Evaluatie van de effecten van biotoxines op immuuncelfuncties in zebravissen

Samenvatting

Dit protocol beschrijft flowcytometrische testen die de effecten van blootstelling aan toxines op de endocytische functies van verschillende subpopulaties van zebravisleukocyten kunnen evalueren. Het gebruik van specifieke functionele remmers in de test maakt differentiatie van de veranderde endocytische mechanismen mogelijk.

Samenvatting

Een verscheidenheid aan biologische toxines kan in schadelijke hoeveelheden aanwezig zijn in het aquatisch milieu. Cyanobacteriën zijn een diverse groep prokaryote micro-organismen die cyanotoxinen produceren in het aquatisch milieu. Deze biotoxinen kunnen hepatotoxinen, dermatoxinen of neurotoxinen zijn en kunnen vissen en zoogdieren aantasten. Bij hoge niveaus zijn deze verbindingen dodelijk. Op niet-dodelijke niveaus werken ze verraderlijk en beïnvloeden ze de functies van immuuncellen. Door algen geproduceerde biotoxines zijn onder meer microcystine en anatoxine A. Waterdieren kunnen ook materiaal opnemen dat besmet is met botulinum-neurotoxine E (BoNT/E) geproduceerd door Clostridium botulinum, wat ook kan leiden tot de dood of verminderde immuunfuncties. Zebravissen kunnen worden gebruikt om te bestuderen hoe toxines de functies van immuuncellen beïnvloeden. In deze onderzoeken kan blootstelling aan toxines in vivo of in vitro worden uitgevoerd. In vivo studies stellen de zebravis bloot aan het toxine, waarna de cellen worden geïsoleerd. Deze methode laat zien hoe de weefselomgeving de leukocytenfunctie kan beïnvloeden. De in vitro studies isoleren de cellen eerst en stellen ze vervolgens bloot aan het toxine in kweekputten. De leukocyten worden verkregen door extractie van het niermerg, gevolgd door centrifugatie van de dichtheidsgradiënt. Hoe leukocyten pathogenen internaliseren, wordt bepaald door endocytische mechanismen. Flowcytometrie-fagocytosetesten tonen aan of endocytische mechanismen zijn veranderd door blootstelling aan toxines. Studies waarbij geïsoleerde leukocyten worden gebruikt om te bepalen hoe toxines immuundisfunctie veroorzaken, ontbreken. De procedures die in dit artikel worden beschreven, stellen laboratoria in staat om zebravissen te gebruiken om de mechanismen te bestuderen die worden beïnvloed wanneer een milieutoxine de endocytische functies van immuuncellen vermindert.

Inleiding

Er zijn veel soorten biotoxines uit de omgeving en immuunsuppressiva. Algenbloei die bacteriële toxines bevat, komt voor in binnenwateren en kan ook voorkomen als biofilms¹. Cyanobacteriën (blauwalgen) komen van nature voor in alle zoetwaterecosystemen. Cyanobacteriële bloei is aanzienlijk toegenomen in zoetwatersystemen². Op bepaalde momenten kunnen de cyanobacteriën gifstoffen produceren die schadelijk zijn voor water- en landdieren. Deze gifstoffen kunnen de lever, huid en slijmvliezen en/of het zenuwstelsel aantasten. Twee verbindingen geproduceerd door cyanobacteriën zijn microcystine en anatoxine A. Microcystine is een cyclisch heptapeptide³. Anatoxine A is een alkaloïde⁴. Botuline-neurotoxine E (BoNT/E) is een ander toxine dat voorkomt in aquatische systemen. Het wordt geproduceerd door Clostridium botulinum en kan worden ingenomen door waterdieren⁵.

Blootstelling aan milieutoxines heeft gevolgen voor vissen en kan ook de diergezondheid aantasten en het aantal ziekten doen toenemen⁶. Begrijpen hoe deze toxines immuuncellen beïnvloeden, is van fundamenteel belang voor het bepalen van de risico's die gepaard gaan met blootstelling aan deze stoffen. Zebravissen zijn een uitstekend model voor het bestuderen van de effecten van milieutoxines op immuuncellen⁷. Het ontwikkelen van een methode die gebruik maakt van flowcytometrie en zebravisleukocyten is zeer nuttig. Zebravissen hebben fysiologisch belang voor de mens en deze methode kan worden toegepast op een breed scala aan onderzoeksgebieden, van basistoxicologie en immunologie tot het ontdekken van geneesmiddelen en ontwikkelingsbiologie. Omdat het waterorganismen zijn, zijn zebravissen bijzonder geschikt voor het bestuderen van de effecten van milieutoxines in het water⁷. Het gebruik van zebravissen is goedkoper dan andere gewervelde modellen en het gebruik ervan roept minder ethische bezwaren op.

Witte bloedcellen, of leukocyten, zijn de eerste lijn van cellulaire afweer tegen ziekteverwekkende organismen. Endocytose is het proces waarbij een cel een vloeistof of deeltje opneemt of internaliseert dat zich buiten de cel bevindt. Dit wordt bereikt door de cel die de verbinding omsluit in een blaasje⁸. Leukocyten gebruiken dit proces als de eerste stap bij het doden van ziekteverwekkers en het voorbereiden van een verdediging tegen ziekten. Fagocytose is een vorm van endocytose en was een van de eerste methoden die werden gebruikt om de effecten van milieuverontreinigende stoffen op de gezondheid van vissen te onderzoeken⁹. Het Petrie-Hanson-lab heeft methoden ontwikkeld met behulp van zebravisleukocyten om biotoxines te screenen op hun potentiële vermogen om de endocytische en fagocytische functies van leukocyten te verstoren en het immuunsysteem te beïnvloeden. De soorten endocytose die in deze methoden zijn opgenomen, zijn pinocytose, fagocytose, calciumafhankelijke receptor-gemedieerde fagocytose en mannosereceptor-gemedieerde fagocytose. Het gebruik van flowcytometriemethoden met zebravissen werd voor het eerst beschreven in het Petrie-Hanson-lab⁹ en wordt routinematig gebruikt om aquatische toxines en ziekteverwekkers te onderzoeken. Rag1^-/- mutante zebravissen hebben geen T- en B-cellen¹⁰ en kunnen worden gebruikt om aangeboren immuuncelmechanismen specifiek te onderzoeken.

Flowcytometrie is gebaseerd op laser en kan worden gebruikt om de fysische eigenschappen van cellen te bepalen. De voorwaartse spreiding of FSC-waarde wordt uitgezet op de X-as en geeft de grootte van de cel aan. De zijverstrooiing, of SSC, wordt uitgezet op de Y-as en vertegenwoordigt de cytoplasmatische granulariteit van de cel. De resulterende grafiek toont populaties van cellen met vergelijkbare fysieke kenmerken gegroepeerd, waarbij de verschillende celtypen op verschillende locaties op een spreidingsdiagram verschijnen. Deze populaties kunnen van locatie veranderen in het spreidingsdiagram als de fysieke kenmerken van de cellen veranderen⁹. Door deze techniek met zebravisleukocyten te gebruiken, kunnen onderzoekers veranderingen in celpopulaties beoordelen als reactie op verschillende stimuli, waaronder milieutoxines.

De flowcytometer is multidimensionaal en bij de evaluatie kunnen meerdere soorten fluoroforen worden gebruikt om de cellen en hun activiteit verder te karakteriseren. In de assays die in dit protocol worden beschreven, wordt endocytose gekenmerkt door het meten van de hoeveelheid fluorescerend materiaal die een cel heeft geïnternaliseerd. Of en hoe blootstelling aan toxine endocytische mechanismen beïnvloedt, kan worden bepaald door het vermogen van aan toxine blootgestelde cellen om het materiaal op te nemen te vergelijken met het vermogen van niet-toxine blootgestelde cellen met behulp van flowcytometrie. De endocytische processen die op deze manier kunnen worden geëvalueerd, zijn onder meer pinocytose, receptorgemedieerde endocytose en fagocytose.

Pinocytose is de opname van oplosbare componenten en maakt geen gebruik van celreceptoren. Opname omvat cytoplasmatische herschikking door microfilamenten en microtubuli om kleine vacuolen te vormen. Luciferase Geel (LY) is een fluorescerende kleurstof die wordt gebruikt om de vloeistofopname te meten door niet-selectieve pinocytose¹¹. Receptorgemedieerde endocytose omvat de selectieve opname van grote moleculen. Fluoresceïne (FITC) gelabeld dextran (DX) 40 kan worden gebruikt om dit proces te evalueren. Fagocytose is een vorm van endocytose waarbij deeltjes groter dan 0,5 micrometer worden opgenomen. Dit proces wordt onderzocht door middel van procedures met FITC-DX70 en FITC-Eschericia coli. DX40 en DX70 hebben een molecuulgewicht van respectievelijk 40.000 en 70.000. FITC-E. coli is de standaard laboratoriumstam van E. coli gebonden aan een fluor die kan worden gemeten met de flowcytometer. Veel vormen van de receptorgemedieerde endocytose vereisen calcium als signaalmolecuul en voor cytoskeletale herschikking⁹. Een ander type receptorgemedieerde endocytose is mannosereceptor (MR) gemedieerde endocytose. Mannosereceptoren zijn transmembraaneiwitten die vormen van mannan op microbiële celoppervlakken herkennen⁹. Om deze procedures te optimaliseren, moet bij elk toxine een dosis-responscurve worden gemaakt om de te gebruiken doses vast te stellen. Er moet een verzadigingscurve worden uitgevoerd voor LY, FITC-DX40, FITC-DX70 en FITC-E. coli om de juiste te gebruiken concentratie te beoordelen.

De mechanismen die door leukocyten worden gebruikt om verschillende deeltjes te internaliseren, kunnen variëren. Om te suggereren welk onderdeel van het proces kan worden beïnvloed door blootstelling aan toxines, kunnen remmers worden toegevoegd om de fagocytische mechanismen te blokkeren. Cytochalasine D (CCD) remt de beweging van microtubuli en dus pinocytose. CCD heeft geen invloed op receptorgemedieerde endocytose¹¹. EDTA blokkeert calcium-afhankelijke receptor-gemedieerde endocytose. Mannan is een natuurlijke ligand voor de MR. Mannan wordt gebruikt als een mannosereceptorremmer om te beoordelen of fagocytose of pinocytose mannosereceptor-gemedieerd is⁹.

Het doel van dit protocol is om de procedures te demonstreren om te bepalen of blootstelling aan toxines het vermogen van fagocytaire leukocyten om pathogenen op te nemen heeft beïnvloed. Deze protocollen kunnen ook bepalen of een specifiek endocytisch mechanisme wordt aangetast. Het uitvoeren van deze tests op de flowcytometer maakt verdere discriminatie mogelijk door leukocytenpopulaties te selecteren op basis van grootte en cytoplasmatische granulariteit om te bepalen of leukocytensubpopulaties differentieel zijn aangetast. Deze methode is gebaseerd op elektronische gating van celpopulaties.

Protocol

Dit protocol is goedgekeurd door de Mississippi State University Institutional Animal Care and Use Committee (MSU-IACUC). Alle zebravissen die in deze studie werden gebruikt, werden gekweekt uit een homozygote kolonie van rag1^-/- mutante zebravissen die eerder waren gevestigd in de specifieke pathogeenvrije broederij in het College of Veterinary Medicine, Mississippi State University (MSU)¹⁰. In deze broederij werden ook wildtype zebravissen vermeerderd. In deze onderzoeken kan blootstelling aan toxines in vivo of in vitro worden uitgevoerd. In vivo studies stellen de zebravis bloot aan het toxine, waarna de leukocyten worden geïsoleerd, wat aangeeft hoe het toxine en de micro-omgeving van het weefsel op elkaar kunnen inwerken en de leukocytenfunctie kunnen beïnvloeden. De in vitro studies isoleren de leukocyten en stellen de cellen vervolgens bloot aan het toxine in kweekputten.

1. Bereiding van reagens en oplossing

1. Fluorescerende geactiveerde cellen sorteren (FACS) buffer: (Hanks uitgebalanceerde zoutoplossing zonder calcium of magnesium (HBSS) + 0,05% runderserumalbumine (BSA)) (zie materiaaltabel). Bereid dit vers voor celisolatie.
2. Weefselkweekmedia (TCM): Gebruik RPMI-1640 aangevuld met glutamax en 10% foetaal runderserum (zie materiaaltabel).
3. Cytochalasine D (CCD): Bereid de stockoplossing voor door het in de handel verkrijgbare product (zie materiaaltabel) opnieuw te suspenderen in 1 ml 200 proof absolute ethanol. Bereid de werkoplossing voor door 20 μL voorraad CCD toe te voegen aan 980 μL FACS-buffer, om de uiteindelijke concentratie 2,5 μg/ml te krijgen.
4. EDTA: De voorraadoplossing is 1 mg/ml. Bereid de werkoplossing voor door 100 μl van de stockoplossing toe te voegen aan 900 μl FACS-buffer, om de uiteindelijke concentratie 1 mM te krijgen.
5. Bereiding: Bereid een stockoplossing van 1 mg/ml (zie Materiaaltabel). Bereid vervolgens de werkoplossing voor door 100 μL van de stockoplossing toe te voegen aan 900 μL FACS-buffer, om de uiteindelijke concentratie 500 μg/ml te krijgen.
6. Bereid Lucifer Yellow (10 μg/ml) (LY, een fluorescerende kleurstof), Dextran-40 (DX-40, 500 μg/ml) en Dextran-70 (DX-70, 500 μg/ml) afzonderlijk voor door van elk een oplossing van 1 mg/ml te maken door de in de handel verkrijgbare reagentia (zie materiaaltabel) opnieuw te suspenderen in steriel water.
7. Fluoresceïne (FITC) bacteriën: Kweek Escherichia coli DH5α (zie materiaaltabel) door te schudden in 100 ml Luria Bertani (LB) media aangevuld met 50 μg/ml FITC 's nachts bij 37 °C in een lichtbeschermde omgeving om een optische dichtheid (OD) van 0,8 bij 540 nm te krijgen.
   1. Spoel bacteriën (3x) met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) door 10 minuten te centrifugeren op 1000 x g gevolgd door verhitting op 60 °C gedurende 20 min. Was nog 1 keer en pas vervolgens de bacterieconcentraties aan op OD₅₄₀ 0,8. Dit wordt de standaardoplossing.
   2. Bereid de werkoplossing voor door een verdunning van de stamoplossing 1:100 te maken (1 ml bouillon: 99 ml FACS-buffer). Pas de uiteindelijke concentratie aan op 1,8 x 10⁸ cellen/ml.

2. Verzorging van zebravissen

1. Houd de zebravis in een single-pass doorstroomsysteem op gedechloreerd gemeentelijk water en voer eiwitrijk vismeel en levende Artemia tot verzadiging.
2. Als ze 6 maanden oud zijn, haal je zebravissen van gemengd geslacht uit hun aquarium en vervoer je ze naar het onderzoekslaboratorium voor gebruik in het experiment. Dit is de beste leeftijd om te gebruiken voor de isolatie van een optimaal aantal leukocyten uit het niermerg⁹.

3. Cel isolatie

1. Euthanaseer 10 zebravissen in tricaïne (~100 ml 4 mg/ml fosfaatgebufferd tricaïnemethaansulfonaat/liter viswater) (zie materiaaltabel) volgens gevestigde methoden⁹.
2. Plaats een celzeef van 40 μm in een conische centrifugebuis van 50 ml.
3. Verwijder het niermergweefsel⁹ en plaats ze in een C-buis met 3 ml weefselkweekmedia en homogeniseer het weefsel met behulp van een weefseldissociator. Dit is de voorkeursprocedure.
4. U kunt de weefsels ook verstoren met het rubberen uiteinde van een spuit van 3 ml in een celzeef. Nadat het weefsel is gehomogeniseerd (of verstoord), giet u de suspensie door een celzeef van 40 μm die bovenop een conische buis van 50 ml is geplaatst.
5. Centrifugeer de gefilterde suspensie bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 16 °C. Giet het bovenstaande af. Resuspendeer de cellen in 3 ml TCM. Herhaal deze stap twee keer.
6. Breng de cellen voorzichtig aan op een steriel gefilterd medium met dichtheidsgradiënt van 3 ml (1,077 g/ml) bij kamertemperatuur.
7. Centrifugeer vervolgens 20 minuten bij 800 x g bij 16 °C. Zorg ervoor dat de rem op de laagste stand staat, zodat de cellen niet opnieuw worden gesuspendeerd wanneer de centrifuge stopt.
8. Verwijder de ondoorzichtige buffy-laag van de interface naar een ronde bodembuis van 14 ml.
9. Was de cellen door 5 ml TCM toe te voegen en te mengen met een pasteurpipet. Centrifugeren bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 16 °C.
10. Herhaal de stap, gooi het bovenstaande weg en suspendeer de celpellet opnieuw in TCM om ongeveer 1 x 10⁶ cellen/ml te verkrijgen.

4. Test van de levensvatbaarheid van cellen

1. Om de levensvatbaarheid van de cellen te controleren, evalueert u de celdood met behulp van propidiumjodide (PI)-kleuring.
   1. Voeg PI (200 μg/ml) toe in een concentratie van 5 μl/ml van de te analyseren cellen. Lees op het PE/Texas Red-kanaal.
      OPMERKING: Propidiumjodide diffundeert door de gaten in de membranen van dode cellen, waardoor ze worden gekleurd. De geëvalueerde levensvatbaarheid was 85% voor de huidige studie.

5. Incubatie van toxines

1. Aliquot 200 μL cellen uit de geïsoleerde celsuspensie in elk putje van een weefselkweekplaat met 6 putjes (3 putjes voor controle en 3 putjes voor blootstelling aan toxines). Hierdoor kunnen replicaten in drievoud worden uitgevoerd.
2. Voeg 2 ml TCM toe aan elk putje.
3. Voeg toxine (~2,5 μg/ml) toe aan de drie putjes.
   OPMERKING: De toxineconcentratie moet worden geoptimaliseerd voordat met het experiment wordt begonnen en is afhankelijk van het toxine dat voor de test wordt gebruikt.
4. Incubeer de weefselkweekplaat voor de gewenste belichtingstijd. De gewenste belichtingstijd moet worden geoptimaliseerd voordat met het experiment wordt begonnen en is afhankelijk van het toxine dat voor de test wordt gebruikt. In de huidige studie was de belichtingstijd ~1 uur.
5. Plaats na de blootstellingstijd de weefselkweekplaat gedurende 10 minuten op ijs.
6. Pipetteer de cellen in elk putje voorzichtig op en neer om eventuele aanhangende cellen van de plaat te verwijderen.
7. Verwijder de cellen van de plaat in een centrifugebuis van 14 ml met ronde bodem.
8. Centrifugeer de cellen bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 16 °C. Resuspendeer cellen in 3 ml FACS-buffer. Herhaal de stap twee keer.
9. Resuspendeer de cellen in 1,5 ml FACS-buffer.
   OPMERKING: Stel voor de in vivo onderzoeken de zebravis bloot aan het toxine (in een vergelijkbare concentratie als hierboven vermeld) en isoleer vervolgens de cellen.

6. Endocytose-test

1. Aliquot 100 μL cellen op 5 ml flowcytometriebuisjes. Label de buisjes als volgt met vier replicate buisjes uit elk putje: (1) LY, (2) DX40, (3) DX70, (4) FITC-E. coli.
2. Voeg fluorescentiekleurstof zoals vermeld in stap 1.6 en stap 1.7 toe aan de juiste buisjes: 50 μL LY op buis (1), 50 μL DX40 op buis (2); 50 μL DX70 naar buis (3); 50 μL FITC-E. coli naar buis (4).
3. Incubeer gedurende 1 uur. Voeg 200 μL FACS-buffer toe aan elke buis.
4. Centrifugeer de cellen bij 400 x g gedurende 5 minuten bij 16 °C. Giet het bovenstaande af en suspendeer de cellen opnieuw in 200 μl FACS-buffer. Herhaal deze stap drie keer. Voer de flowcytometrische analyse uit.

7. Flowcytometrie

1. Voer flowcytometrie uit om de celpopulaties te visualiseren en gegevens te verzamelen. Zie Hohn et ^al.9 voor details.
2. Identificeer de doelcelpopulaties bij de eerste stap. Gebruik zijverstrooiing (SSC) (meestal de verticale as) om puin en kleine, pycnotische cellen aan de uiterst linkse kant te verwijderen en voorwaartse verstrooiing (FSC) (meestal de horizontale as) om hetzelfde puin op de onderkant van de grafiek te verwijderen.
3. Elimineer de doubletlezingen (cellen die twee keer worden geteld). Dit wordt uitgevoerd met behulp van een pulsgeometriepoort (FSC-H x FSC-A).
4. Bepaal het achtergrondsignaal. Voer cellen alleen fluorescentiecontrole en een isotype fluorescentiecontrole uit voor elk fluorchroom dat wordt gebruikt, om achtergrondfluorescentieniveaus te identificeren.
   OPMERKING: Elk fluorochroom heeft zijn eigen unieke niveau van achtergrondfluorescentie, beïnvloed door autofluorescentie van cellen en niet-specifieke binding. Hierbij wordt onderscheid gemaakt tussen echte positieve signalen en achtergrondfluorescentie. Bij het identificeren en afschermen van celpopulaties op basis van fluorescentie, worden deze controlewaarden afgetrokken van het aantal positieve gebeurtenissen, en het resulterende aantal is het aantal dat wordt gebruikt voor analyse.
5. Voer de monsters uit en identificeer de celpopulaties die moeten worden afgeschermd. Gebruik FSC en SSC om verschillende celpopulaties binnen een mengsel van cellen morfologisch te karakteriseren en te identificeren.
   LET OP: FSC heeft voornamelijk te maken met de grootte van de cel. Grotere cellen zullen meer licht in voorwaartse richting verstrooien, wat resulteert in hogere FSC-waarden, terwijl kleinere cellen minder licht verstrooien en lagere FSC-waarden hebben. Cellen van verschillende groottes worden gegroepeerd in clusters. Lymfocyten, die kleiner zijn, kunnen bijvoorbeeld verschijnen als een afzonderlijke cluster met lagere FSC-waarden in vergelijking met granulocyten. SSC is gerelateerd aan de granulariteit, complexiteit en interne structuur van de cel. Cellen met meer cytoplasmatische granulariteit zullen hogere SSC-waarden hebben. Vergelijkbare cellen zullen samenklonteren. Neutrofielen hebben bijvoorbeeld cytoplasmatische korrels en zullen clusteren op een hogere SSC-waarde dan lymfocyten.
6. Voer alle monsters uit en pas op basis van FSC/SSC poorten toe op celpopulaties die verder moeten worden geanalyseerd. Gated areas worden toegepast op basis van celdichtheid en interessepopulaties.
7. Teken omheinde gebieden uit op histogrammen om de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) van FITC in elke poort te analyseren voor fluorescentie bij 495 nm / 519 nm met de blauwe laser.
8. Het aantal exportcellen zoals bepaald door de software om uit te blinken in het analyseprogramma.
9. Analyseer de gegevens in een statistisch softwarepakket (zie Materiaaltabel).
10. Vergelijk MFI van elke populatie controlecellen met MFI van celpopulaties die zijn blootgesteld aan toxine.

8. Effect van toxine op endocytische mechanismen en effecten van remmers CCD, EDTA en mannan op endocytische mechanismen

OPMERKING: Om vloeistoffen of deeltjes op te nemen, beweegt het celcytoplasma actief. Deze beweging vereist meerdere structurele elementen en signaalroutes. Biotoxinen kunnen elk van deze elementen of routes aantasten. Het vergelijken van de effecten van specifieke gekarakteriseerde remmers kan worden gebruikt om te helpen bij het onderscheiden van hoe het biotoxine kan werken¹¹.

1. Voer celisolaties uit zoals beschreven in stap 3.
2. Aliquot 100 μL cellen op 5 ml flowcytometriebuisjes (met vier duplicaatbuisjes uit elk putje).
   OPMERKING: Label de buisjes als volgt: (5) CCD + LY (CCD remt pinocytose door de herschikking van microfilamenten en microtubuli te remmen; LY wordt gebruikt om de vloeistofopname te beoordelen door middel van micropinocytose)⁹. (6) EDTA + DX40 (EDTA blokkeert Ca²⁺ -afhankelijke receptorgemedieerde fagocytose en micropinocytose; meten of opname een calciumafhankelijk mechanisme omvat). (7) EDTA + DX70. (8) EDTA + FITC-E. coli. (9) Mannan + DX40 (mannan remt de specifieke opname door de mannosereceptor, waardoor de MR-afhankelijke endocytose⁹ wordt gemeten). (10) Mannan + DX70. (11) Mannan + FITC-E. coli.
3. Voeg remmers toe: 1 μL CCD aan de buis (5); 10 μL EDTA naar buisjes (6-8); 100 μL mannan op buisjes (9-11). Volg de concentraties zoals vermeld in stap 1. Incubeer gedurende 5 minuten.
4. Voeg fluorescerende secundaire buis toe aan de juiste buizen: 50 μL LY aan buis (1) en (5); 50 μL DX40 naar buis (2), (6) en (9); 50 μL DX70 naar buis (3), (7) en (10); 50 μL FITC-E. coli op buis (4), (8) en (11). Incubeer gedurende 30 minuten.
5. Voeg 200 μL FACS-buffer toe aan elke buis. Centrifugeer bij 400 x g bij 16 °C gedurende 5 min.
6. Giet het bovenstaande af en suspendeer de cellen opnieuw in 200 μl FACS-buffer. Herhaal stap 8.5-8.6 twee keer.
7. Voer de monsters uit op de flowcytometer volgens stap 7.

Resultaten

Endocytose-assays gebruiken gemengde leukocyten geïsoleerd uit gradiënten en afgeschermd voor fagocyten en lymfocyten om te bepalen of specifieke cellulaire mechanismen zijn veranderd door blootstelling aan toxines. Ten eerste worden cellen afgeschermd op basis van grootte en granulariteit¹⁰. Dode, gefragmenteerde of stervende cellen worden gevisualiseerd in de linkerbenedenhoek van het spreidingsdiagram en worden geëlimineerd, niet geanalyseerd op fagocytose. De fagocytenpoort omvat macrofagen, Natural Killer (NK-cellen) en granulocyten, terwijl de lymfocytenpoort lymfocyten, fagocytaire B-cellen en niet-specifieke cytotoxische cellen (NCC's) omvat (Figuur 1).

Fagocytose wordt bepaald door de opname van FITC-gelabelde deeltjes, zoals blijkt uit het aflezen van de fluorescentie bij 495 nm / 519 nm met de blauwe laser. Achtergrondautofluorescentie en niet-specifieke bindingsfluorescentie worden geëlimineerd door rekening te houden met de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) die wordt uitgezonden door de controlecellen en de isotypecontrole. Met elke remmer moet een dosis-responscurve worden uitgevoerd om de te gebruiken concentraties vast te stellen. Als de flowcytometrieresultaten van cellen die zijn blootgesteld aan het toxine dat wordt getest, hetzelfde zijn als de resultaten van cellen die zijn blootgesteld aan een remmer, dan veroorzaakt het toxine een soortgelijk effect en kan het dat endocytische mechanisme remmen. Als de reacties van het toxine en de remmer additief zijn, suggereert dit dat het toxine endocytose kan remmen door een ander mechanisme dan de remmer.

Er worden vergelijkingen gemaakt tussen cellen die niet zijn behandeld en cellen die zijn behandeld met het toxine dat wordt getest (Figuur 2), cellen die zijn behandeld met toxine of remmer (Figuur 3A) en cellen die alleen met de remmer zijn behandeld (Figuur 3B). De representatieve resultaten tonen aan dat cellen die met microcystine werden behandeld, werden geremd, vergelijkbaar met cellen die met CCD werden behandeld. Deze resultaten tonen aan dat microcystine de opname van vloeistof remde door micropinocytose. Gated cellen worden geanalyseerd door middel van eenrichtings-ANOVA en de resultaten moeten worden gerapporteerd als het gemiddelde aantal cellen dat positief is voor FITC.

Figuur 1: Representatieve flowcytometrie scatterplot van leukocyten geïsoleerd uit wildtype zebravisnierweefsel op basis van forward scatter (FSC) en side scatter (SSC) kenmerken. De fagocytenpoort omvat macrofagen/monocyten en granulocyten (23% van de gated cells). De lymfocytenpoort omvat lymfocyten, fagocytaire B-cellen en niet-specifieke cytotoxische cellen (NCC's) (26% van de gated cellen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) van fagocytische cellen afgeschermd in figuur 1 na blootstelling aan toxine. Buis (1) vertoont ongekleurde cellen, terwijl cellen in buis (2) fluorescentie uitzenden door de opname van LY. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) van fagocyten in figuur 1. Opname van Lucifer geel (LY) zonder de aanwezigheid van cytochalasine D (CCD)-remmer (A); opname van LY met de aanwezigheid van CCD. Buis (1) toont ongekleurde cellen, terwijl cellen in buis (2) fluorescentie uitzenden door de opname van LY. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Overzicht van de stappen van het protocol. *De duur en mate waarin de vissen worden blootgesteld aan een biotoxine is afhankelijk van het specifieke biotoxine dat wordt gebruikt en de voorschriften en protocollen voor dierenverzorging en bioveiligheid van verschillende instellingen. **De gebruikte gewenste concentratie en de gebruikte belichtingstijd moeten voorafgaand aan het experiment worden geoptimaliseerd en zijn afhankelijk van het gebruikte toxine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Het gebruik van flowcytometrie met zebravisleukocyten biedt een krachtige en veelzijdige benadering voor het in detail bestuderen van het immuunsysteem, het beoordelen van de impact van milieutoxines en het faciliteren van toxicologisch onderzoek. Het biedt een manier om snel en effectief de impact van toxines op immuuncellen en de immuunrespons te evalueren. De resultaten onthullen humorale factoren die een rol spelen en suggereren hoe de fysiologie en het metabolisme van de vis interageren met biotoxines uit de omgeving. Het overzicht van het protocol is weergegeven in figuur 4.

Er zijn echter beperkingen aan deze methoden. Het voorbereiden van zebravisleukocyten voor flowcytometrie kan complexer zijn in vergelijking met andere modellen. Het kleine formaat van zebravissen kan de hoeveelheid bloed en het aantal leukocyten dat beschikbaar is voor analyse beperken^{tot 9,10}. Deze procedures vereisen dissociëring van weefsels om eencellige suspensies te verkrijgen, en de levensvatbaarheid van cellen kan de nauwkeurigheid van de resultaten beïnvloeden. Vergeleken met modellen zoals muizen is het bereik van beschikbare immunologische hulpmiddelen, zoals antilichamen die specifiek zijn voor zebraviscelmarkers, beperkter voor zebravissen. Deze beperking kan de diepte van de analyse beperken die kan worden uitgevoerd op zebravisleukocyten. Bovendien vereist de interpretatie van flowcytometriegegevens expertise, vooral bij het omgaan met complexe immuunresponsen. Verkeerde interpretatie van gegevens kan leiden tot onjuiste conclusies, vooral in de context van de effecten van milieutoxines.

Resultaten van celmonsters waaraan geen remmers zijn toegevoegd, kunnen worden vergeleken met celmonsters met de remmers. De resultaten van celmonsters waaraan het toxine is toegevoegd, moeten worden vergeleken met celmonsters met de remmers. Als de herschikking van het cytoskelet is beïnvloed, zal er een beperkte opname van LY zijn. Als het toxine de opname van DX-40 of DX-70 remt, worden verschillende deeltjesgroottes niet gefagocyteerd. Als de cellen de FITC-E. coli niet opnemen, heeft het toxine de fagocytose geremd.

Samenvattend dienen zebravissen als een uitstekend model voor het bestuderen van de effecten van milieutoxines op immuuncellen. Dit protocol schetst een methode waarbij gebruik wordt gemaakt van flowcytometrie en zebravisleukocyten om biotoxines te screenen, met bijzondere aandacht voor endocytose- en fagocytoseprocessen¹¹. Het doel van deze studie is om na te gaan of blootstelling aan toxines het vermogen van fagocytische leukocyten om pathogenen op te nemen beïnvloedt en om mogelijke effecten op specifieke endocytische mechanismen te onderscheiden.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
10% foetaal bovien serum	Gibco	A3160501
14 mL centrifugebuisjes met ronde bodem	BD Biosciences	352059
40 µm celzevener	Corning	07-201-430
5 mL flow cytometry buisjes	BD Biosciences	352235
50 mL conische centrifugebuis	Corning	14-959-49A
Absoluut ethanol	Fisher	BP2818-500
Automatische celteller	Life Technologies Countess II FL		voor het bestuderen van celviabiliteit
Bovine serum albumine (BSA)	Sigma	A3059
cytochalasine D (CCD)	Sigma	C8273-5MG
Dextran 40	Sigma	FD40-100MG
Dextran 70	Sigma	46945-100MG-F
Escherichia coli DH5α (of andere laboratoriumbacteriestam)	New England Biolabs	C29871
Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)	Sigma	ED4SS
Flow analyse software	Novoacea software
Flow cytometer	Novocyte 3000
Fluoresceïne	Fluka BioChemica	46950
Hanks balanced salt solution zonder calcium of magnesium	Sigma	H4891
Histopaque 1077	Sigma	10771-100ML
Lucifer Geel	Sigma	L0259-25MG
Manaan	Sigma	M7504-250MG
Fosfaat gebufferde saline	Sigma	P3813
RPMI-1640 met GlutaMax	Gibco	61870036
Statistisch software	SPSS
Toxin
Tricaine	Western Chemical Inc	NC0342409