregation begins. Nature Communications. 11 (1), 2267(2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

EdU incorporatieDNA replicatiecelcyclusregulatieflowcytometrieclick reactiegist synchronisatieSytox Green kleuringgenoomstabiliteit

Gerelateerde artikelen